CN106591181B - 一种迈索尔节杆菌及其在净化海水养殖含氮废水中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种迈索尔节杆菌，所述菌株保藏名称是迈索尔节杆菌7‑3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏编号为CGMCC NO.13118。同时，本发明提供的迈索尔节杆菌能够高效去除水体中的氨氮和亚硝酸盐，其可以在净化海水养殖含氮废水中得到应用。本发明提供的迈索尔节杆菌净化能力很强，将其应用于含氮废水的净化处理不仅操作简单，能够将废水中的氨氮和亚硝酸盐高效脱除掉，而且不会造成进一步的污染，有效解决了现有技术中处理废水中需要专门的处理设备、成本高以及处理效果差的问题，适宜在海水养殖含氮废水的净化中广泛使用。

Description

一种迈索尔节杆菌及其在净化海水养殖含氮废水中的应用
技术领域
本发明涉及微生物及用途，具体地说是一种迈索尔节杆菌及其在净化海水养殖含氮废水中的应用。
背景技术
近年来，随着水产养殖业的不断发展，海水养殖生物密度逐年提高，在海水养殖过程中由于饲料的过量投喂、水产动物***物的大量排放及药品的不当使用，造成了养殖水体污染的不断增加，从而对水产动物产生毒害，导致水产动物发病甚至死亡，严重影响了水产养殖的产量和效益。一般来讲，水产养殖的海水污染较为严重的污染物是氨氮和亚硝酸盐。因此，如何解决养殖海水中的氨氮和亚硝酸盐污染问题，已成为当前净化养殖海水的研究热点和难点。
目前，应用于净化海水养殖含氮废水的方法主要有物理法、化学法和生物法。其中，物理法和化学法操作相对较为复杂，需要专门的设备，操作运行成本较高，并且这两种方法对废水中有机物去除率低，容易造成二次污染，因此在实际的推广应用中受到很大局限。生物法是通过筛选微生物来有效利用或转化水体中的氨氮和亚硝酸盐等污染物，从而降低水体中的氨氮和亚硝酸盐浓度，其相对物理法和化学法相比具有安全有效、无二次污染、成本低、生态环保等优势。
传统生物脱氮处理包括硝化和反硝化两个过程，参与生物脱氮微生物主要包括硝化细菌和反硝化细菌。传统上认为反硝化作用只有在厌氧或缺氧条件下发生，在此过程中，硝酸盐依次被还原为亚硝酸、NO、N2O和N2。近几年，随着异养硝化好氧反硝化细菌的发现，为生物脱氮提供了一条新途径。目前，国内外对好氧反硝化菌的分离、筛选以及机理研究较多，而高效去除含氮污染物的优势菌种及其在净化水产养殖废水中的应用却较少，即使有为数不多的几个研究报道，也只适合于含盐量较低的淡海水的净化，因为对于普遍微生物生长来说，其生长环境的盐度仅为千分之一二，海水盐度相对较高的环境会抑制其生长，从而无法用于净化含盐量较高的海水含氮废水。因此，筛选在高盐环境下快速生长并具有高效脱氮特性的菌株，进而将其应用于含盐量较高的海水养殖含氮废水的净化处理，这对海水养殖水体的保护具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种迈索尔节杆菌，以将其应用于高盐度海水养殖含氮废水的脱氮净化处理中。
本发明的目的之二是迈索尔节杆菌在净化海水养殖含氮废水中的应用，以解决现有方法对海水养殖含氮废水的脱氮处理存在成本高、效果差、处理过程复杂的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种迈索尔节杆菌，所述菌株保藏名称是迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏编号为CGMCC NO.13118。
本发明所述的所述菌株的细胞形态呈杆状，菌落呈圆形，边缘整齐规则，不透明，菌落呈浅黄色，菌落直径0.5-1mm；为***，氧化酶实验为阴性，接触酶实验为阳性，β-半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶以及吲哚产生实验均为阴性，VP实验为阳性。
本发明所述迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3采用细菌16S rRNA基因通用引物对样本的基因进行PCR扩增，扩增结果经中国科学院微生物研究所进行序列测定，所述的迈索尔节杆菌的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示；测定结果提交GenBank数据库经Blast同源性比对，结果表明迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的16S rRNA基因序列与Arthrobacter mysorens相似度达到99.23％。经中国科学院微生物研究所根据菌种的细胞形态、生理生化特征、16sRNA基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰氏***细菌学手册》以及International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology有关研究论文，本发明提供的菌株为迈索尔节杆菌(Arthrobactermysorens)。
本发明提供的迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3通过实验证明其20℃、10-80‰的盐度和好氧条件下，能够高效去除水体中的氨氮和亚硝酸盐，由此得知其可以在净化海水养殖含氮废水中得到应用。
本发明还提供了一种净化海水养殖含氮废水的方法，将保藏名称为迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的活化种子液加入到盐度为30‰的海水养殖含氮废水中，于pH值为7.0-7.2、20℃的条件下摇床振荡48-72h；其摇床振荡的振荡速率优选为150rpm为宜。其迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏编号为CGMCC NO.13118。
本发明提供的净化海水养殖含氮废水的方法是将所述迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3进行活化，接斜面菌种3环到装有50mL的LB液体培养基的三角瓶中，150r/min活化12h，将活化的菌液按5％的接种量接到装有100mL的LB液体培养基的三角瓶中，150r/min摇瓶24h，得活化种子液，将迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的活化种子液加入到盐度为30‰的海水养殖含氮废水中，于pH值为7.0-7.2、20℃的条件下摇床振荡降解48-72h，即可完成脱氮处理。其中迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的活化种子液中的活性菌为108个CFU/mL，其接种量为5％，在优选净化处理温度为20℃，优选净化环境的pH值为7时，其菌株对浓度为100mg/L的含氨氮或亚硝酸盐、盐度为30‰的废水48h的脱除率可达100％，其对含有氨氮(100mg/L)和亚硝酸盐(50mg/L)的复合氮源、盐度为30‰的废水的72h的脱除率可达92％以上。
本发明提供的迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3净化能力很强，将其应用于含氮废水的净化处理不仅操作简单，能够将废水中的氨氮和亚硝酸盐高效脱除掉，而且不会造成进一步的污染，可以有效解决了现有技术中处理废水中需要专门的处理设备、成本高以及处理效果差的问题，适宜在高盐度海水养殖含氮废水的净化中广泛使用。
本发明提供的迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的保藏方法：超低温冻结。
附图说明
图1为实施例1筛选的迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的革兰氏染色图。
图2为实施例1筛选的迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的生长曲线图。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1：迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的筛选。
(1)分装250mL富集培养基于500mL三角瓶，加入数粒玻璃珠，灭菌后加入25mL采秦皇岛海水养殖池底泥泥样，在30℃，100r/min振荡培养2-3d；吸取培养液25mL接入新的富集培养基中，在30℃，100r/min振荡培养2-3d；，反复操作3次，得富集目的菌培养液；
富集培养基：柠檬酸钠5.0g/L，KNO3 2.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，NaCl 30.0g/L；
(2)分离纯化：取10mL上述富集目的菌培养液到90mL无菌水中，梯度稀释，涂布于BTB平板，30℃培养2-3d。从BTB平板上挑取有蓝色晕圈的单菌落，在普通细菌平板上继续分离，得到迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3纯培养物。
分离培养基：柠檬酸钠5.0g/L，KNO3 2.0g/L，K2HPO4 1.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，NaCl 30.0g/L，1％BTB乙醇溶液1mL，琼脂20.0g/L。
(3)菌株的生长特性：将分离纯化的菌株接种至牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，20℃培养48-72h，再从牛肉膏蛋白胨斜面培养基上挑取一环到装有30mL培养基的50mL三角瓶中在同样的培养条件下活化12h，将活化好菌液按5％的接种量接种到装有100mL的牛肉膏蛋白胨培养基250mL三角瓶中，每隔3h测定OD值。该菌株的生长曲线如图2所示。
在发明人研发实验过程中发现本发明筛选的菌株在10‰、40‰和80‰盐度下都能够生长，最适生长盐度30‰，但是低于10‰的淡海水中生长弱，所以该菌株不适用于在含氮淡海水的净化中使用。
(4)迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的鉴定
A、菌株形态观察及革兰氏染色鉴定：
菌落及菌株观察：迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3在LB固体培养基上培养48h，观察其菌落呈圆形，边缘整齐规则，不透明，菌落呈浅黄色，菌落直径0.5-1mm。
B、生理生化检测：
根据《常见细菌鉴定手册》中属、种鉴定的相关内容进行了氧化酶、接触酶测定等试验。菌株对碳源的利用采用Biolog实验测定，其测试结果如表1所示。该菌株的革兰氏染色结果如图1所示。
表1迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的生理生化检测结果
C、分子生物学鉴定：
检测得到的迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)B21-3的基因组DNA，采用引物对菌株DNA进行PCR扩增，扩增结果经序列测定，测定结果提交GenBank数据库经Blast同源性比对，与Arthrobacter mysorens相似度达到99.23％，且参考《伯杰氏***细菌学手册》以及International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，结果表明本菌株为：迈索尔节杆菌Arthrobacter mysorens；该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏编号为CGMCC NO.13118。
实施例2迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3对海水养殖含氮废水的净化研究
一、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3活化种子液的制备：
活化种子液的制备：接斜面菌种3环到装有50mL LB液体培养基的三角瓶中，150r/min活化12h；将活化的菌液按5％的接种量接到装有100mL的LB液体培养基的三角瓶中，在20℃下，150r/min培养24h，8000rpm离心收集菌体，生理盐水洗涤三次，重悬菌液，且保证悬菌液中活性菌为108个CFU/mL；LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏3.0，NaCl 30.0，pH7.0-7.2。
二、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3对氨氮的降解：将活化种子液按照5％的接种量接种到含有100mg/L的含异养硝化培养基中，在20℃、150r/min摇床培养，每隔24h取样检测水体中氨氮浓度。
所示异养硝化培养基的配制：(NH4)2·SO4：0.47g/L；柠檬酸钠：8.2g/L；NaCl30‰；50mL维氏盐溶液；pH：7.0-7.2；其中维氏盐溶液：K2HPO4·3H2O：5.0g/L；FeSO4·7H2O：0.05g/L；MgSO4·7H2O：2.5g/L；MnSO4·4H2O：0.05g/L。
去除率的计算公式：
去除率＝[c1－c2]/c1，其中c1为体系中所添加氮的初始浓度，c2为培养后体系中剩余所添加氮的浓度。
检测水体的结果如表2所示。
表2迈索尔节杆菌对氨氮的去除效率
结果表明，本发明提供的菌株48h时将氨氮完全被去除。
三、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3对亚硝酸盐的降解：将活化种子液按照5％的接种量接种到含有50mg/L的含反硝化培养基中，在20℃、150r/min摇床培养，每隔24h取样检测水体中亚硝酸盐浓度。
反硝化培养基的配制：NaNO2：0.5g/L；KH2PO4：1.0g/L；MgSO4·7H2O：0.2g/L；柠檬酸钠：4.2g/L；FeSO4·7H2O：0.04g/L；MnSO4·4H2O：0.04g/L；NaCl 30‰；pH：7.0-7.5。
检测水体的结果如表3所示。
表3迈索尔节杆菌对亚硝态氮的去除结果
结果表明，48h时，本发明提供的迈索尔节杆菌菌株将亚硝态氮完全被去除。
四、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3对含有氨氮和亚硝酸盐的复合氮源降解：将活化种子液按照5％的接种量接种到含有100mg/L的氨氮和50mg/L的亚硝酸盐的复合培养基中，在20℃、150r/min摇床培养，每隔24h取样检测水体中氨氮、亚硝酸盐浓度。复合培养基的配制：NaNO2：0.25g/L；(NH4)2·SO4：0.47g/L；KH2PO4：1.0g/L；K2HPO4·3H2O：1.0g/L；MgSO4·7H2O：0.2g/L；柠檬酸钠：12g/L；CaCl2：0.1g/L；NaCl 30‰；pH：7.0-7.5。
检测水体的结果如表4所示。
表4迈索尔节杆菌对复合氮源(氨氮和亚硝态氮)的去除效率
结果表明：48h时，迈索尔节杆菌菌株对氨氮去除率为93.5％，对亚硝酸盐去除率为91.3％；72h时对氨氮去除率为94.1％，对亚硝酸盐去除率为92.1％，表现出对复合氮源突出的脱除能力。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北大学
<120> 一种迈索尔节杆菌及其在净化水产养殖含氮废水中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1331
<212> DNA
<213> 迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的16s rRNA
<400> 1
gcttcgggtg ttaccaactt tcgtgacttg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt 60
attcaccgca gcgttgctga tctgcgatta ctagcgactc cgacttcatg gggtcgagtt 120
gcagacccca atccgaactg agaccggctt ttagggatta gctccacctc acagtatcgc 180
aacccattgt accggccatt gtagcatgcg tgaagcccaa gacataaggg gcatgatgat 240
ttgacgtcat ccccaccttc ctccgagttg accccggcag tctcccatga gtccccacca 300
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gtgttcctcc tgatatctgc gcatttcacc gctacaccag gaattccagt ctcccctaca 780
tcactctagt ctgcccgtac ccaccgcaga tccgaggttg agcctcggac tttcacggca 840
gacgcgacaa accgcctacg agctctttac gcccaataaa tccggataac gcttgcgccc 900
tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccggcgc ttcttctgca ggtaccgtca 960
ctttcgcttc ttccctactg aaagaggttt acaacccgaa ggccgtcatc cctcacgcgg 1020
cgtcgctgca tcaggctttc gcccattgtg caatattccc cactgctgcc tcccgtagga 1080
gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cggtcaccct ctcaggccgg ctacccgtcg 1140
tcgccttggt gagccattac ctcaccaaca agctgatagg ccgcgagtcc atcccccacc 1200
gataaatctt tccaccaaca accatgcggt caaaggtaat atccggtatt agacccagtt 1260
tcccgggctt atcccagagt cgggggcagg ttactcacgt gttactcacc cgttcgccac 1320
taatccaccc a 1331

Claims (5)

1.一种迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)，其特征在于，所述迈索尔节杆菌保藏名称是迈索尔节杆菌 (Arthrobacter mysorens)7-3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏编号为CGMCC NO.13118。
2.一种如权利要求1所述的迈索尔节杆菌在净化海水养殖含氮废水中的应用。
3.一种净化海水养殖含氮废水的方法，其特征在于，将保藏名称为迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的活化种子液加入到盐度为30‰的海水养殖含氮废水中，于pH值为7.0-7.2、20℃的条件下摇床振荡降解48-72h；所述迈索尔节杆菌(Arthrobactermysorens)7-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2016年10月17，保藏编号为CGMCC NO. 13118。
4.根据权利要求3所述的净化海水养殖含氮废水的方法，其特征在于，所述迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的活化种子液的制备方法为：将迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3接种于LB液体培养基，在20℃下，150r/min培养24h，8000rpm离心收集菌体，生理盐水洗涤三次，重悬菌液。
5.根据权利要求3或4所述的净化海水养殖含氮废水的方法，其特征在于，所述迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)7-3的活化种子液的接种量为5%。
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CN105713862A (zh) * 2016-03-28 2016-06-29 武汉科技大学 可降解吡啶和氨氮的菌株、制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

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Title
Heterotrophic Nitrification by Arthrobacter sp. (Strain 9006) as Influenced by Different Cultural Conditions, Growth State and Acetate Metabolism;Karl-Paul Witzel 等;《Arch. Microbiol.》;19791231;第137-143页 *
Heterotrophic Nitrification by Arthrobacter sp.;W. VERSTRAETE 等;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;19721231;第955-961页 *

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