CN105769860A

CN105769860A - 氯美噻唑作为预防和治疗肝脏及食管疾病药物的应用

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Publication number: CN105769860A
Application number: CN201610238196.7A
Authority: CN
Inventors: 乔海灵; 高洁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2016-04-18
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明发现了氯美噻唑（Clomethiazole,CMZ）的一种新用途，即本发明经过研究发现：CMZ对人体细胞色素P4502E1（CYP2E1）代谢亚硝胺类化合物二甲基亚硝胺（Dimethylnitrosamine,DMN）和二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）具有抑制作用，因此，氯美噻唑可以作为预防和治疗肝脏疾病（如肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等）及食管疾病（贲门痉挛症、食道裂孔疝、食道憩室、食道息肉与***状瘤、食管癌等）的药物使用。

Description

氯美噻唑作为预防和治疗肝脏及食管疾病药物的应用

技术领域

本发明具体涉及一种氯美噻唑作为预防和治疗肝脏及食管疾病药物的应用。

背景技术

目前，癌症是严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。癌症、心脑血管疾病和意外事故是当今世界所有国家人口三大死亡原因。因此，世界卫生组织和各国政府***门都把攻克癌症列为一项首要任务。世界上治疗癌症的方法主要有三种：一是采用手术切除法，切除病变组织，防止癌细胞扩散；二是采用放疗法，以杀死癌细胞；三是采用药物治疗法，即化疗，杀死或抑制癌细胞。采用手术切除法治疗，增加患者的痛苦，伤其元气，且费用巨大。采用化疗或放疗的方法，在杀死癌细胞的同时，也伤及患者的正常细胞，如红细胞和白细胞。

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，它具有恶性度高、进展快、侵袭性强、预后差和死亡率高等特点。根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。新近数据显示：我国肝癌患者数量约占全世界患者总数的55%，每年引起约11万人死亡，死亡率位居恶性肿瘤前列。临床上肝癌发现时大多在中晚期，已错过最佳治疗时机，至今尚缺乏有效的治疗方法及药物，预后较差。因此，加强原发性肝癌治疗的研究，延长患者生存期，提高疗效，改善患者生活质量是临床肿瘤工作者的当务之急。

肝癌主要治疗手段为手术切除，早期术后1年、3年及5年生存率分别为80%～92%、61%～86%和41%～75%。但90%患者因肿瘤较大或肝硬化而失去手术机会。若采用放疗法，正常肝脏细胞对放射线敏感，而肝癌细胞敏感性较差，需＞4000cGy才可能得到一定的局部控制。局部消融疗法可以起到局部控制肿瘤、缓解症状等作用，可作为不能接受手术切除患者的治疗方案，但此疗法仅对肿瘤小于5cm的肝癌有效。目前的化学药物治疗对肝癌的部分缓解率均在20%以下，疗效不理想。生物靶向治疗对原发性肝癌治疗的有效率均低于10%。

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。我国在20世纪50年代末就开始了食管癌防治的研究，在高发区农村建立防治研究点，以求早期发现、早期治疗，提高治愈率。

目前外科手术治疗是食管癌治疗中最重要的手段，是食管癌首选和最有效的治疗方法。虽然手术可以显著延长生命甚至长期生存；同时能够切除肿瘤，解除进食梗阻，恢复正常饮食，但早期食管癌手术后5年生存率仅达70％～90%。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种氯美噻唑作为预防和治疗肝脏疾病及食管疾病药物的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

氯美噻唑作为预防和治疗肝脏疾病及食管疾病药物的应用。具体的，所述的肝脏疾病包括肝炎、肝纤维化、肝硬化或肝癌等，所述的食管疾病包括贲门痉挛症、食道裂孔疝、食道憩室、食道息肉与***状瘤或食管癌等。

氯美噻唑（CMZ）具有镇静、催眠、抗惊厥作用。目前多适用于治疗精神焦虑性失眠或老年性失眠，亦可用于治疗酒精或药物成瘾的急性戒断症状。静注用为癫痫状态和子痫前期毒血症的催眠剂和抗惊厥剂。

亚硝胺类化合物作为前致癌物，在体内需经过肝脏CYP2E1代谢活化生成致癌物质。如二甲基亚硝胺（DMN）和二乙基亚硝胺（DEN）经CYP2E1代谢活化后，一方面生成的甲醛和乙醛可与DNA形成稳定的加合物或与蛋白质交联，最终导致基因突变和DNA的断裂；另一方面生成的烷基化合物作为烷化剂，可使DNA和RNA分子中的鸟嘌呤发生烷基化，使DNA、RNA复制错误，从而引起肿瘤。但研究发现同一地区包括肝癌高发区，在DMN和DEN日常暴露量相同的情况下，不同个体患肝癌的风险不同，即不同个体在接触相同暴露量亚硝胺类化合物的情况下，经CYP2E1代谢活化生成的致癌物的量不同，这提示亚硝胺类化合物致肝癌或食管癌的易感性可能与CYP2E1的代谢活性有关。若CYP2E1的活性被抑制，其代谢亚硝胺类产生致癌物的量降低，肝癌或食管癌发生率就会下降。

本发明经试验研究发现：氯美噻唑（CMZ）可以抑制CYP2E1代谢亚硝胺类的活性，因此CMZ可作为肝癌及食管癌治疗的药物，即本发明发现了CMZ可作为肝癌及食管癌治疗药物的一种新用途。

附图说明

图1为肝癌病人肝硬化肝和正常人肝对DMN和DEN代谢活性的比较；图中，Normal：正常组，n=83；HCC：肝癌肝硬化组，n=93；DMN：二甲基亚硝胺；DEN：二乙基亚硝胺；CL_int固有清除率；

图2为CMZ对人肝微粒体CYP2E1代谢DMN的体外抑制作用，（A）CMZ对人肝微粒体CYP2E1代谢DMN抑制作用的双倒数图，DMN的浓度分别为7.5、15、30、60和120μM，CMZ的浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μM，（B）采用双倒数图的斜率与CMZ的浓度二次作图；图中，CMZ：氯美噻唑；DMN：二甲基亚硝胺；V：转化速率；Ki：抑制常数；

图3为CMZ对人肝微粒体CYP2E1代谢DEN的体外抑制作用，（A）CMZ对人肝微粒体CYP2E1代谢DEN抑制作用的双倒数图，DMN的浓度分别为7.5、15、30、60和120μM，CMZ的浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μM，（B）采用双倒数图的斜率与CMZ的浓度二次作图；图中，CMZ：氯美噻唑；DEN：二乙基亚硝胺；V：转化速率；Ki：抑制常数；

图4为第12周不同组别大鼠的肝组织病理切片；

图5为第18周不同组别大鼠的肝组织病理切片。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

1．人肝标本收集

1.1正常人肝

83例正常人肝标本为临床确诊的肝血管瘤、胆结石、肝囊腺瘤、胆囊癌患者手术切除的瘤旁正常肝组织，正常的肝组织是指通过肝功能检查、肝影像学检查和肝组织病理学检查均正常的健康肝。手术切除后迅速置于液氮中保存。

1.2肝癌病人肝硬化肝

93例肝癌病人肝硬化肝标本为临床确诊的HBV和/或HCV表面抗原阳性合并肝硬化的原发性肝癌患者手术切除的距瘤旁>2cm的肝硬化组织，为确保获得肝癌患者肝硬化组织，肝脏来源应经病理学检查纤维化分级达S4级即肝硬化级别。手术切除后迅速置于液氮中保存。

2.肝微粒体制备

采用差速离心法，制备人肝微粒体。肝标本取出解冻，称重。按1:4（W/V）比例，加入50mMTris-HCl(pH7.0)（含150mMKCl，2mMEDTA）缓冲液，用玻璃匀浆器研磨制成肝匀浆。于4℃9000×g离心20min，取上清液于4℃100000×g离心60min；所得沉淀重悬于4ml0.15MTris-HCl（pH7.6）中，于4℃100000×g再离心60min；取沉淀按1:2（W/V）比例加入0.25M蔗糖重悬液，最终每克肝组织制备2ml微粒体混悬液，分装后先保存于液氮中过夜，次日转移至-80℃长期保存备用。以上所有操作均在冰浴中进行。用Bradford方法测定微粒体蛋白含量(mg/ml)。

3．人肝微粒体CYP2E1代谢活性

选用二甲基亚硝胺（DMN）和二乙基亚硝胺（DEN）作为底物，分别检测83例正常人肝和93例肝癌病人肝硬化肝微粒体CYP2E1的代谢活性。

3.1CYP2E1对DMN的代谢

底物：DMN；

代谢产物：2,4-二硝基苯肼甲醛腙；

色谱条件：色谱柱为DiamondC18柱，（5μm，46mm×200mm），流动相为甲醇：水（70：30），流速为1ml·min^-1，UV检测波长356nm。

样品处理：孵育体系总体积为100μl，包括不同浓度的DMN、肝微粒体蛋白（终浓度0.3mg·ml^-1），磷酸盐缓冲液（终浓度100mM，pH7.4），MgCl₂（终浓度5mM），EDTA（终浓度0.1mM）。预孵育5min，加入NADPH启动反应，37℃孵育20min，放入冰水中终止反应，加入1ml二氯甲烷，涡旋混合3min，4500rpm离心10min，吸取下层有机相0.8ml，于40℃氮气吹干，100μl流动相复溶，取10μl进样。

标准曲线：于孵育体系中加入系列浓度的甲醛溶液10μl，终浓度分别为2500、1250、625、312.5、156、78、39和18μM，再加入过量的2,4-二硝苯腈溶液，60℃，孵育20min，按“样品处理”项操作（不加NADPH）。以样品峰面积（A）为横坐标，样品浓度（C）为纵坐标求其回归方程。

最适蛋白浓度的确定：反应体系中加入微粒体蛋白，其浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4及0.5mg·ml^-1，37℃水浴分别孵育20min。考察微粒体蛋白浓度对DMN代谢的影响。

最适反应时间的确定:反应体系（蛋白浓度0.3mg·ml^-1）中加入NADPH启动反应，于37℃水浴分别孵育5、10、20、30及40min，考察孵育时间对DMN代谢的影响。

人肝微粒体CYP酶动力学参数的测定:反应体系中底物DMN的浓度为18～2500μM，以代谢产物的生物转化程度（TR）为反应速度，计算K_m和V_max。TR（pmol·min^-1·mg^-1）=（△C×1000）/（B×T），其中△C为代谢产物2,4-二硝基苯肼甲醛腙的浓度（μM），B为微粒体蛋白的浓度（mg·ml^-1），T为孵育时间（min）；

采用上述检测条件，测定人肝CYP2E1代谢DMN的固有清除率。

3.2CYP2E1对DEN的代谢

底物：DEN；

代谢产物：2,4-二硝基苯肼乙醛腙；

色谱条件：色谱柱为DiamondC18柱，（5μm，46mm×200mm），流动相为甲醇：水（60：40），流速为1ml·min^-1，UV检测波长356nm。

样品处理：孵育体系总体积为100μl，包括不同浓度的DEN、肝微粒体蛋白（终浓度0.3mg·ml^-1），磷酸盐缓冲液（终浓度100mM，pH7.4），MgCl₂（终浓度5mM），EDTA（终浓度0.1mM）。预孵育5min，加入NADPH启动反应，37℃孵育20min，放入冰水中终止反应，加入1ml二氯甲烷，涡旋混合3min，4500rpm离心10min，吸取下层有机相0.8ml，于40℃氮气吹干，100μl流动相复溶，取10μl进样。

标准曲线：于孵育体系中加入系列浓度的甲醛溶液10μl，终浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56和0.78μM，再加入过量的2,4-二硝苯腈溶液，60℃孵育20min，按“样品处理”项操作（不加NADPH）。以样品峰面积（A）为横坐标，样品浓度（C）为纵坐标求其回归方程。

最适蛋白浓度的确定：反应体系中加入微粒体蛋白，其浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4及0.5mg·ml^-1，37℃水浴分别孵育20min。考察微粒体蛋白浓度对DEN代谢的影响。

最适反应时间的确定:反应体系（蛋白浓度0.3mg·ml^-1）中加入NADPH启动反应，于37℃水浴分别孵育5、10、20、30及40min，考察孵育时间对DEN代谢的影响。

人肝微粒体CYP酶动力学参数的测定:反应体系中底物DEN的浓度为0.78～100μM，以代谢产物的生物转化程度（TR）为反应速度，计算K_m和V_max。TR（pmol·min^-1·mg^-1）=（△C×1000）/（B×T），其中△C为代谢产物2,4-二硝基苯肼乙醛腙的浓度（μM），B为微粒体蛋白的浓度（mg·ml^-1），T为孵育时间（min）；

采用上述检测条件，测定人肝CYP2E1代谢DEN的固有清除率。

4．肝癌病人肝硬化肝CYP2E1代谢活性变化

对正常人肝和肝癌病人肝硬化肝CYP2E1对DMN和DEN的代谢活性进行统计分析，结果见图1。由图1的结果可以看出：肝癌病人肝硬化肝对DMN和DEN的代谢活性均显著高于正常人肝。

5．CMZ对人肝微粒体CYP2E1代谢亚硝胺类化合物的抑制作用

5.1CMZ对DMN的抑制作用

随机取12例肝癌病人肝硬化肝微粒体混合（终浓度0.3mg·ml^-1），于混合肝微粒体中加入系列浓度的DMN（终浓度分别为7.5、15、30、60和120μM）10μl，系列浓度的CMZ（终浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μM）10μl，磷酸盐缓冲液（终浓度100mM，pH7.4），MgCl₂（终浓度5mM），EDTA（终浓度0.1mM）。预孵育5min，加入NADPH启动反应，37℃孵育20min，放入冰水中终止反应，加入1ml二氯甲烷，涡旋混合3min，4500rpm离心10min，吸取下层有机相0.8ml，于40℃氮气吹干，100μl流动相复溶，取10μl进样。

采用上述4.1项的检测方法测定2,4-二硝基苯肼甲醛腙的浓度，双倒数作图法确定CMZ对CYP2E1代谢DMN的抑制作用，结果见图2。从图2可以看出CMZ对人肝微粒体代谢DMN存在较强的抑制作用。

5.2CMZ对DEN的抑制作用

随机取12例肝癌病人肝硬化肝微粒体混合（终浓度0.3mg·ml^-1），于混合肝微粒体中加入系列浓度的DEN（终浓度分别为7.5、15、30、60和120μM）10μl，系列浓度的CMZ（终浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μM）10μl，磷酸盐缓冲液（终浓度100mM，pH7.4），MgCl₂（终浓度5mM），EDTA（终浓度0.1mM）。预孵育5min，加入NADPH启动反应，37℃孵育20min，放入冰水中终止反应，加入1ml二氯甲烷，涡旋混合3min，4500rpm离心10min，吸取下层有机相0.8ml，于40℃氮气吹干，100μl流动相复溶，取10μl进样。

采用上述4.2项的检测方法测定2,4-二硝基苯肼乙醛腙的浓度，双倒数作图法确定CMZ对CYP2E1代谢DEN的抑制作用，结果见图3。从图3可以看出CMZ对人肝微粒体代谢DEN存在较强的抑制作用。

6．CMZ对抗DEN致大鼠肝癌实验

6.1受试药物和实验动物

约6周龄、体重150g±20g的近交系的、健康雄性SD正常大鼠72只。CMZ(100mg/kg)，DEN（50mg/kg），生理盐水。

6.2肝癌模型建立

采用间断性腹腔注射DEN的方法制备大鼠肝癌动物模型。每只大鼠于第1～4周，每周两次腹腔注射DEN（50mg/kg），第5～12周，每周一次腹腔注射DEN（50mg/kg）。

6.3分组与给药

选择体重相近且健康的大鼠随机分成3组：对照组、模型组、CMZ组(100mg/kg)，每组24只，每只称重记录。模型组和CMZ组，按照上述6.2项的造模方法建立肝癌模型，同时对CMZ组做如下处理：分别于每次DEN给药前12h腹腔注射CMZ(100mg/kg)。

6.4CMZ的抑制肝癌作用

在第12周对每组大鼠处死10只，取其肝脏，进行病理检查；在第18周对每组剩余大鼠全部处死，取其肝脏，进行病理检查。

第12周的病理切片（见图4）显示：对照组大鼠肝组织正常；模型组大鼠已形成肝硬化；CMZ剂量组大鼠肝组织基本正常。

第18周的病理切片（见图5）显示：对照组大鼠肝组织正常；模型组大鼠已形成肝癌；CMZ剂量组大鼠形成较轻的纤维化。

上述的病理检查结果明确显示：CMZ(100mg/kg)呈现出显著的抑制肝癌作用，因此CMZ可作为预防和治疗肝脏疾病的药物。

Claims

1.氯美噻唑作为预防和治疗肝脏疾病或食管疾病药物的应用。

2.如权利要求1所述氯美噻唑作为预防和治疗肝脏疾病药物的应用，其特征在于，所述肝脏疾病为肝炎、肝纤维化、肝硬化或肝癌。

3.如权利要求1所述氯美噻唑作为预防和治疗食管疾病药物的应用，其特征在于，所述食管疾病为贲门痉挛症、食道裂孔疝、食道憩室、食道息肉与***状瘤或食管癌。