CN105713862B - 可降解吡啶和氨氮的菌株及其应用 - Google Patents

可降解吡啶和氨氮的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可降解吡啶和氨氮的菌株，其特征在于：它于2014年4月25日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号CCTCC M 2014165，该菌株属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)，命名为Arthrobacter ureafaciens CZ3。本发明提供的菌株除对高浓度吡啶具有高效降解能力外，还对环境污染物氨氮具有很高的耐受能力和高效去除能力，不产生二次污染、使用安全。在处理含高浓度吡啶的工业废水及含高浓度氨氮废水的生物治理中，均具有广泛的应用前景和很高的推广价值。

Description

可降解吡啶和氨氮的菌株及其应用
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株可高效降解吡啶和氨氮的菌株及其应用。
背景技术
吡啶作为工业溶剂和多种化合物合成的基础化工原料，应用于农药、医药、染料、日用化工、香料、饲料添加剂、橡胶助剂等领域。吡啶是典型的含氮杂环化合物，易溶于水，容易扩散进入环境，且难以生物降解，严重威胁人类的健康，属于“三致”类环境污染物。
与传统物理化学处理法相比，生物修复具有高效、投入资金少、运营成本低、且较少产生二次污染，生态可承受等优点，能够高效治理大面积的污染，大量的微生物对环境可以起到一定的修复作用，通过生物修复，可以使受污染生态***恢复正常的生态功能及效应，其在环境污染治理中占有极其重要的地位。目前已从环境中筛选出一些对吡啶具有一定的降解能力的细菌，但大多耐受及降解吡啶的能力较低。
吡啶降解菌在降解吡啶的过程中会产生代谢产物氨，氨的积累会对吡啶降降解产生反馈抑制，从而显著降低该菌的吡啶降解能力，这也是目前所筛选的吡啶降解菌降解能力不强的重要原因之一。而且氨氮本身就是一种广泛存在于工农业及生活废水中的环境污染物，若扩散进入环境会造成极大的危害，是引起水体富营养化的主要成因之一，同时废水中存在的高浓度氨氮会显著抑制微生物的生长及代谢，也对吡啶及其他污染物的生物降解及环境的生物修复带来显著的负面影响，而目前筛选和应用于氨氮废水处理的氨氮降解菌大多降解能力较弱，不能在短时间内快速降低废水中的氨氮浓度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对目前吡啶降解菌降解能力较低，对氨氮的耐受力不强的状况，能降解高浓度吡啶且耐受氨氮的菌株，该菌株可用于含高浓度吡啶废水的生物强化处理。
另一个目的是针对部分类型废水中氨氮浓度较高的特点，检测所筛选菌株耐受及降解高浓度氨氮的能力，并将其应用于高浓度氨氮废水处理。
为实现上述目的，本发明提供的可高效降解吡啶和氨氮的菌株，它于2014年4月25日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号CCTCC M 2014165，该菌株属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)，命名为Arthrobacter ureafaciens CZ3。
上述可高效降解吡啶和氨氮的菌株的制备方法，包括以下步骤：
(1)、从焦化废水生化处理车间曝气池和二沉池中取样，将污泥置于三角瓶中，放置玻璃珠，于150-200rpm，30℃-33℃，震荡25-35min，每3000g离心10-12min，收集沉淀，将污泥沉淀接种至LB培养基，加入浓度300mg/L的吡啶；
(2)、定向驯化和初筛：至步骤(1)中吡啶降解完，按体积分数5％转接于浓度为500mg/L的MSP液体培养基中，该培养基以吡啶作为唯一碳、氮源和能源，如此反复，继续增加吡啶浓度，依次增加至800mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L，3000mg/L；将驯化后的菌液按10-2-10-7不同稀释比例铺MSP固体平板，挑单菌落，在LB固体平板划线纯化三次，将纯化后的单菌落分别保种；
(3)、复筛：将步骤(2)中初步筛选的吡啶降解菌接种至MSP培养基中，该培养基以浓度为2000mg/L的吡啶作为唯一碳源和能源，HPLC检测不同细菌的吡啶降解率，筛选吡啶降解菌，筛选在30-32小时内完全降解2000mg/L吡啶的菌株。
上述的可降解吡啶和氨氮的菌株应用于含吡啶废水的处理。
进一步地，上述可降解吡啶和氨氮的菌株，应用于吡啶浓度低于3000mg/L的废水处理。
上述的可降解吡啶和氨氮的菌株应用于浓度高于4000mg/L的高浓度氨氮(NH4 +-N)废水生物处理中。
本发明的有益效果在于，针对高浓度吡啶对细菌生长会产生显著抑制，对吡啶降解菌进行初步驯化和筛选后，采用高浓度吡啶作为唯一碳、氮源和能源进一步筛选吡啶降解菌，获得了一株能以吡啶作为唯一碳、氮源和能源生长的高效吡啶降解菌Arthrobacterureafaciens CZ3。将菌株CZ3应用于含吡啶废水的实验结果表明，该菌具有高效降解高浓度吡啶的能力，菌株CZ3在32小时内即可完全降解2329mg/L吡啶，与其他吡啶降解菌相比，具有较强的吡啶降解能力，可应用于含高浓度吡啶废水的生物强化处理。
本发明还进一步将CZ3应用于含高浓度氨氮废水的处理中，在2617mg/L的高氨氮初始浓度的模拟废水中，CZ3的氨氮去除速率可达104.1mg-N/l/h，具有较强的氨氮快速去除能力和很高的氨氮耐受力。
附图说明
图1为本发明所述菌株CZ3菌落形态(图1A为LB培养基；图1B为MSP培养基)；
图2为本发明所述菌株CZ3不同培养时期扫描电镜图(A.8h，B.12h，C.16h，D.26h)；
图3为本发明所述不同初始吡啶浓度对吡啶降解的影响；
图4为本发明所述不同初始吡啶浓度对菌株生长的影响；
图5为本发明所述不同初始氨氮浓度对氨氮降解速率的影响；
图6为本发明所述不同初始氨氮浓度对氨氮降解率的影响；
图7为本发明所述菌株的16s rRNA序列图。
具体实施方式
为便于更好的理解本发明的目的、特征以及有益效果等，现结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1吡啶降解菌的筛选和鉴定
(1)吡啶降解菌驯化和筛选
本实施例中的菌株CZ3是从武汉钢铁公司焦化废水生化处理车间曝气池和二沉池中取样，经过富集、初筛和复筛得到的。
实施例中的LB液体培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。LB固体培养基为LB液体培养基中加入1.8％琼脂。
MSP无机盐培养基组成如下：Na2HPO46.78g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.011g/L，吡啶500-3000mg/L，微量元素2ml/L。微量元素组成：MnSO4·H2O 1.69g/L，CoCl2·6H2O 0.24g/L，H3BO31.16g/L，Na2MoO4·2H2O 0.024g/L，FeSO4·7H2O2.78g/L，ZnSO4·7H2O 1.15g/L，CuSO4·5H2O 0.38g/L。MSP固体培养基含1.8％琼脂。
①富集：将3克污泥置三角瓶(放置玻璃珠)于180rpm，30℃，震荡30min，3000g离心10min，收集沉淀，将1g污泥沉淀接种至LB(加入吡啶，浓度300mg/L)培养基；
②定向驯化和初筛：至①中吡啶降解完，按体积分数5％转接于以吡啶作为唯一碳、氮源和能源，浓度为500mg/L的MSP液体培养基中，如此反复，继续增加吡啶浓度，依次增加至800mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L，3000mg/L；将驯化后的菌液按10-2-10-7不同稀释比例铺MSP固体平板，挑单菌落，在LB固体平板划线纯化三次，将纯化后的单菌落分别保种。
③复筛：将②中初步筛选的吡啶降解菌接种至吡啶(浓度约2000mg/L)作为唯一碳源和能源的MSP培养基中，HPLC检测不同细菌的吡啶降解率，筛选吡啶降解菌，筛选到一株可以在32小时左右可以完全降解2000mg/L吡啶的菌株，初步命名为CZ3，用于后续研究。
(2)菌株鉴定
从形态学、生理生化及分子遗传学三方面对CZ3进行菌株鉴定
①菌株CZ3菌落形态观察：将菌株CZ-3挑单菌落分别于营养琼脂平板和MSP固体平板划线，置生化培养箱30℃培养，24-48h后观察该菌在不同培养基中的菌落形态，见图1。在营养琼脂平板上，菌落呈现乳白色，圆形，表面光滑，边缘整齐，易挑起，置4℃放置后菌落呈现非扩散性的柠檬黄；在MSP基础无机盐平板上的菌落相对较小，半透明且无色素生成，表面平滑，易挑起，边缘***。该菌呈现革兰氏染色阳性的特征，在LB固体培养基中培养至对数期时形态为杆状或镰刀形等不规则形态，在MSP基础无机盐固体培养基中为球状，说明菌株杆球状的形态变化与培养的环境条件有关，尤其是培养基的营养条件。该菌株无鞭毛，无芽孢生成。
通过扫描电镜(SEM)进一步了解菌株外部形态特征，制备好的样品表面喷金后用扫描电镜观察细菌外部形态。扫描电镜观察菌株外部形态特征是菌种鉴定的常用方法之一，将菌株CZ3接种至完全培养基中30℃培养，在不同时期取样，制备样品后采用场发射扫描电镜观察。观察结果(如图2所示)发现，完全培养基中，细菌在不同的培养时期呈现不同的形态，是一种变形菌，在培养初期，菌株CZ3为形态不规则的长杆状，包括直、弯曲、棒状、V字形等多种形态；对数生长期时，其长度逐步缩短，菌体形态变成短杆状；至稳定期和衰亡期，杆状细胞逐步为球状细胞所取代。杆状细胞的大小0.4-0.5×1-6μm，球状细胞的直径约0.5-0.9μm。
②生理生化分析：菌株CZ3的生理生化分析结果显示该菌为革兰氏阳性，好氧，化能异养，氧化酶阴性，接触酶阳性，脲酶阳性，硝酸还原酶阳性，不能水解淀粉，不能水解酪素，能够利用柠檬酸，见表1。采用Biolog自动鉴定***对菌株CZ3的碳源氧化利用进行了鉴定。从Biolog分析的结果看，菌株CZ3可以利用95种碳源中的34种。实验结果显示该菌株最适培养温度范围为26-32℃，最适pH范围为6.5-7.5。
表1
检测项目 结果 检测项目 结果
运动性 － 菌落颜色 黄色
氧化酶 － 细胞形状 杆/球状
接触酶 + 革兰氏染色 阳性
10％NaCl － 氧气 +
硝酸盐还原 － 淀粉 －
脲酶 － 4℃ +
纤维素 － 42℃ －
③16S rRNA基因分子生物学鉴定：以提取的基因组DNA为模板，采用某科技公司合成的引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)，进行PCR扩增后测序，菌株CZ316S rRNA基因序列利用NCBI数据库进行同源性检索，将其与BLAST得到的相似性较高属的模式菌株的16S rDNA序列，采用BioEdit软件进行聚类分析，结果发现菌株CZ3与节杆菌属(Arthrobacter)细菌具有较高的序列相似性，均大于95％，与菌株A.ureafaciens DSM 20126T的16S rRNA基因序列相似性最大，达99％。综合形态学、生理生化分析、Biolog分析(主要说明菌株CZ3对不同碳源的利用情况)及16S rRNA序列比对分析结果，结合《伯杰氏***细菌学手册》等文献对Arthrobacter属细菌特征的分析和描述，CZ3在***分类学上属于放线菌门-放线菌纲-放线菌亚纲-放线菌目-微球菌亚目-微球菌科-节杆菌属(Arthrobacter)，将其命名为：Arthrobacter ureafaciens CZ3，其16srRNA序列如图7所示。
实施例2菌株CZ3在吡啶废水处理中的应用
本实施例中斜面培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，卡拉霉素50μg/mL，琼脂1.8g％。LB液体培养基配方同实施例1。种子培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，吡啶1500mg/L。采用含不同浓度吡啶的MSP无机盐培养基作为含吡啶模拟废水，MSP培养基组成同实施例1。
(1)种子培养
①挑取斜面上的菌落转移到2-5mL的LB液体培养基中，30℃，180rpm培养至对数期。
②将步骤①中培养的菌液按3％接种至种子培养基，30℃，180rpm培养至对数期作为种子液。
(2)含吡啶废水降解
配制吡啶浓度分别为463、932、1436、1879、2329mg/L的MSP作为模拟废水，将种子液按体积分数3％接种至模拟废水，检测细胞生长量和吡啶降解率，分析CZ3在不同浓度吡啶废水中的生长和吡啶降解情况。
根据实验结果(如图3和图4所示)，菌株CZ3可以分别在12、16、27、30和36小时完全降解浓度463、932、1436、1879、2329mg/L的吡啶。虽然在吡啶模拟废水处理的初期，高浓度吡啶条件下的吡啶降解率和生物量均低于低浓度，但从整个生长周期看，随着培养时间的延长，高浓度吡啶(实验范围内)条件下，细菌的生物量积累及吡啶降解速率显著高于低浓度，在实验中的最高初始浓度2329mg/L下，36小时左右即可将吡啶完全降解(图3)，降解速率达到约65mg-Pyr/l/h，说明经活化和诱导后，CZ3菌株对高浓度吡啶具有很强的降解能力，对于含高浓度吡啶工业废水处理也具有很高的应用价值。
实施例3菌株CZ3在氨氮废水生物处理中的应用
本实施例中斜面培养基组成同实施例2、LB液体培养基组成同实施例1。种子培养基组成：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，NH4Cl 8g/L。含氨氮模拟废水组成：Na2HPO46.8g/L，KH2PO43.0g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl20.01g/L，NH4Cl1.0g/L，葡萄糖4.0g/L，NH4Cl 0.4-15g/L，微量元素2mL/L，pH 7.0。微量元素组成：MnSO4·H2O 1.69g/L，CoCl2·6H2O 0.24g/L，H3BO31.16g/L，Na2MoO4·2H2O 0.024g/L，FeSO4·7H2O2.78g/L，ZnSO4·7H2O1.15g/L，CuSO4·5H2O 0.38g/L。
种子培养
①挑取斜面上的菌落转移到2-5mL的LB液体培养基中，30℃，180rpm培养至对数期。
②将步骤①中培养的菌液按体积分数3％接种至种子培养基，30℃，180rpm培养至对数期作为种子液。
含氨氮废水降解
将种子液按体积分数3％接种量接种至初始氨氮浓度为105、262、785、1569、2617和3926mg/L的模拟废水中，检测CZ3在不同初始浓度下对氨氮耐受及降解能力。
实验结果如图5和图6所示，氨氮浓度为105、262、785、1569、2617和3926mg/L的条件下，在14小时内(作为水力停留时间)，CZ3的氨氮降解率分别为96.9％、83.3％、62.7％、55.7％、31.5％，而降解速率分别达到7.3、18.1、46.7、70.3、104.1和88.4mg-N/l/h，结果显示在一定范围内外界氨氮浓度越高，菌株CZ3降解氨氮的速率也越大，且没有对菌株CZ3的生长产生显著抑制。当初始氨氮浓度为2617mg/L时，氨氮降解速率达到最高，为104.1mg-N/l/h，显示该菌具有很高的氨氮耐受能力及很强的降解能力，达到了在高浓度条件下快速降低氨氮浓度的目的，可以应用于含高浓度氨氮废水的生物处理中。
本发明提供的一种耐受和降解高浓度吡啶菌株的驯化和筛选方法，该菌株除对高浓度吡啶具有高效降解能力外，还对环境污染物氨氮具有很高的耐受能力和高效去除能力，不产生二次污染、使用安全。在处理含高浓度吡啶的工业废水及含高浓度氨氮废水的生物治理中，均具有广泛的应用前景和很高的推广价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种可降解吡啶和氨氮的菌株，其特征在于：它于2014年4月25日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏编号CCTCC M 2014165，该菌株属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)，命名为Arthrobacter ureafaciens CZ3。
2.一种权利要求1所述的菌株用于含吡啶废水处理的应用。
3.一种权利要求1所述的菌株用于氨氮废水生物处理中的应用。
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CN101481673A (zh) * 2009-01-13 2009-07-15 北京未名凯拓农业生物技术有限公司 吡啶降解菌及其复合菌剂、制备方法和应用
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Arthrobacter ureafaciens CZ31降解吡啶特性与氨同化研究;袁永泽等;《第十六次全国环境微生物学学术研讨会会议论文集》;20141011;第1-3段 *

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