CN105749350A

CN105749350A - 一种心肌补片及其制备方法

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Publication number: CN105749350A
Application number: CN201610255235.4A
Authority: CN
Inventors: 杨刚; 肖正华; 任小梅; 钱宏; 龙海燕; 郭应强
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2016-04-21
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2036-04-21
Also published as: CN105749350B

Abstract

一种心肌补片及其制备方法。本发明公开了一种水凝胶支架，它是由如下方法制备而成：(1)取明胶制备浓度为4?10％w/v的明胶溶液，再制备转谷氨酰胺酶溶液，按照每克明胶添加不低于5U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中，混匀，得水凝胶溶液；(2)在水凝胶溶液中，加入细胞，混匀，得含有细胞的水凝胶溶液，成胶，即可。本发明水凝胶支架的力学性能优良，其中的细胞可以正常生长，可以有效修复机体的损伤。本发明水凝胶支架制备的心肌补片，厚度达2?4mm，手术缝合方便，而且其中复合的细胞可以正常生长，用于心肌修复的效果优良，临床应用前景优良。

Description

一种心肌补片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种心肌补片及其制备方法。

背景技术

心肌细胞是一种终末分化的细胞，坏死后难以再生。当今社会冠心病发病率与日俱增，而目前的治疗手段虽能完成血运重建，避免心肌的进一步损伤，但是并不能挽救已经坏死的心肌。对于严重的心肌梗死患者，残存心肌无法维持心脏功能的情况下，心脏移植成为惟一有效的治疗手段，但由于移植供体的缺乏与免疫排斥问题，严重限制了移植手术的开展，绝大部分这样的患者无法得到有效的治疗。而干细胞植入作为一种细胞治疗手段，为治疗心肌梗塞提供了一种极具潜力的解决方案。目前已经有很多临床研究充分证实干细胞植入可以改善心梗患者的心脏功能。但是干细胞植入治疗最大的瓶颈在于细胞植入后容易大量流失，无法聚集在治疗靶点，而且长期存活率非常低，这些都严重影响临床疗效。为了解决这个问题，科研人员设想将干细胞与某种生物材料复合后，再植入到心肌梗死的部位或者固定到心肌梗死区域，就此，提出了心肌补片的概念。

构建出理想的心肌补片必须选用一种合适的生物材料作为载体，这种材料应具备以下特点：1)具有良好的生物相容性，细胞能够在材料内良好生长并形成紧密连接；2)该材料具有一定力学强度，可以植入心脏承受心脏搏动的牵拉力，并且适合手术缝合；3)对机体无毒副作用。

目前，复合材料内干细胞的营养来源是心肌补片技术最大的挑战，难度在于：心肌补片必须具有一定的厚度，才能用于手术缝合，但是，当组织的厚度大于100～200μm时，仅仅靠被动扩散已经无法保证营养物质和氧气的扩散，以及代谢物质的排出。因此直接将细胞片进行叠加的方式其厚度是受到很大的限制的。因此如何在细胞片之间建立具有功能性的血管网就成为一个必须要解决的问题。

有一些学者尝试将一些脱细胞的血管网，植入到细胞片表面，或者是用其他方式，比如说3D打印的技术，将毛细血管网直接打印在细胞片表面，这些方式都存在着一些缺点，前者是存在的免疫排斥的问题，后者又存在的效率低、成本高等问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的心肌补片。

首先，本发明提供了一种水凝胶支架，它是由如下方法制备而成：

取明胶制备浓度为4-10％w/v的明胶溶液，再制备转谷氨酰胺酶溶液，按照每克明胶添加不低于5U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中，混匀，得水凝胶溶液；

优选地，

步骤(1)中，所述明胶溶液的浓度为10％；按照每克明胶添加5-40U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中，优选地，按照每克明胶添加10U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中；和/或，所述的转谷氨酰胺酶溶液的浓度为10％w/v。

优选地，步骤(2)中，所述水凝胶溶液为1×10⁴～1×10⁶个/ml，优选5×10⁴个/ml。

优选地，步骤(2)中，所述细胞为脂肪间充质干细胞或者心肌细胞。

优选地，步骤(2)中，成胶的方法是37℃恒温孵育2小时。

优选地，所述水凝胶支架为水凝胶支架片，其厚度为0.5～2mm，优选1mm。进一步优选地，所述水凝胶支架片的一个表面有沟道，沟道的深度为0.1～0.5mm，优选0.3mm，宽度为0.3-0.5mm，沟道之间的间距为0.5-1mm。

其中，步骤(2)中，将含有细胞的水凝胶溶液浇筑到模具上，再成胶。

本发明心肌补片，其特征在于：它由2～4层前述水凝胶支架片重叠而成。

本发明还提供了前述的水凝胶支架片和前述心肌补片在制备缺损修复材料中的用途。

本发明水凝胶支架的力学性能优良，其中的细胞植入体内后仍然可以正常生长，可以有效修复机体的损伤。本发明水凝胶支架制备的心肌补片，厚度达1-8mm，手术缝合方便，而且其中复合的细胞可以正常生长，用于心肌修复的效果优良，临床应用前景优良。

下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1 mTG酶催化明胶水溶液形成水凝胶的图示。

图2采用微雕刻技术制作模具，左图为有机玻璃模具，中间和右边两张图为PDMS阳膜。图3水凝胶材料的降解性能研究结果。

图4水凝胶材料的拉伸性能研究结果。

图5上面两张图显示在相差显微镜下观察所看到的细胞。实验组培养第7天(左上图)，细胞在明胶水凝胶内呈树枝状生长,伸展性较好。第14天(右上图)以后细胞相互联结形成，网状生长。下面两趟图分别是用HE染色(左下图)和Masson染色(右下图)得到的结果。从图中可以看到，而其染色的细胞胞浆和细胞核清晰饱满，细胞生长状况良好。Masson染色表明细胞形成了比较紧密的结合，呈现出网状生长，而且分泌了很多的胶原纤维(胶原纤维被染色成绿色)。

图6采用荧光显微镜观察培养在明胶水凝胶表面的细胞的生长状况，活细胞的胞浆被钙黄绿素-AM染色为绿色，死细胞的细胞核被溴化乙锭染色为红色。上面4张图的细胞种植在2D表面,从图中来看，细胞能够自由铺展生长、贴壁良好。下面两张图是细胞包埋在3D水凝胶材料里面的，细胞染色情况表明，绝大部分细胞生长良好，只有极个别的的细胞凋亡。图中的标尺长度为100μm。

图7采用激光共聚焦显微镜观察种植于明胶水凝胶材料内部的细胞，活细胞的胞浆被钙黄绿素-AM染色为绿色，死细胞的细胞核被溴化乙锭染色为红色。从图中可以看出细胞生长状态良好，死细胞非常少，而且共聚焦图片显示细胞分布均匀，而且细胞往各个方向都能够铺展生长，表明它们和水凝胶的粘附非常紧密。图中的标尺长度为100μm。

图8细胞增殖测试。

图9扫描电镜观察细胞在明胶水凝胶材料上的粘附情。

图10细胞cTn-1和Con43免疫荧光染色。绿色(FITC标签的抗体)指示细胞对心肌特异性蛋白的染色，蓝色指示DAPI对细胞核进行染色。

图11新生大鼠心肌细胞生长在常规培养皿表面，左图为FITC(绿色)标记的心肌特异性蛋白cTnI，中间的图为DAPI(蓝色)标记的细胞核，右图为罗丹明鬼笔环肽(红色)标记的细胞肌动蛋白丝。

图12新生大鼠心肌细胞生长在8％明胶水凝胶表面，左图为FITC(绿色)标记的心肌特异性蛋白cTnI，中间的图为DAPI(蓝色)标记的细胞核，右图为罗丹明鬼笔环肽(红色)标记的细胞肌动蛋白丝。(背景染色比较深，这是由于明胶水凝胶材料吸收染色剂的原因)。

图13 mTG酶交联的的明胶水凝胶植入SD大鼠的皮下(左上图)，手术之后SD大鼠能够自由活动和进食(右上图)。HE染色(左下图)和Masson(右下图)染色

具体实施方式

实施例1本发明本发明水凝胶支架和心肌补片的制备方法

1、制备方法

(1)水凝胶制备

定量称取明胶(B型牛皮明胶，Sigma公司产品)，置于PBS中，50℃的水浴加速溶解，使明胶浓度达到10％(质量体积比)，然后用0.2μm针式滤器过滤除菌。同样的，定量称取微生物型转谷氨酰胺酶(mTG，活力为100U/g,美国Ajinomoto有限公司产品)，置于PBS中溶解，使mTG浓度达到10％(质量体积比)，溶解后过滤除菌备用。按照每克明胶添加10U单位mTG的比例，将明胶水溶液(保持温度在37℃左右)与mTG混合，得到混合溶液。

(2)细胞制备

取待混合的细胞，消化细胞，收集细胞悬液，加入步骤(1)的混合溶液中，混匀，得包含细胞的混合溶液，该溶液中细胞密度为5×10⁴个/ml。

(3)铸形

首先：采用绘图软件(如CorelDRAW软件)设计血管网络图案(图案为平行线的沟道图案，沟道深度为0.3mm，宽度为0.3-0.5mm，长度为30～50mm，沟道之间的间距为0.5-1mm)，然后采用小型雕刻机在有机玻璃表面刻蚀图案，制备硬质模具；

第二步：在硬质模具上浇注PDMS硅橡胶(美国道康宁产品SYLGARD 184硅橡胶)得到对映图案，即获得PDMS阳膜；

第三步：将步骤(2)得到的包含细胞的混合溶液浇注到PDMS阳膜表面，然后置于37℃恒温培养箱，孵育2小时后成胶。剥离PDMS阳膜获得具有血管网络图案的水凝胶支架。

制备得到的水凝胶支架的厚度为1mm。

重复此过程便获得多片水凝胶支架片材，将这些水凝胶支架片材进行叠加便可构成复合多层(通常是2～4层,具体的层数取决于心肌梗死后的修复所需要的材料厚度)的、具有预血管化图案的生物支架，即为本发明心肌补片。

实施例2本发明本发明水凝胶支架和心肌补片的制备方法

1、制备方法

(1)水凝胶制备

(2)细胞制备

(3)铸形

首先：采用绘图软件(如CorelDRAW软件)设计血管网络图案(图案为平行线的沟道图案，沟道深度为0.1mm，宽度为0.3-0.5mm，长度为30～50mm，沟道之间的间距为0.5-1mm)，然后采用小型雕刻机在有机玻璃表面刻蚀图案，制备硬质模具；

制备得到的水凝胶支架的厚度为0.5mm。

实施例3本发明本发明水凝胶支架和心肌补片的制备方法

1、制备方法

(1)水凝胶制备

(2)细胞制备

(3)铸形

首先：采用绘图软件(如CorelDRAW软件)设计血管网络图案(图案为平行线的沟道图案，沟道深度为0.5mm，宽度为0.3-0.5mm，长度为30～50mm，沟道之间的间距为0.5-1mm)，然后采用小型雕刻机在有机玻璃表面刻蚀图案，制备硬质模具；

制备得到的水凝胶支架的厚度为2mm。

以下用实验例的方式来说明本发明的有益效果：

统计学方法：采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。培养细胞的增生率以平均值±标准差表示,不同培养时间在对照组和实验组细胞增生率的比较采用析因设计的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

实验例1 本发明心肌补片的物理学性质检测

一、试验方法

1、材料硬度的测试

调节明胶的浓度和加入的mTG酶的量，测定材料硬度，其余方法同实施例1。

采用力学测量仪对实施例1制得的心肌补片的硬度进行测定分析。测定仪器使用艾得堡拉力计，采取凝胶压缩的模式。压缩变形为探头压缩水凝胶的胶面产生形变，探头直径为12.5mm，探头下行速度为1.0mm/s，探头从水凝胶表面下探5mm的深度，检测温度为室温。取凝胶的最大破坏力(即曲线的最高值)作为凝胶强度。

(采用6次重复的实验，实验数据表示方法为平均值±标准差)

2、拉伸测试

材料的拉伸性能测试同样的使用艾得堡拉力计进行。将实施例1制得的心肌补片支架(4％水凝胶材料，mTG酶的用量分别为0～30U/g.pro)切成大小为2.0cm(宽)×6.0cm(长)的膜状长条形，用艾得堡拉力计测定其拉伸性能。水凝胶样本与夹具之间垫上一层细砂纸以增加摩擦力，并避免水凝胶的破碎。夹具上下距离为30mm，拉伸速度为10mm/min。厚度使用螺旋千分尺随机测定水凝胶材料上的10个位置，其平均值作为其厚度。计算膜的拉伸强度，断裂伸长率的公式如下。

拉伸强度：

TS(MPa)＝(F×10³)/(a×b)

注：F：膜样品在断裂时所能承受的最大应力(N)；a：膜的厚度(μm)；b：膜的宽度(mm)。

断裂伸长率：

EAB/％＝[(L-L₀)/L₀]×100％

注：L：水凝胶样品在断裂时所达到的长度(mm)；L₀：初始长度(mm)。

2、凝胶溶胀性能研究

将实施例1制得的心肌补片切成20mm×20mm的正方形，称重后放入PBS中，置于37℃恒温孵箱溶解10天。然后取出水凝胶，用滤纸去掉多余的水分，称重。根据其重量变化计算凝胶溶胀比例。

WS/％＝[(m1-m2)/m1]×100％

注：m1：浸泡之前水凝胶的的质量(g)；m2：浸泡之后水凝胶的的质量(g)。

3、水凝胶材料的自然降解性能研究

将实施例1制得的心肌补片(水凝胶浓度为2％-8％，测试分为两种，一种含有细胞，另外一种不含细胞)，切成20mm×20mm的正方形，称重后放入含有PBS的培养皿中，放置到37℃细胞培养箱中孵育8周。然后取出水凝胶，用滤纸去掉多余的水分，称重。根据其重量变化计算凝胶降解比例。

WS/％＝[(m1-m2)/m1]×100％

4、水凝胶材料的胶原酶降解性能研究

将实施例1制得的心肌补片切成20mm×20mm的正方形，称重后放入Ⅰ型胶原酶溶液(0.05％胶原酶溶解于PBS中)中，至于37℃恒温孵箱消化24h。然后取出水凝胶，用滤纸去掉多余的水分，称重。根据其重量变化计算凝胶降解比例。

WS/％＝[(m1-m2)/m1]×100％

二、试验结果

1、材料硬度的测试：

实验结果如表1-2所示：

表1凝胶时间和凝胶强度与水凝胶浓度的关系一览表(转谷氨酰胺酶的用量恒定为10U/g﹒pro)

水凝胶浓度

1％

2％

3％

4％

5％

6％

8％

10％

凝胶时间(分钟)

-

124.33±6.28^

89.5±2.59^{^}

50.33±4.27^{^}

38.83±0.98^{^}

25.5+0.55

20.5±0.55^{^}

15.67±0.52^{^}

凝胶强度(kPa)

-

2.80±0.28^#

5.49±0.31^*

12.42±0.83^#*

20.94±1.48^#*

34.99±1.49^#*

54.59±5.12^#*

(统计显著性符号^,#,*,代表P<0.01)

可以看出，采用浓度为4-10％的明胶溶液制备水凝胶支架，其力学强度都可以达到要求，优选浓度为10％。

表2凝胶时间和凝胶强度与转谷氨酰胺酶用量的关系一览表(水凝胶浓度恒定为4％)

mTG用量(U/g﹒pro)	2	5	10	20	40
						凝胶时间(分钟)	180.33±8.02^$	97.33±4.27^$	50.33±4.27^$	34±1.41^$	20.66±0.82^$
凝胶强度(kPa)	1.65±0.10^{#*^}	3.55±0.56^{#*^}	5.49±0.31^#	5.50±0.29^*	5.58±0.34^{^}

(统计显著性符号^$,#,*,^,代表P<0.01)

可以看出，在明胶溶液中，按照每克明胶添加不低于5U单位转谷氨酰胺酶的比例，加入浓度转谷氨酰胺酶溶液，制备水凝胶支架，其力学强度都可以达到要求，优选加入量为每克明胶添加10U单位转谷氨酰胺酶％。

2、拉伸测试

从图4中可以看出，mTG交联的水凝胶材料的拉伸强度随着mTG的浓度增大而逐渐变强，但到达一定浓度以后，拉伸强度没有更大的改善，当mTG的用量为10U/g·pro的时候，对应的拉伸强度为65.60MPa。未采用mTG交联的明胶水凝胶材料，由于没有形成具有一定强度的水凝胶，因此无法进行测试。这表明采用mTG酶交联的明胶水凝胶材料能够形成共价连接和交联结构，从而有利于进一步提高材料的拉伸强度和力学性能。

3、水凝胶材料的降解性能研究

如图3所示，本发明水凝胶支架不会被迅速降解。

4、材料的溶胀性能测试

该材料在PBS中浸泡了，10天，浸泡后的材料质量(m2)为浸泡前材料的质量(m1)的118.72±6.37％。

该结果说明，采用mTG酶修饰的明胶水凝胶材料能够在明胶分子内或分子间形成共价连接，从而在材料中形成交联结构，因此在37℃的去离子水中不发生溶解，有效改善了该材料在水体系中的稳定性。

实验结果说明，本发明水凝胶支架的力学性能优良，降解速度合适。

试验例2 本发明心肌补片(含心肌细胞)的细胞活力检测

一、试验方法

1、验证材料的细胞相容性

(首先采用心肌细胞来验证，因为如果心肌细胞能够在该材料上生长，说明该材料能够支持心肌细胞的正常生长和功能。其次再用脂肪间充质干细胞进行验证，若干细胞也能在上面生长，而且还能分化成心肌细胞，则进一步说明这种水凝胶材料有可能用于心肌组织工程和再生医学的研究。)

心肌细胞的原代培养：所有的动物实验符合四川大学有关善待动物的规范.取新生1-3天的SD大鼠，麻醉处死置于75％乙醇中浸泡10min后移入超净台，在无菌的条件下分离出心脏，去除大血管，将心脏剪成4份，放入到15ml离心管中，加入3ml 0.01％的胰酶，密封离心管后，放置到4℃冰箱震荡消化14h。弃胰酶消化液，PBS清洗两次，加入1ml 0.1％的Ⅱ型胶原酶，37℃震荡消化45min后。加入2ml含有10％胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基终止消化。收集消化液并且经200目滤网过滤后转移到一只新的离心管，以1000r/min转速离心5min，弃上清。再用含1％青霉素/链霉素和10％FBS的高糖DMEM重新悬浮细胞,然后接种于培养瓶中,放置于37℃、5％CO₂孵箱中培养，每隔2～3天换液。每天用倒置显微镜观察,记录细胞生长特性。待细胞融合至70％～80％时,消化传代,2～3代用于实验。

心肌细胞在水凝胶材料表面的二维培养：按照实施例1制备明胶和mTG酶混合溶液，然后在6孔板上铺板，制作水凝胶培养表面，水凝胶的厚度为1mm。消化心肌细胞，收集细胞悬液，按照1×10⁵个/mL的浓度将心肌细胞接种到水凝胶表面，对照组为不含明胶的6孔培养板表面。培养7天后按照下面所列的免疫荧光染色法，对细胞进行检测，观察心肌细胞在明胶水凝胶培养表面的粘附情况以及有否正常的心肌免疫表型，从而判断该水凝胶材料是否支持心肌细胞的生长。

水凝胶材料包封心肌细胞的三维培养：消化细胞，收集细胞悬液，同时，按照实施例1制备明胶和mTG酶混合溶液，将细胞悬液与之混合，混合溶液中细胞密度为4×10⁵个/mL,然后将混合溶液接种到24孔板中，每孔接种500μl，每组设3个复孔，分别在接种细胞后的第1、3、5天加入钙黄绿素(Calcium-AM)和溴化乙锭(PI)，37℃孵化30min，在激光共聚焦显微镜下观察细胞的死活状况，拍照记录。

2、免疫荧光染色(下面的方法以第9节心肌细胞样本处理为例，ADSCs细胞的样本处理方法相同)

按照实施例1制备明胶和mTG酶混合溶液，将混合溶液接种到6孔板中血盖片上，放置于37℃4h，PBS漂洗3次.,消化心肌细胞，收集细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁴个/ml，每孔接种200μl细胞悬液，放置到37℃孵箱中贴壁两小时后补充0％FBS的DMEM高糖培养基。7天后，对样品进行免疫细胞化学染色。首先取出血盖片，PBS冲洗3遍，4％的多聚甲醛固定，0.1％Triton打孔，加入一抗和二抗对心肌肌钙蛋白cTnI和缝隙连接蛋白Cx43进行检测，其中一抗稀释滴度1∶100，一抗孵育采用室温1h后4℃冰箱过夜。然后加入FITC标记的二抗，二抗稀释滴度1∶200。然后在荧光显微镜下随机取10个非重叠视野计算阳性细胞的比例。

3、RT-PCR检测mRNA的表达

GATA-4和NKx2.5是调控心肌形成和发育的核心转录因子之一。取第12节获得的ADSCS细胞爬片，0.1％Ⅰ型胶原酶消化水凝胶，离心收集细胞，按照RNA提取纯化试剂盒说明提取总RNA。然后参照TaKaRa one step RNA PCR Kit说明进行定量RT-PCR反应(采用美国伯乐IQ5定量荧光PCR仪)，每管分别加入GATA-4和NKx2.5上下游引物1μL，每管同时加入内参照β-actin上下游引物各0.5μL。按照以下条件进行RT-PCR反应：50℃50min RT反应，94℃2min，94℃30s、60℃30s、72℃1.5min延伸，循环35次。-

4、组织工程细胞片的体内移植实验。

将上述已制备好的组织工程细胞片(用的是3层水凝胶，每一层的厚度是1mm，)小心地移植至4-5周龄的SD大鼠的皮下组织，4-0无损伤线层缝合黏膜、肌层，1号线关闭切口、消毒、敷贴覆盖。术后24h密切观察动物呼吸、活动及进食情况，常规喂养高蛋白饲料，每日给予青霉素160万单位肌注，连续应用5d，术后7～9d拆线，分别于术后1和2周处死，取出水凝胶及周边组织，采用冰冻切片方法切片，进行HE组织化学染色观察。

二、试验结果

1、免疫荧光染色

如图10～12，图11是心肌细胞在普通培养皿表面的培养，用免疫荧光法进行染色。图12是将心肌细胞培养在明胶水凝胶表面，也是用免疫荧光染色方法进行染色的。该结果显示，心肌细胞可以在该水凝胶表面粘附生长，而且能够正常表达心肌特异性蛋白cTnI。

体外构建明胶水凝胶复合材料与ADSCs细胞相结合。经4周诱导后，免疫细胞化学染色显示ADSCs表达心肌肌钙蛋白表达率21％，对照组不表达。同时也表达cTn-1和Con4。

2、细胞片皮下生物相容性评估

如图13所示，实验动物观察:术后6～8h即可进食，无呼吸困难、无异常活动，24h后基本恢复正常，体质量无明显下降，背部切口正常愈合，没有形成疤痕组织，植入物无脱出，无异物及免疫反应。进一步采用HE染色和Masson染色证实，植入了明胶水凝胶材料到动物组织皮下的时候并没有发生炎症反应。

实验结果说明，本发明心肌补片中的心肌细胞能够正常生长，且可以有效修复机体损伤。

试验例3 本发明心肌补片(含脂肪间充质干细胞)的细胞活力和细胞分化检测

脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。自2001年Zuk等发现脂肪中存在ADSCs以来，多个实验室都进行了不同方面和不同程度的研究，研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。近年来的研究表明，ADSCS可以分化为心肌细胞，从而提供了一个新的治疗手段。Yamada等还从棕色脂肪组织中分离获得ADSCs后，分别在体外进行了诱导分化和在体内进行移植修复心脏的研究。我们的实验表明，ADSCs可以在明胶水凝胶材料表面培养和包埋在材料当中进行三维培养，细胞生长状况良好。采用5-氮杂胞苷进行诱导以后，脂肪间充质干细胞可以分化为心肌细胞。

一、试验方法

1、采用脂肪间充质干细胞ADSCs，研究该材料对干细胞培养和分化的支持

脂肪间充质干细胞ADSCs的原代培养：取体质量120～150g SD大鼠经麻醉后断颈处死，置于75％乙醇中浸泡10min后移入超净台；剪开腹股沟处的皮肤，暴露皮下脂肪组织，尽量避开血管，钝性分离脂肪组织，将所获得的脂肪组织用眼科剪反复剪碎；将剪碎后的脂肪组织移入离心管中，加入等体积的0.1％I型胶原酶，在37℃恒温摇床振荡消化40min；加入同体积基础培养液(含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液)，以中和消化液并稀释细胞，用吸管反复吹打混匀，1 500rpm离心8min，获得下层细胞沉淀物；加入基础培养液重悬细胞，以1 500rpm离心5min，去上清，加入基础培养液重悬细胞；经200目滤网过滤细胞悬液后，接种至25cm²培养瓶内，在饱和湿度、5％CO₂、37℃标准环境下培养。

脂肪间充质干细胞在水凝胶表面的二维培养以及包埋在水凝胶材料当中的三维培养：培养方法和检测方法与试验例2描述的方法相同(心肌细胞，的二维培养和三维培养方法)

2、Alamar-Blue法检测ADSCs细胞的增殖能力

消化ADSCs细胞，收集细胞悬液，同时，按照实施例1制备明胶和mTG酶混合溶液，将细胞悬液与之混合，混合溶液中细胞密度为5×10⁴个/ml,然后将混合溶液接种到96孔板中，每孔接种50μl，每组设3个复孔，分别在接种细胞后的第1、3、5、7、9天加入Alamar-Blue试剂测定细胞的代谢活性，37℃孵化30min后，收集反应液，用多功能酶标仪在激发光530nm、发射光590nm处测定荧光值。

3、扫描电镜观察

按照第10节制备mTG酶交联的明胶/ADSCs细胞材料，培养5天后将标本用2.5％的戊二醛固定，PBS冲洗3遍,梯度酒精脱水干燥，表面喷金之后采用扫描电镜观察。

4、ADSCs细胞向心肌细胞分化的实验观察

按照上述第10节的方法培养ADSCs细胞，将细胞传代到P1代，按照5×10⁴个/ml密度接种到6孔培养板。接种次日，实验组每孔加入10μM 5-氮杂胞苷，诱导24小时后，更换为正常的细胞培养液，继续培养14天，然后采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白，并且用RT-PCR检测心肌细胞特异的mRNA的表达。

二、试验结果

1、倒置相差显微结果

结果如图5所示：在胶原凝胶形成及ADSC细胞培养早期,实验组与对照组细胞的形态差别不大。实验组细胞在24h内ADSC细胞即与凝胶相互黏附,并在三维凝胶内呈树枝状伸展,第7天可见细胞周围伪足纤细而丰富,且伪足与邻近的细胞相连。对照组细胞在凝胶内黏附较慢,细胞周围伪足少,多呈梭形生长。

细胞在明胶水凝胶内呈树枝状生长,伸展性较好。第14天(右上图)以后细胞相互联结形成，网状生长。下面两张图分别是用HE染色(左下图)和Masson染色(右下图)得到的结果。从图中可以看到，而其染色的细胞胞浆和细胞核清晰饱满，细胞生长状况良好。Masson染色表明细胞形成了比较紧密的结合，呈现出网状生长，而且分泌了很多的胶原纤维。

2、细胞在2D水凝胶表面和包埋在3D水凝胶中的荧光显微镜观察

如图6～7所示，采用明胶水凝胶/细胞回构成的细胞片结构完整、呈白色薄膜状，有一定韧性和可操作性，相差显微镜下见细胞紧密连接，细胞间基质固缩，胞间距消失，形态发生变化，细胞呈短梭形，边界不清。多层叠加的细胞片贴合紧密，韧性增加，其三维形态更立体。从图中可以看到，细胞在水凝胶表面生长状况良好，细胞能够自由的铺展生长，而当细胞包埋在3D材料内部的时候，细胞明显的朝着各个方向伸展，从钙黄绿素AM染色的结果来看，活细胞占据了绝大部分的比例，凋亡的细胞非常少。

3、细胞增殖率

培养的第1-12天测定细胞的代谢活性发现。实验组与对照组的细胞均随培养时间延长而明显增生,而组间的比较差异无统计学意义(图8)。

4、扫描电镜观察和分析

采用扫描电镜观察细胞在水凝胶材料上的粘附情况。从图9中可以看到，细胞在明胶水凝胶材料上粘附情况良好。

实验结果说明，本发明心肌补片中的细胞生长良好。

综上，本发明水凝胶支架具有如下性能：1)良好的生物相容性；2)合适的机械强度和理想的操作性；3)细胞生长良好,呈树枝状,更接近于生理状态；4)可量化控制，可根据需要构建大小和厚度，构建的组织更接近于正常组织。

本发明心肌补片采用多层水凝胶支架叠加的方式，细胞片叠加的结构与营养物质的代谢，构成具有血管图案的复合结构，可以有效促进营养物质的交换，通过我们的实验发现由此构成的多层结构适合心肌细胞的生长，没有发生任何由于营养物质供应不济而导致的细胞片坏死现象，临床应用前景良好。

Claims

1.一种水凝胶支架，其特征在于：它是由如下方法制备而成：

(1)取明胶制备浓度为4-10％w/v的明胶溶液，再制备转谷氨酰胺酶溶液，按照每克明胶添加不低于5U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中，混匀，得水凝胶溶液；

(2)在水凝胶溶液中，加入细胞，混匀，得含有细胞的水凝胶溶液，成胶，即可。

2.根据权利要求1所述的水凝胶支架，其特征在于：步骤(1)中，所述明胶溶液的浓度为10％；按照每克明胶添加5-40U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中，优选地，按照每克明胶添加10U单位转谷氨酰胺酶的比例，将转谷氨酰胺酶溶液加入到明胶溶液中；和/或，所述的转谷氨酰胺酶溶液的浓度为10％w/v。

3.根据权利要求1所述的水凝胶支架，其特征在于：步骤(2)中，所述水凝胶溶液中的细胞浓度为1×10⁴～1×10⁶个/ml。

4.根据权利要求1所述的水凝胶支架，其特征在于：步骤(2)中，所述细胞为脂肪间充质干细胞或者心肌细胞。

5.根据权利要求1所述的水凝胶支架，其特征在于：步骤(2)中，成胶的方法是37℃恒温孵育2小时。

6.根据权利要求1所述的水凝胶支架，其特征在于：所述水凝胶支架为水凝胶支架片，其厚度为0.5～2mm，优选1mm。

7.根据权利要求6所述的水凝胶支架，其特征在于：所述水凝胶支架片的一个表面有沟道，沟道的深度为0.1～0.5mm，优选0.3mm，宽度为0.3-0.5mm，沟道之间的间距为0.5-1mm。

8.根据权利要求6或7所述的水凝胶支架，其特征在于：步骤(2)中，将含有细胞的水凝胶溶液浇筑到模具上，再成胶。

9.一种心肌补片，其特征在于：它由2～4层权利要求1～8任意一项所述的水凝胶支架片重叠而成。

10.权利要求1～8任意一项所述的水凝胶支架片和权利要求9所述的心肌补片在制备损伤修复材料中的用途。