CN105726726A - 中药黄连与吴茱萸的提取物联合5-氟尿嘧啶在制备治疗肠癌药物中的应用 - Google Patents

中药黄连与吴茱萸的提取物联合5-氟尿嘧啶在制备治疗肠癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了中药黄连与吴茱萸的提取物（左金方）与5?FU联合在制备治疗肠癌的药物中的用途。左金方与5?FU联合用药，显著提高了细胞的存活率，大幅降低了5?FU的毒副作用，通过促进细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl?2、Survivin蛋白的低表达，促进肠癌细胞HT?29的凋亡，比左金方，或者5?FU单独用药对肠癌的治疗效果更好。

Description

中药黄连与吴茱萸的提取物联合5-氟尿嘧啶在制备治疗肠癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及中药复方左金方与化疗药物联合治疗的新用途。
背景技术
大肠癌是消化***中常见的恶性肿瘤之一，包括结肠癌和直肠癌，每年全球有约120万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌，其发病率和死亡率分别位于第三位和第四位。男性结直肠癌的发病率高于女性，结直肠癌发病率在40岁以下年龄段较低，但会随着年龄的增大而增加。大肠癌是中国最常见也是目前最受关注的恶性肿瘤之一。从90年代开始，发达国家的结直肠癌发病率开始逐年下降，但是中国等亚洲发展中国家仍逐年上升，在男性患者中这一流行病学特征更加明显，严重威胁着人类的身体健康。
手术被认为是目前治疗结肠癌的主要手段,但由于结肠癌发病的隐蔽性和诊疗手段的局限性,多数结肠癌发现时已进入结肠癌发病中晚期,不适于手术治疗。目前临床上对肠癌一般采取以化疗为主、放疗、生物免疫治疗等为辅的治疗手段。但化疗有巨大的不良反应,导致急性肝损伤和肾脏损伤等,大大限制了化疗药物用量,阻碍了药物功效的发挥,此外放疗治疗容易导致放射性脑、脊髓损伤、放射性脑神经损伤、放射性唾液腺损伤以及放射性的后诱发癌等并发症。
因此，中医药结合化疗治疗中晚期肠癌越来越显出优势。中医药对大肠癌的治疗研究已经涉及肿瘤发生、发展、死亡、衰老等领域，在大肠癌治疗中发挥了积极的作用。大量医疗实践证明：中医药配合大肠癌手术切除后的辅助治疗(化学、靶向、基因、放射、内分泌、生物疗法等)，对降低复发、减轻毒副反应、延长病人生存期、提高患者生活质量都有明显的优势.此外，中医药的成本相对较低，实用性广。但是中药抗肠癌制剂单调，疗效不确切，目前尚无具有广泛治疗作用的临床制剂问世，大多数中药制剂为辅助治疗用药，其临床应用缺乏规范，且应用效果不理想，严重制约了抗肠癌中药及其复方的广泛应用和得到国际社会的认可。
左金方(ZoujinPerscription)出自《丹溪心法》，由君药黄连(CoptischinensisFr)和佐使药吴茱萸(Evodiarutaecarp(Juss.)benth.)按6：1重量比例组成，被各药典收载，其药性偏寒，主治肝郁化火，胃失和降，胁痛脘痞、呕吐吞酸、嘈杂似饥、脉弦数而口苦舌赤等偏于胃火较甚者。现代医理研究表明左金方有保护胃粘膜、抑制胃酸分泌、抗溃疡、影响胃肠运动的作用。目前临床常用于急慢性胃炎和消化性溃疡。近来，研究证明左金方能诱导体外培养肠癌细胞HT-29的凋亡，它通过上调肿瘤组织中的Bax蛋白的表达，降低Bcl-2和Survivin蛋白的表达，显著抑制了人肠癌裸小鼠移植瘤的生长。
目前以术前氟尿嘧啶(5-FU)为基础的放化疗是局部晚期直肠癌的标准治疗。5-FU是放疗增敏剂，但对有远处转移患者的治疗效果不佳，会带来一些如***和性功能损伤的问题，且不能使生存期进一步延长。所以，由于5-FU具有生物利用度低，对肿瘤细胞选择性小，毒副作用大，治疗剂量与中毒剂量接近等缺点，大大限制了其临床应用。
中国专利申请101785807A公开了质量比为6：1的中药黄连与吴茱萸的提取物在制备治疗胃癌药物中的应用，以及中药复方左金方在制备治疗胃癌药物中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU(5-氟脲嘧啶)联合在制备治疗肠癌药物中的用途。
根据本发明的一方面，中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU(5-氟脲嘧啶)联合用于治疗肠癌，优选的是将质量比为6：1的中药黄连与吴茱萸的提取物与化学治疗剂5-氟脲嘧啶联合应用，更优选的是以中药复方左金方的制备方式制备所述提取物，因此复方左金方以及依据该复方制备的左金丸均包含在本发明范围内，此外，本领域技术人员可以理解的是，以左金方为基础药方，添加其他辅助药材制备的复方药物也包含在本发明中。在肠癌的治疗中，所述联合是指同时给药或者序惯给药，即在给予患者提取物之前或者同时或者之后给予5-FU。
本发明通过细胞体外试验证明，中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU联合用药比提取物单独，或者5-FU单独用药对肠癌的治疗效果更好。中药黄连与吴茱萸的提取物与5-FU联合用药，显著提高了FHC人正常结肠直肠粘膜上皮细胞的存活率，大幅降低了5-FU的细胞毒性作用，通过促进HT-29细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2、Survivin蛋白的低表达，促进人肠癌细胞的凋亡。本发明的研究成果对降低临床抗肠癌化疗药物的毒副作用，提高治疗效果，具有重大的意义。
附图说明
图1是本发明左金方作用于FHC人结肠直肠粘膜上皮细胞的CCK-8试验结果，显示提取物浓度、作用时间与FHC存活率的关系；
图2是本发明5-FU作用于FHC人结肠直肠粘膜上皮细胞的CCK-8试验结果，显示5-FU浓度、作用时间与FHC存活率的关系；
图3是本发明左金方作用于结肠癌细胞HT-29的流式细胞仪检测结果，显示提取物浓度、作用时间与HT-29凋亡率的关系；
图4是本发明5-FU作用于结肠癌细胞HT-29的流式细胞仪检测结果，显示5-FU浓度、作用时间与HT-29凋亡率的关系；
图5是空白对照，1.00μg/mL左金方，50.0μg/mL5-FU以及1.00μg/mL左金方联合50.0μg/mL5-FU分别作用FHC细胞24h的CCK-8试验结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提取物联合5-FU与FHC存活率的关系；
图6是空白对照，1.00μg/mL左金方，100.0μg/mL5-FU以及1.00μg/mL左金方联合100.0μg/mL5-FU分别作用FHC细胞24h的CCK-8试验结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提取物联合5-FU与FHC存活率的关系；
图7是空白对照，1.00μg/mL提取物，50.0μg/mL5-FU，1.00μg/mL提取物联合50.0μg/mL5-FU分别作用HT-29细胞的流式细胞仪检测结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提取物联合5-FU与HT-29凋亡率的关系；
图8是空白对照，1.00μg/mL提取物，100.0μg/mL5-FU，1.00μg/mL提取物联合100.0μg/mL5-FU分别作用HT-29细胞的流式细胞仪检测结果，显示特定浓度的提取物、5-FU、提取物联合5-FU与HT-29凋亡率的关系；
图9是空白对照，1.00μg/mL左金方，100.0μg/mL5-FU，1.00μg/mL左金方联合100.0μg/mL5-FU分别作用HT-29细胞24h，调节细胞中BAX、Bcl-2和Survivin蛋白表达的WesternBlotting凝胶电泳图(n＝6)；
图10是空白对照，1.00μg/mL提取物，50.0μg/mL5-FU，100.00μg/mL5-FU，1.00μg/mL提取物联合50.0μg/mL5-FU以及1.00μg/mL提取物联合100.0μg/mL5-FU分别作用HT-29细胞的细胞形态学显微镜观察图(×200)。
具体实施方式
一、试验材料
细胞株：FHC细胞(人正常结肠直肠粘膜上皮细胞)、HT-29细胞(人结肠癌细胞)购自中山大学动物实验部细胞中心。用含有体积分数为10％的FBS的DMEM完全培养基，于37℃，5％的CO2孵箱中培养3天进行一次传代，传代按1：3进行。取生长期细胞进行实验。
中药黄连与吴茱萸的提取物(下称提取物或左金方)：中药黄连(CoptischinensisFr)与吴茱萸(Evodiarutaecarp(Juss.)benth.)为市售购买，按6：1质量混合，经水煎、浓缩和冷冻干燥制成水提物。原药材经水提后，得到水提物260(mg)/生药(g)。
左金方传统汤剂冻干粉：由本实验室提供，取30g黄连与5g吴茱萸，加8倍蒸馏水浸泡30min，加水煎煮3次，每次30min，过滤，合并3次滤液，冷冻干燥，每克干粉含生药3.98g；经HPLC法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85％，巴马汀9.19％，药根碱4.86％，吴茱萸碱0.17％，吴茱萸次碱0.19％。
制备成试验中给药浓度的左金方的方法：将左金方冻干粉溶于去离子水中，配置成1mg/mL的母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。
5-FU：购自天津金耀氨基酸有限公司，规格：10ml：0.25g，批号：1412011。
制备成试验中给药浓度的5-FU的方法：取适量5-氟尿嘧啶注射液原液加细胞培养液配制成1mg/ml母液，实验时用细胞培养液稀释成所需浓度。
二、检测方法及数据统计方法
1、CCK-8检测细胞活性
采用CCK-8检测试剂盒在规定时间内观察左金方或者5-FU或者左金方联合5-FU对培养FHC细胞的存活率的影响，其中将未经处理的对照组细胞的存活率设定为100％。
2、流式细胞仪检测细胞凋亡率
调整HT-29细胞密度为2×105/mL，以1.5mL/well种入6孔板。每组6个复孔。药物作用24h后，细胞刷刮取细胞，800r·min-1离心5min，去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/mL。取适量于流式管中，加入工作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块,室温避光染色15min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率(激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI)。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。
3、细胞形态学观察
将HT-29细胞(2×105/mL)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4％多聚甲醛(pH为7.4)于37℃固定细胞30min，PBS液洗两次，加5mg/LHochest33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液(20mmol/L柠檬酸，50mmol/L磷酸氢二钠，50％甘油，pH5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。
4、统计学处理
以上全部数据均采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析(One-wayANOVA)检验。
【实施例1】左金方或者5-FU单独用药对FHC细胞存活率的影响
1.1左金方对FHC细胞存活率的影响
取人正常结肠直肠粘膜上皮细胞FHC对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液(5×104/mL)加入96孔板，100μL/孔，培养12h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药物，分别培养24、48h，向每孔加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD)。细胞抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
CCK-8实验结果如表1所示。表1列出了不同浓度的左金方作用于FHC细胞24h和48h后FHC细胞的存活率(n＝6)。
表1不同浓度的左金方作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(n＝6)
*：与对照组相比p<0.05；**：与对照组相比p<0.01；
图1为表1的曲线图，从图1可以更加直观地看出左金方与FHC细胞存活率的关系。
CCK-8实验结果显示：1)左金方对FHC细胞活力的影响很小，即当给药浓度增加到一定程度后，随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞活力稍有减弱；2)小剂量的左金方能促进人正常结肠直肠粘膜上皮细胞的增殖和***。
1.25-FU对FHC细胞存活率的影响
取人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液(5×104/mL)加入96孔板，100μL/孔，培养12h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药物，分别培养24、48h，向每孔加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD)。其中将未经处理的对照组细胞的存活率设定为100％。细胞抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
CCK-8实验结果如表2所示。表2列出了不同浓度的5-FU作用于FHC细胞24h和48h后FHC细胞的存活率(n＝6)。
表2不同浓度5-FU作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(n＝6)。
*：与对照组相比p<0.05；**：与对照组相比p<0.01
图2为表2的曲线图，从图2可以更加直观地看出5-FU与FHC细胞存活率的关系(n＝6)。
从试验结果可知：1)5-FU对FHC细胞的活力的影响呈现“浓度-时间依赖性”的关系，即随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞活力逐渐减弱；2)与左金方不同，小剂量的5-FU会引起细胞毒性，随着用药浓度增加，其毒性亦增强。
【实施例2】左金方或者5-FU单独用药对HT-29细胞凋亡率的影响
2.1左金方对HT-29细胞凋亡率的影响
取HT-29对数生长期细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2×105/mL，以1.5mL/well种入6孔板。每组6个复孔，培养12h，然后加入相应的药物作用24h，细胞刷刮取细胞，800r·min-1离心5min，去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/mL。取适量于流式管中，加入工作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块,室温避光染色15min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。
试验结果如表3所示。表3列出了不同浓度的左金方作用于HT-29细胞24h后，HT-29细胞的凋亡率(n＝6)。
表3不同浓度左金方作用24h对HT-29细胞凋亡率的影响(n＝6)
*：与对照组相比p<0.05；**：与对照组相比p<0.01
图3为表3的曲线图，从图3可以更加直观地看出5-FU与HT-29细胞凋亡率的关系(n＝6)。
从试验结果可知：1)左金方对HT-29凋亡率的影响呈现“浓度-时间依赖性”的关系，即随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加；2)小剂量的左金方就能促进HT-29细胞的凋亡。
2.25-FU对HT-29细胞凋亡率的影响
取对数生长期细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2×105/mL，以1.5mL/well种入6孔板。每组6个复孔，培养12h，然后加入相应的药物作用24h，细胞刷刮取细胞，800r·min-1离心5min，去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/mL。取适量于流式管中，加入工作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块,室温避光染色15min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。
试验结果如表4所示。表4列出了不同浓度的5-FU作用于HT-29细胞24h后HT-29细胞的凋亡率(n＝6)。
表4不同浓度的5-FU作用24h对HT-29细胞凋亡率的影响(n＝6)
*：与对照组相比p<0.05；**：与对照组相比p<0.01
图4为表4的曲线图，从图4可以更加直观地看出5-FU与HT-29细胞凋亡率的关系。
从试验结果可知：1)5-FU对HT-29凋亡率的影响呈现“浓度-时间依赖性”的关系，即随着给药浓度的增加，作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐增加；2)50.00ug·mL-1与100.00ug·mL-15-FU作用HT-29细胞24h后的细胞凋亡率分别为(50.40±1.45)％和(65.30±1.27)％。
【实施例3】左金方与5-FU联合用药
3.1联合用药浓度的选定
左金方浓度为1.00ug·mL-1时，作用FHC细胞24h，细胞存活率为(106.68±1.65)％，48h为(100.16±1.23)％，作用HT-29细胞24h，细胞凋亡率为(37.90±1.06)％，选定1.00ug·mL-1为左金方联合用药的浓度。
3.25-FU联合用药浓度的选定
5-FU浓度为50.00ug·mL-1时，作用FHC细胞24h，细胞存活率为(47.76±1.48)％，48h为(37.69±1.62)％，作用HT-29细胞24h，细胞凋亡率为(50.40±1.45)％。
5-FU浓度为100.00ug·mL-1时，作用FHC细胞24h，细胞存活率为(42.42±1.74)％，48h为(32.79±1.95)％，作用HT-29细胞24h，细胞凋亡率为(65.30±1.27)％，选定50.00、100.00ug·mL-1为5-FU联合用药的浓度。
3.3左金方与5-FU联合用药对FHC细胞存活率的影响
取人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC对数生长期细胞，用DMEM培养基制成细胞悬液(5×104/mL)加入96孔板，100μL/孔，培养12h后给药，实验组分别加入不同浓度供试药物，分别培养24、48h，向每孔加入10μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD)。细胞抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。
试验结果如表5、表6所示。表5、表6列出了对照组，1.00ug·mL-1左金方，50.00ug·mL-15-FU以及二者联合用药分别作用于FHC细胞24h和48h后FHC细胞的存活率(n＝6)。
表5左金方与5-FU联合用药作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(n＝6)
*：联合用药组与左金方1.00ug·mL-1组相比p<0.05；#：联合用药组与5-FU50.00ug·mL-1组相比p<0.05
图5为表5的曲线图，从图5可以更加直观地看出左金方与50.00ug·mL-15-FU联合用药24h与FHC细胞存活率的关系。
表6列出了对照组，1.00ug·mL-1左金方，100.00ug·mL-15-FU以及二者联合用药分别作用于FHC细胞24h和48h后FHC细胞的存活率(n＝6)。
表6左金方与5-FU联合用药作用不同时间对FHC细胞存活率的影响(n＝6)
*：联合用药组与左金方1.00ug·mL-1组相比p<0.05；#：联合用药组与5-FU100.00ug·mL-1组相比p<0.05
图6为表6的曲线图，从图6可以更加直观地看出左金方与100.00ug·mL-15-FU联合用药24h与FHC细胞存活率的关系。
从试验结果可知：左金方与5-FU联合用药可大幅度地提高人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC的细胞存活率。联合用药组与左金方和5-FU单独用药相比p<0.05，有显著的统计学差异，即联合用药组的细胞保护作用优于各单独用药组。
3.4左金方与5-FU联合用药对HT-29细胞凋亡率的影响
取对数生长期细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为2×105/mL，以1.5mL/well种入6孔板。每组6个复孔，培养12h，然后加入相应的药物作用24h，细胞刷刮取细胞，800r·min-1离心5min，去上清，加入PBS重悬，调整细胞浓度为1×106/mL。取适量于流式管中，加入工作液500uL，再加入荧光染料，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块,室温避光染色15min后，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的总和代表细胞调亡率。
试验结果如表7、表8所示。表7、表8列出了对照组，选定浓度的左金方，选定浓度的5-FU，以及选定浓度的左金方联合选定浓度的5-FU作用于HT-29细胞24h后，HT-29细胞的凋亡率(n＝6)。
表7左金方与5-FU联合用药作用24小时对HT-29细胞凋亡率的影响(n＝6)
*：联合用药组与左金方1.00ug·mL-1组相比p<0.05；#：联合用药组与5-FU50.00ug·mL-1组相比p<0.05
图7为表7的曲线图，从图7可以更加直观地看出左金方与5-FU联合用药与HT-29细胞凋亡率的关系。
表8左金方与5-FU联合用药作用24小时对HT-29细胞凋亡率的影响(n＝6)
*：联合用药组与左金方1.00ug·mL-1组相比p<0.05；#：联合用药组与5-FU100.00ug·mL-1组相比p<0.05
图8为表8的曲线图，从图8可以更加直观地看出左金方与5-FU联合用药与HT-29细胞凋亡率的关系。
从试验结果可看出，1.00ug·mL-1左金方分别与50.00ug·mL-1、100.00ug·mL-15-FU联合用药作用于HT-29细胞24h后，细胞凋亡率大幅度提高，联合用药组与左金方和5-FU单独用药相比p<0.05，有显著的统计学差异，即联合用药组诱导凋亡的作用优于各单独用药组。
3.5左金方与5-FU联合用药对Bcl-2、Bax和Survivin蛋白的影响
提取蛋白：将PMSF10μL加入到1mL细胞裂解液RIPA，取经药物作用后的细胞约2.4×106个加入该RIPA，在冰上裂解30min后，10000r·min-1离心10min，取上清。
BCA测定蛋白浓度，酶标仪测定波长为A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。灌制12％分离胶，4％浓缩胶的SDS-PAGE凝胶。吸取80μg总蛋白,恒压100V电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部。湿法电转恒压100V,120min，将蛋白从SDS-PAGE凝胶转至PVDF膜。3％的脱脂奶粉/PBS-T封闭,按1:500稀释Rabbitanti-Bcl-2/-Bax/-Survivin，4℃孵育过夜。1:3000稀释二抗Goatanti-RabbitIgG,孵育1h,增强化学发光(enhancedchemiluminescence,ECL)显影。UVI凝胶成像***摄像。
图9列出了空白对照，1.00μg/mL左金方，100.0μg/mL5-FU以及1.00μg/mL左金方联合100.0μg/mL5-FU分别作用HT-2924h后，调节细胞中BAX、Bcl-2和Survivin蛋白表达的WesternBlotting的凝胶电泳图(n＝6)。
从试验结果可看出：1.00ug·mL-1左金方、100.00ug·mL-15-FU分别作用HT-29细胞24h后，Bax的表达增加,而Bcl-2和Survivin蛋白的表达减少；左金方联合5-FU(1.00+100.00)联合用药作用24h，Bax的表达进一步增加,而Bcl-2和Survivin蛋白的表达进一步减少，与各单独用药组比较P<0.05，差异显著。
3.6左金方与5-FU联合用药对HT-29细胞形态学的影响
将HT-29细胞(2×105·mL-1)接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予相应的药物，加入新鲜配制的4％多聚甲醛(pH为7.4)，于37℃固定细胞30min，PBS液洗2次，加5mg/LHochest33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液(20mmol·L-1柠檬酸，50mmol·L-1磷酸氢二钠，50％甘油，pH5.5)封片后荧光显微镜观察、摄片。
试验结果如图10所示，图10是空白对照，1.00μg/mL左金方，50.0μg/mL5-FU，100.00μg/mL5-FU，1.00μg/mL左金方联合50.0μg/mL5-FU以及1.00μg/mL左金方联合100.0μg/mL5-FU作用于HT-2924h的细胞形态学显微镜观察图(×200)。
从试验结果可看出，经Hoehest33258荧光染色后，荧光显微镜下见空白组HT-29细胞膜均完整，核形态饱满，核质着色浅，密度均匀一致，见图10A；1.00ug·mL-1左金方、50.00ug·mL-15-FU、100.00ug·mL-15-FU作用24h后，细胞出现典型凋亡形态特征：细胞膜皱缩，细胞核相对变小荧光明显增强，成高度块状，见图10B、10C、10D；左金方+5-FU(1.00+50.00)、左金方+5-FU(1.00+100.00)联合用药作用24h，细胞除上述特征外,可见凋亡小体数目明显多于各单独用药组，见图10E、10F。
综上可得，左金方与5-FU联合用药比左金方，或者5-FU单独用药对肠癌的治疗效果更好，左金方与5-FU联合用药，显著提高了人正常结肠直肠黏膜上皮细胞FHC的细胞存活率，大幅降低了5-FU的细胞毒性作用，通过促进肠癌细胞HT-29细胞中Bax蛋白的高表达和Bcl-2、Survivin蛋白的低表达，促进结肠癌细胞的凋亡。本发明的研究成果对降低临床抗肠癌化疗药物的毒副作用，提高治疗效果，具有重大的意义。

Claims (7)

1.中药黄连与吴茱萸的提取物与5-氟尿嘧啶联合在制备治疗肠癌的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述中药黄连与吴茱萸的提取物为质量比为6：1的中药黄连与吴茱萸的提取物。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述提取物为水提物。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述联合为将5-氟尿嘧啶在中药黄连与吴茱萸的提取物之前、同时或者之后给予患者。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述中药黄连与吴茱萸的提取物按照中药复方左金方的方法制备。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述左金方的制备方法包括：取30g黄连与5g吴茱萸，加8倍蒸馏水浸泡30分钟，加水煎煮3次，每次30分钟，过滤，合并3次滤液，冷冻干燥，每克干粉含生药3.98g；经HPLC法测定，左金方冻干粉中含小檗碱39.85％，巴马汀9.19％，药根碱4.86％，吴茱萸碱0.17％，吴茱萸次碱0.19％。
7.如权利要求1所述的用途，其中所述肠癌为结肠癌。
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