CN105764915B - 纯化达依泊汀α的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过从具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α结构同种型的混合物只选择性地分离具有高含量唾液酸的结构同种型而纯化达依泊汀α的方法。由于本发明的方法是纯化达依泊汀α的新方法,达依泊汀α可以方便且简单地产生,所以根据本发明,当大量生产达依泊汀α时,由于工艺效率的提高而显著地增加生产率以及产生高纯度达依泊汀α是可能的。
Description
发明背景
1.发明领域
本发明涉及通过从具有多种含量的唾液酸的达依泊汀(darbepoetin)α结构同种型的混合物只选择性地分离具有高含量唾液酸的结构同种型而纯化达依泊汀α的方法。
2.相关技术的描述
达依泊汀α(NESP)是红细胞生成素(EPO)的类似物,其在红细胞生成素分子的氨基酸序列中具有五个取代基,提供两个另外的N-糖基化链(国际公布号WO 2001076640)。虽然达依泊汀α与EPO在生物化学特性如分子量、等电点等方面不同,但是它像EPO一样也是红细胞生成刺激蛋白。
已知达依泊汀α由于它的高唾液酸含量而具有比在小鼠、大鼠、狗、人等中的红细胞生成素长约三倍的血清半衰期(Pedrazzoli P,Cinieri S,Lorusso V,Gamucci T,Secondino S,Silvestris N 2007 Nov-Dec,27(6C),4419-24;Anticancer Res.),并且因此它的体内分解被抑制,由此提供比在其天然状态的EPO更高的生物活性。
达依泊汀α,由于糖基化引起的唾液酸含量的差异,最大具有22种不同类型的结构同种型,并且唾液酸含量越高,等电点越低,治疗价值越高。因此,仅具有高唾液酸含量的结构同种型的选择性分离和纯化在利用达依泊汀α的治疗领域是非常重要的。
纯化EPO和EPO类似物的常规方法的实例包括阴离子交换和阳离子交换层析、疏水作用层析、分子排阻色谱等。具体地,国际公布号WO 2010/027869公开了通过顺序地应用疏水作用、阴离子交换、阳离子交换和尺寸排阻色谱纯化EPO的方法。国际公布号WO 2003/045996公开了通过进行反相色谱、阴离子交换层析和尺寸排阻色谱纯化重组人EPO的方法。
特别地,作为纯化达依泊汀α的方法,国际公布号WO 1995/005465公开了应用阴离子交换树脂和C4树脂的方法,国际公布号WO 2010/008823提出了针对具有高唾液酸含量的、等电点为4.5或更低的达依泊汀α的纯化的流通模式,其中靶蛋白没有结合到阳离子交换树脂柱,而是在层析处理溶液中流出。然而,由于这些方法使用多个树脂步骤,它们需要非常高的成本和大量时间,因此不适合大规模生产。
同时,韩国专利申请公布号10-2013-0042107公开了一种通过采用顺序地应用阴离子、羟基磷灰石、阴离子交换层析的三步过程,并且为了具有低等电点的同种型的选择性分离,当应用第二阴离子交换树脂层析时在特定的pH条件下进行吸附和清洗的方法,其比上面的四步过程更简单。特别地,为了获得具有低等电点的同种型,将达依泊汀α在4.0至5.0的pH下结合到柱,之后用具有2.0至2.4的pH的缓冲溶液清洗。
上述方法在大规模生产中要求的时间和成本方面可以是有利的,因为该过程与常规过程相比简单一点,然而,对于如在上面公布的专利申请中所提出的低pH条件(2.2至2.4的pH)的实施方式,有毒的、酸性溶液如HCl大量使用是必需的,因此该方法不是令人想要的。另外,由于当将被柱处理的量在放大时增加时,在给定的pH条件下的同种型反应不是恒定的,所以当具有期望的等电点范围的同种型将通过控制缓冲溶液的pH条件而获得时,大规模生产中再现性的可能性低。
也就是说,由于纯化达依泊汀α的常规方法需要利用由多个树脂步骤组成的层析的复杂过程,所以它需要非常高的成本和大量时间,并且当纯化利用与常规方法相比简化的方法进行时,条件如pH被精确控制是必需的,以补偿可被减少的纯化效果,但是随着生产规模变得更大,控制条件变得更困难。
正因为如此,存在对纯化达依泊汀α的改进的方法的渐增的需求,该方法比常规方法更简化并具有更容易控制的工艺条件,当该方法应用于大规模生产时可稳定地再现成功的工艺条件同时减少成本和时间。
发明概述
本发明人努力开发与常规方法相比具有改进的便利和简单的纯化达依泊汀α的方法,因此已令人惊讶地发现只利用阴离子和精氨酸的简单方法可在短时期里分离具有高唾液酸含量的达依泊汀α,从而完成本发明。
因此,本发明的目的是提供从具有多种唾液酸含量的达依泊汀α结构同种型的混合物纯化具有高唾液酸含量的达依泊汀α的方法。
发明的有益效果
本发明的方法是纯化达依泊汀α的新方法,达依泊汀α可以方便且简单地产生,并且根据本发明,在大规模生产的时候,由于工艺效率的提高而显著地增加生产率以及产生高纯度达依泊汀α是可能的。
附图简述
图1显示通过阴离子交换-羟基磷灰石树脂层析的纯化获得的达依泊汀α的洗脱物通过C4HPLC分析的纯度。
图2显示将含有精氨酸的甘氨酸-HCl缓冲溶液应用到其中的阴离子交换层析的IEF(等电聚焦)结果。
图3显示将含有精氨酸的乙酸钠缓冲溶应用到其中的阴离子交换层析的IEF结果。
图4显示将没有精氨酸的甘氨酸-HCl缓冲溶液应用到其中的阴离子交换层析的IEF结果。
图5显示通过阴离子交换层析获得的达依泊汀α部分的凝胶过滤层析结果。
图6显示IEF结果,其显示图5中每个部分的等电点。
优选实施方式的详细描述
为了实现上述目的,一方面,本发明提供从具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α结构同种型的混合物纯化达依泊汀α的方法。
具体地,为了从达依泊汀α结构同种型的混合物选择性分离具有高含量唾液酸的结构同种型,本发明提供通过包括用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗的阴离子交换层析纯化达依泊汀α的方法。
优选,根据本发明的纯化达依泊汀α的方法包括进行至少一个阴离子交换层析,其中阴离子交换层析的进行包括将达依泊汀α结构同种型的混合物结合到阴离子交换树脂,用含有精氨酸的缓冲溶液清洗树脂,和从柱洗脱结合到层析柱的达依泊汀α。
在另一个示例的实施方式中,本发明提供纯化达依泊汀α的方法,包括以下步骤:(a)通过将含有具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α的混合物装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到阴离子交换层析柱;(b)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗层析柱;和(c)从柱洗脱保持结合到层析柱的达依泊汀α。
在示例的实施方式中,本发明提供纯化达依泊汀α的方法,包括以下步骤:(a)通过将包括达依泊汀α的生物流体施加到阴离子交换层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;(b)通过将步骤(a)中产生的洗出液施加到羟基磷灰石树脂层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;(c)通过将步骤(b)中产生的洗出液装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到阴离子交换层析柱;(d)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗步骤(c)中处理过的柱;和(e)从柱洗脱通过在步骤(d)中清洗而保持结合到层析柱的达依泊汀α。
本发明在下文被更详细地描述。
如本文所用,术语“达依泊汀α”,处于红细胞生成素(EPO)——其是糖蛋白——的重组形式,指这样的糖蛋白,其在红细胞生成素分子的氨基酸序列中具有五个取代,从而提供两个另外的N-糖基化链。达依泊汀α在生物化学特性如分子量、等电点等方面与红细胞生成素有区别。达依泊汀α诱导红细胞生成,因此可用作与癌症的化学治疗相关的肾衰竭或贫血的治疗剂。由于其中加入的聚糖,达依泊汀α具有比红细胞生成素长约三倍的血清半衰期,并且可根据唾液酸含量以多种同种型存在。具有高含量的聚糖和唾液酸的达依泊汀α结构同种型具有低等电点,并且这些结构同种型在体内具有高的生物活性。因此,仅具有高含量的聚糖和唾液酸的结构同种型的选择性的分离和纯化在利用达依泊汀α的治疗蛋白剂中是非常重要的,然而,常规纯化方法具有这样的问题:由于几个步骤中树脂的使用,它们需要非常高的成本和大量时间。从这一点上,本发明人已开发了在短时期里仅通过简化的方法纯化具有高糖基化的达依泊汀α的方法。
由于达依泊汀α具有比EPO更高的糖基化水平,所以每1摩尔达依泊汀α的唾液酸含量比EPO更高,EPO具有每1摩尔EPO最大13摩尔的唾液酸含量,已知每1摩尔达依泊汀α的唾液酸含量的最大理论值是22摩尔(Development and characterization of novelerythropoiesis stimulating protein(NESP),British Journal of Cancer(2001)84(Supplement 1),3-10)。
特别地,根据本发明的纯化方法分离和纯化的达依泊汀α具有高含量的聚糖和唾液酸,优选是具有pI 2.0至pI 4.0的低等电点,更优选具有3.5或更小的等电点的结构同种型的达依泊汀α。
如本文所用,术语“生物流体”指含有细胞、细胞成分、或细胞产物、或其衍生物的培养物,并且虽然它不限于此,可包括细胞培养物、细胞培养上清液、细胞裂解物、细胞提取物、组织提取物、血液、血清、牛奶、尿、其部分等。在本发明的纯化中,将使用的生物流体可以处于多种类型。优选,生物流体可以是酵母、植物、或动物细胞培养物,更优选,转基因动物的动物细胞培养物,编码达依泊汀α的核苷酸序列通过遗传重组转染进其中,甚至更优选,这样的动物细胞培养物,其中动物细胞来自中国仓鼠卵巢(CHO)。当使用动物细胞培养物时,如本领域所知,更优选使用通过培养物的离心获得的上清液。
优选,本发明的生物流体可通过利用超滤/渗滤方法获得。超滤/渗滤方法不但可去除培养物中10,000截留分子量(MWCO)的低分子量物质(例如,表面活性剂、染色剂、小肽、糖组分等),而且可通过随后用层析平衡缓冲溶液替换缓冲溶液来提高柱吸附效率。
在本发明的示例的实施方式中,培养用含有达依泊汀α的载体转染的CHO细胞,并将培养物的上清液通过超滤(使用10mM磷酸钠缓冲溶液)渗滤并用作生物流体。
如本文所用,术语“阴离子交换层析”指基于分子的电荷通过将负电荷(或酸性)分子结合到正电荷载体而分离分子的方法,同源分子(酸性的、碱性的、中性的)通过该技术可被容易地分离。强阴离子交换树脂和弱阴离子交换树脂均可没有限制地用于本发明,例如,SephadexTM、SepharoseTM、SOURCETM、Mono QTM和Mini QTM(GE healthcare),并且可使用这样的树脂,其中官能团是季胺(Q)、二乙氨基乙基(DEAE)或季氨基乙基(QAE),虽然它们不限于此。优选,官能团可以是Q或DEAE,最优选,Q-SepharoseTM,其是强阴离子交换树脂。
阴离子交换层析可通过柱层析进行。另外,用于本发明的阴离子交换层析的阴离子交换树脂可在将培养物吸附到其之前利用含水缓冲溶液来平衡,缓冲溶液的实例可包括Tris-HCl、磷酸钠缓冲溶液等。
另外,用于本发明的阴离子交换层析的阴离子交换树脂可在将培养物吸附到其之前利用含水缓冲溶液来平衡。
用于本发明的吸附层析的固定相可包括二氧化硅、氧化铝、氧化镁和羟基磷灰石,最优选羟基磷灰石。特别地,已知羟基磷灰石广泛用于核酸如DNA的常规去除。
在从达依泊汀α部分去除生物学杂质之后,将包括多种唾液酸含量的结构同种型的达依泊汀α部分进行阴离子交换层析,从而选择性地分离具有高唾液酸含量的达依泊汀α。在本发明的纯化方法中,为了获得具有期望的等电点的达依泊汀α结构同种型的目的,用含有精氨酸的清洗缓冲溶液的清洗可清洗具有比期望的等电点更高的等电点的达依泊汀α结构同种型。
为了本发明的目的,阴离子交换层析柱利用含有精氨酸的清洗溶液来清洗。
在本发明中,含有精氨酸的清洗缓冲溶液可优选具有3.0至5.0的pH,并可进一步包括选自NaCl和尿素的至少一种。特别地,清洗缓冲溶液可含有5mM至90mM浓度的NaCl,并可含有3M至8M浓度的尿素。
优选,本发明的纯化方法可进一步包括在将包括具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α的混合物装载进阴离子交换层析柱和将达依泊汀α结合到柱之后,在用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗层析柱之前或之后,用具有或没有精氨酸的清洗缓冲溶液的清洗,并且更优选,可进一步包括在用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗层析柱之前,用具有6至8的pH的清洗缓冲溶液的层析柱的第一清洗,用含有精氨酸的清洗缓冲溶液的层析柱的清洗可以是用具有3至5的pH的清洗缓冲溶液的层析柱的第二清洗。
将用于清洗的清洗缓冲溶液的实例可包括磷酸钠缓冲溶液、乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、甘氨酸-HCl缓冲溶液、柠檬酸-磷酸钠缓冲溶液等。更优选,用于第一清洗的清洗缓冲溶液可以是具有6至8的pH的磷酸钠溶液,用于第二清洗的清洗缓冲溶液可以是具有3至5的pH的甘氨酸-HCl溶液,并且NaCl、尿素等可被另外包含以达到流动相的期望的pH范围或离子强度。
用于本发明的含有精氨酸的清洗缓冲溶液起到去除具有低唾液酸含量的达依泊汀α的重要作用。图2显示利用含有精氨酸的甘氨酸-HCl溶液作为清洗缓冲溶液进行的层析结果,图3显示利用含有精氨酸的乙酸钠溶液作为清洗缓冲溶液进行的层析结果。在这两种情况中,证实具有高唾液酸含量的达依泊汀α被洗脱。也就是说,当应用含有精氨酸的pH缓冲溶液时,显示具有2至3的等电点的高质量的达依泊汀α被洗脱,并且特别地,大量集中在等电点2周围(图2和3上标箭头的部分)。
相反,当精氨酸没有包含在清洗缓冲溶液中同时保持其它条件相同时,具有低唾液酸含量的达依泊汀α结构同种型在等电点3周围和等电点3以上被大量洗脱,因此证实清洗缓冲溶液对达依泊汀α结构同种型的纯化效果的显著降低(图4)。
利用含有精氨酸的清洗缓冲溶液进行清洗之后,具有高唾液酸含量的达依泊汀α利用具有6至8的pH的缓冲溶液通过阶梯式盐梯度被洗脱。
在另一个示例的实施方式中,本发明提供达依泊汀α的纯化方法,其中通过进一步利用凝胶过滤层析,只有具有高唾液酸含量的结构同种型可被选择性地分离。也就是说,这可以是进一步包括通过将上面获得的阴离子交换层析洗出液应用于凝胶过滤层析而分级它的纯化方法。
凝胶过滤层析是根据蛋白质的大小而分离它们的方法,并可用于蛋白聚合物的分离。将用于凝胶过滤层析的树脂的实例可包括SephadexTM、SepharoseTM、SephacrylTM等(GEhealthcare),最优选,可利用Sephacryl S-100、S-200和S-300。
当将通过利用含有精氨酸的清洗缓冲溶液进行阴离子层析获得的阴离子交换层析洗出液进一步进行凝胶过滤层析时,具有更高唾液酸含量和99%或更高纯度的达依泊汀α可被洗脱。
具有期望的等电点的洗出液可通过如下获得:用缓冲溶液充分地平衡凝胶过滤层析;将获自利用含有精氨酸的清洗缓冲溶液的阴离子层析的洗出液装载进平衡的凝胶过滤层析柱;之后分级洗出液。按照部分的顺序,较早被洗脱的部分可具有更高的唾液酸含量。
在本发明的另一个示例的实施方式中,将约1.7L Sephacryl S-100至S-200(GEHealthcare)树脂填充进XK-50/90柱(GE Healthcare),将含有140mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH 6.2)充分地流进其中以平衡凝胶过滤柱。然后,将含有达依泊汀α的溶液浓缩,并将约60mL浓缩物以7.5mL/min的速度流进柱中,并将含有140mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH 6.2)充分地流进柱中,从而分级含有具有高唾液酸含量的达依泊汀α的洗出液(图5)。证实按照部分的顺序达依泊汀α的洗出液部分具有更高的唾液酸含量(表1和图6)。
另一方面,本发明提供纯化达依泊汀α的方法,包括以下步骤:(a)通过将含有达依泊汀α的生物流体施加到阴离子交换层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;(b)通过将步骤(a)中产生的洗出液施加到羟基磷灰石树脂层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;(c)通过将步骤(b)中产生的洗出液装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到阴离子交换层析柱;(d)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗步骤(c)中处理过的柱;和(e)通过步骤(d)中的清洗从柱洗脱保持结合到层析柱的达依泊汀α。
该方法的每个步骤可如下面所示被详细地说明。
步骤(a)是通过将含有达依泊汀α的生物流体施加到阴离子交换层析而洗脱含有达依泊汀α的部分,优选,它可以是通过将含有达依泊汀α的生物流体加入到平衡的阴离子交换层析柱中而将含有达依泊汀α的生物流体吸附到平衡的阴离子交换层析柱,用具有6至8的pH和含有10mM至100mM NaCl的清洗缓冲溶液清洗柱,和用具有6至8的pH和含有100mM至300mM NaCl的洗脱缓冲溶液洗脱含有达依泊汀α的部分。
阴离子交换层析和构成相应的柱的树脂与上面描述的相同。
在本发明的示例的实施方式中,通过在用含有达依泊汀α的载体转染的CHO细胞中表达达依泊汀α而获得的约1L培养物通过利用10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)的超滤(10,000的MWCO)而渗滤以获得生物流体,将该生物流体施加到填充用10mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)平衡的阴离子交换(Q fast flow,GE Healthcare)树脂的XK-50柱,并且再将约2个柱体积(CV)的10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)流进其中以平衡柱。然后,将柱用含有0mM至100mM NaCl的清洗缓冲溶液清洗,然后利用具有6至8的pH和含有100mM至300mM NaCl的洗脱缓冲溶液洗脱。由于阴离子交换层析,通过RP-HPLC证实得自生物流体的杂质被去除,并且洗出液被纯化成含有大量达依泊汀α的溶液(图1B)。
步骤(b)是将步骤(a)中回收的洗出液装载进平衡的吸附层析的固定相,更优选,平衡的羟基磷灰石树脂,用具有6至8的pH、其中含有0mM至100mM磷酸钠的清洗缓冲溶液清洗产生的树脂,从而从在装载和清洗期间没有吸附到树脂的洗脱的流体获得含有达依泊汀α的部分。
用于本发明的吸附层析的固定相的实例可包括二氧化硅、氧化铝、氧化镁和羟基磷灰石,最优选羟基磷灰石。如本文所用,术语“羟基磷灰石树脂层析”或“羟基磷灰石层析”指具有充满羟基磷灰石树脂的固定相的吸附层析,并且可与“羟基磷灰石柱”可互换地使用。
用于清洗和洗脱步骤中每个的缓冲溶液的实例优选包括磷酸钠缓冲溶液、磷酸钾缓冲溶液、和Tris缓冲溶液。
在本发明的示例的实施方式中,将阴离子交换树脂洗出液施加到充满用7mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)平衡的羟基磷灰石树脂的XK-50柱,将约三个柱体积的7mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)流进其中,从而将具有结合至其的许多聚糖的达依泊汀α洗脱。由于羟基磷灰石树脂层析,通过RP-HPLC证实得自生物流体的杂质被去除,并且洗出液被纯化成含有大量达依泊汀α的溶液(图1C)。
[发明方式]
在下文中,本发明将参考以下实施例被更详细地描述。然而,这些实施例仅用于说明的目的,本发明不意欲受限于这些实施例。
实施例1:通过阴离子交换层析和羟基磷灰石吸附层析获得具有多种唾液酸含量的达依泊汀α同种型的混合物
约1L通过在用含有编码达依泊汀α的核苷酸序列的载体转染的CHO细胞中表达达依泊汀α而获得的培养物通过利用10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)的超滤(10,000的MWCO)而渗滤以获得生物流体。将生成物顺序地经历阴离子交换层析和羟基磷灰石吸附层析的两个柱。
首先,阴离子交换层析如下进行。将约100mL阴离子交换(Q fast flow,GEHealthcare)树脂充满XK-50柱(GE Healthcare)并将10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)流进其中以平衡柱。将渗滤物以约0.1L至0.2L的量以15mL/min的速度流进在其中制备的QSepharose FF柱,然后将约2个柱体积(CV)的10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)再流进其中以平衡柱。将柱用含有10mM至100mMNaCl的清洗缓冲溶液清洗,然后利用具有6至8的pH和含有100mM至300mM NaCl的洗脱缓冲溶液洗脱。
其次,将经历阴离子交换层析的洗出液如下面所详细说明的经历羟基磷灰石吸附层析。将约100mL羟基磷灰石(GE Healthcare)树脂充满XK-50柱(GE Healthcare)并将7mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)流进其中以平衡柱。将约0.1L渗滤物以10mL/min的速度流进在其中制备的羟基磷灰石柱,然后再将约3个柱体积(CV)的7mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)流进其中。
特别地,在装载和清洗期间没有吸附到树脂的洗脱的溶液含有具有多种唾液酸含量的达依泊汀α,将这些溶液收集并进行随后的程序。清洗之后,将0.1M至0.7M磷酸钾缓冲溶液(pH 7)流进树脂并通过洗脱将含有具有低的聚糖的达依泊汀α和杂质的部分(或多个)去除。溶液中生物学来源的杂质的去除和大量达依泊汀α通过RP-HPLC证实(图1)。
实施例2:通过在阴离子交换层析中利用精氨酸的清洗方法纯化具有高唾液酸含量的达依泊汀α
将约20mL Q Sepharose FF(GE Healthcare)树脂充满XK-26柱(GE Healthcare)并将10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)充分地流进其中以平衡柱。
将约0.2L实施例1中获得的含有达依泊汀α的溶液以5mL/min的速度流进柱,然后将10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)——其是平衡缓冲溶液——流进其中以平衡柱。然后,将柱经历用含有50mM NaCl的10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)的第一清洗,然后接着经历用具有3至5的pH并含有尿素、精氨酸和NaCl的甘氨酸-HCl缓冲溶液的第二清洗,从而清洗含有具有低唾液酸含量的达依泊汀α的部分。将只具有高水平糖基化和低等电点的蛋白质利用含有190mM NaCl的磷酸钠缓冲溶液(pH 6.2)洗脱。通过清洗过程获得的达依泊汀α通过IEF显示具有高质量(图2)。
实施例3:含有精氨酸的清洗溶液对唾液酸含量的作用的测量
在实施例2中应用精氨酸的清洗方法被证实为在纯化具有高唾液酸含量的达依泊汀α中起重要作用。
将实施例1中获得的含有达依泊汀α的溶液以与实施例2相同的方式吸附到QSepharose FF,将约2个柱体积(CV)的10mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)——其是平衡缓冲溶液——流进柱以进行第一清洗。然而,第二清洗利用具有3至5或更低的pH的乙酸钠缓冲溶液代替实施例2中使用的甘氨酸-HCl缓冲溶液而进行。由于洗脱,证实已经获得具有2~3或更低的等电点的具有高唾液酸含量的达依泊汀α(图3中标箭头的部分)。
另一方面,第一清洗和第二清洗以与实施例2中相同的方式进行,但是没有精氨酸。由于洗脱,甚至具有2~3或更高的等电点的具有低唾液酸含量的达依泊汀α被洗脱,因此证实其质量显著降低(图4中标箭头的部分)。
在该实施例中,证实精氨酸是获得具有低等电点的具有唾液酸的达依泊汀α的重要因素。
实施例4:通过凝胶过滤层析纯化具有高唾液酸含量的达依泊汀α
将约1.7L Q Sephacryl S-100至S-200(GE Healthcare)树脂填充进XK-50/90柱(GE Healthcare)并将含有140mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH 6.2)充分地流进其中以平衡柱。
将实施例2中获得的含有达依泊汀α的溶液浓缩,并将约5mL浓缩物以7.5mL/min的速度流进柱,并将含有140mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲溶液(pH 6.2)充分地流进柱,从而分级含有具有高唾液酸含量的达依泊汀α的洗出液(图5)。证实按照部分的顺序达依泊汀α的洗出液部分具有更高的唾液酸含量(表1和图6)。表示根据每个部分的唾液酸含量的Wax-HPLC结果显示在下面的表1中。
表1】
概括以上结果,在利用阴离子交换柱的情况中,证实具有高唾液酸含量的达依泊汀α可通过利用含有精氨酸的缓冲溶液的清洗过程而纯化。另外,由于其后进一步进行凝胶过滤层析之后的分级,证实具有高唾液酸含量和高纯度的达依泊汀α可通过本发明的方法纯化。
根据上述内容,本发明所属领域的技术人员将能够理解,本发明可以以其它具体的方式体现而不修改本发明的技术概念或必要特性。从这一点上,本文公开的示例的实施方式仅用于说明的目的,而不应被解释为限制本发明的范围。相反,本发明意欲不但覆盖示例的实施方式,而且覆盖如所附权利要求所限定的可包括在本发明的精神和范围内的各种可选方案、修改、相等物和其它实施方式。
Claims (16)
1.纯化达依泊汀α的方法,包括:
(a)通过将包括具有多种含量的唾液酸的达依泊汀α的混合物装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到所述阴离子交换层析柱;
(b)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗所述层析柱;和
(c)从所述柱洗脱保持结合到所述层析柱的所述达依泊汀α,
其中步骤(b)的清洗是从具有更高等电点的达依泊汀α结构同种型的混合物中选择性分离具有期望的等电点的达依泊汀α结构同种型,并且
其中步骤(c)中洗脱的所述达依泊汀α具有pI 2.0至4.0的等电点。
2.权利要求1所述的方法,其中所述含有精氨酸的清洗缓冲溶液具有3.0至5.0的pH。
3.权利要求1所述的方法,其中所述含有精氨酸的清洗缓冲溶液进一步包括选自NaCl和尿素的至少一种。
4.权利要求3所述的方法,其中所述清洗缓冲溶液包括处于5mM至90mM的浓度的NaCl。
5.权利要求3所述的方法,其中所述清洗缓冲溶液包括处于3M至8M的浓度的尿素。
6.权利要求1所述的方法,进一步包括在步骤(b)之前或之后用具有或没有精氨酸的清洗缓冲溶液的清洗。
7.权利要求1所述的方法,进一步包括在步骤(b)之前用具有6至8的pH的清洗缓冲溶液的所述柱的第一清洗;其中步骤(b)是用具有3至5的pH的含有精氨酸的清洗缓冲溶液的所述柱的第二清洗。
8.权利要求7所述的方法,其中用于所述第一清洗的所述清洗缓冲溶液是磷酸钠溶液;并且用于所述第二清洗的所述清洗缓冲溶液是甘氨酸-HCl溶液。
9.权利要求1所述的方法,其中所述混合物是酵母培养物、植物细胞培养物、或动物细胞培养物。
10.权利要求1所述的方法,其中所述阴离子交换层析柱包括具有选自季胺(Q)、二乙氨基乙基(DEAE)、和季氨基乙基(QAE)的官能团的树脂。
11.权利要求1所述的方法,进一步包括(d)通过将步骤(c)中获得的阴离子交换层析洗出液施加到凝胶过滤层析而将其分级。
12.纯化达依泊汀α的方法,包括:
(a)通过将包括达依泊汀α的生物流体施加到阴离子交换层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;
(b)通过将步骤(a)中产生的洗出液施加到吸附层析而洗脱含有达依泊汀α的部分;
(c)通过将步骤(b)中产生的洗出液装载进阴离子交换层析柱而将达依泊汀α结合到所述阴离子交换层析柱;
(d)用含有精氨酸的清洗缓冲溶液清洗步骤(c)中处理过的柱;和
(e)通过步骤(d)中的清洗从所述柱洗脱保持结合到所述层析柱的所述达依泊汀α,
其中步骤(d)的清洗是从具有更高等电点的达依泊汀α结构同种型的混合物中选择性分离具有期望的等电点的达依泊汀α结构同种型,并且
其中步骤(e)中洗脱的所述达依泊汀α具有pI 2.0至4.0的等电点。
13.权利要求12所述的方法,其中所述吸附层析的固定相是羟基磷灰石树脂。
14.权利要求12所述的方法,进一步包括(f)通过将步骤(e)中获得的阴离子交换层析洗出液施加到凝胶过滤层析而将其分级。
15.权利要求12所述的方法,其中步骤(a)包括通过将含有达依泊汀α的生物流体加入平衡的阴离子交换树脂而将其吸附到所述平衡的阴离子交换树脂,用具有6至8的pH和含有0mM至100mM NaCl的清洗缓冲溶液清洗产生的树脂,和用具有6至8的pH和含有100mM至300mM NaCl的洗脱缓冲溶液洗脱含有达依泊汀α的部分。
16.权利要求12所述的方法,其中步骤(b)包括将步骤(a)中回收的洗出液装载进平衡的羟基磷灰石树脂,用具有6至8的pH和含有0mM至100mM磷酸钠的清洗缓冲溶液清洗产生的树脂,并从在装载和清洗期间没有吸附到所述树脂的从所述树脂出来的流体获得含有达依泊汀α的部分。
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