CN105699524B

CN105699524B - 一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法

Info

Publication number: CN105699524B
Application number: CN201610070436.7A
Authority: CN
Inventors: 刘霞; 苟芬
Original assignee: Chengdu Baiyu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chengdu Baiyu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: CN105699524A

Abstract

本发明公开了一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法，它包括以下步骤：a、制备对照品溶液；b、制备供试品溶液；c、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测；d、按外标法以峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，得到替格瑞洛样品中的异构体杂质含量。本发明提供了一种替格瑞洛中异构体杂质含量的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对杂质B和杂质A、杂质C的准确检测，为监控替格瑞洛药物中异构体杂质的含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全。

Description

一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法

技术领域

本发明属于化学中的分析检测领域，具体涉及一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法。

背景技术

替格瑞洛(Ticagrelor商品名：BRILINTA)，化学名为(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-丙硫基-3H-1,2,3-***基[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)-1,2-环戊烷二醇(分子式：C₂₃H₂₈F₂N₆O₄S)，是由阿斯利康制药有限公司(AstraZeneca AB)开发的一种选择性的二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂，通过激活P₂Y₁₂-受体，可逆性的阻滞ADP介导的血小板活化和聚集。

由于受生产工艺和控制水平的限制，生产所得的替格瑞洛产品中，往往存在有多种杂质，例如，(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇、(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇、(1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇等(参见：替卡格雷杂质列表，http://wenku.***.com/view/ 69885bd8fd0a79563c1e72aa.html？re＝view，公开时间为2014年10月17日)，严重影响替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全。

然而，对于检测替格瑞洛而言，目前仅有一篇专利文献CN 104634887A检测了替格瑞洛中的一种杂质含量：(1S,2S,3R,5S)-3-(7-((1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺基)-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]***[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇，很难全面地反映替格瑞洛的产品质量。

为了对替格瑞洛中更多的杂质进行检测，同时，也为了更全面地监控替格瑞洛的产品质量，进一步保证患者的用药安全，需要发明一种新的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法。

本发明提供的一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法，它包括以下步骤：

a、取异构体杂质的对照品，制备对照品溶液；

b、取待检的替格瑞洛样品，制备供试品溶液；

c、采用高效液相色谱方法分别对对照品溶液、供试品溶液进行检测，所述高效液相色谱方法的检测条件为：

色谱柱：固定相为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)；

流动相：正己烷-乙醇溶液，正己烷与乙醇的体积比为88％：12％～92％：8％，所述的乙醇中含有0.1％～0.5％ml/ml的二乙胺；

检测波长：200nm～300nm；

d、按外标法以峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，得到替格瑞洛样品中的异构体杂质含量。

进一步的，所述的异构体杂质至少包括(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。

进一步的，所述的异构体杂质至少包括(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇和(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇；

优选的，所述的异构体杂质同时包括(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇、(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇和(1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。

进一步的，步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为步骤c中的流动相；步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为步骤c中的流动相。

进一步的，步骤c中，所述的色谱柱为AD-H，长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。

进一步的，步骤c中，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃。

进一步的，步骤c中，正己烷与乙醇的体积比为90％：10％；所述的乙醇中含有0.2％ml/ml的二乙胺。

进一步的，步骤c中，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min；优选的，所述流动相的流速为1.0ml/min。

进一步的，步骤c中，所述的检测波长为230nm～250nm；优选的，所述的检测波长为242nm。

进一步的，步骤c中，进样体积为10μl～50μl；优选的，进样体积为20μl。

本发明提供了一种替格瑞洛中异构体杂质含量的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对杂质B和杂质A、杂质C的准确检测，而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控替格瑞洛药物中异构体杂质的含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明检测条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。

图2为本发明检测条件下杂质B对照品溶液的HPLC图。

图3为本发明检测条件下杂质C对照品溶液的HPLC图。

图4为本发明检测条件下杂质A、杂质B、杂质C混合溶液的HPLC图。

图5为本发明检测条件下替格瑞洛供试品溶液的HPLC图。

图6为本发明检测条件下替格瑞洛和杂质A、杂质B、杂质C混合溶液的HPLC图。

图7为对比试验1色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。

图8为对比试验1色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图。

图9为对比试验1色谱条件下杂质C对照品溶液的HPLC图。

图10为对比试验1色谱条件下替格瑞洛供试品溶液的HPLC图

图11为对比试验2色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。

图12为对比试验2色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图。

图13为对比试验2色谱条件下杂质C对照品溶液的HPLC图。

图14为对比试验2色谱条件下替格瑞洛供试品溶液的HPLC图

图15为对比试验2色谱条件下混合杂质溶液的HPLC图

图16为对比试验3色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图。

图17为对比试验3色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图。

图18为对比试验3色谱条件下杂质C对照品溶液的HPLC图。

图19为对比试验3色谱条件下替格瑞洛供试品溶液的HPLC图。

图20为对比试验3色谱条件下混合杂质溶液的HPLC图。

图21为对比试验3色谱条件下替格瑞洛和杂质的混合溶液HPLC图。

图22为试验例1第1项下替格瑞洛的紫外光谱图。

图23为试验例1第2项下杂质A对照品的标准曲线图，纵坐标为峰面积，横坐标为浓度。

图24为试验例1第2项下杂质B对照品的标准曲线图，纵坐标为峰面积，横坐标为浓度。

图25为试验例1第2项下杂质C对照品的标准曲线图，纵坐标为峰面积，横坐标为浓度。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1、

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得；

例如，替格瑞洛的批号为20140801；杂质A批号为20140213，含量：99.6％；杂质B批号为20140227，含量：98.4％；杂质C批号为20140307，含量：99.1％；均来源于成都百裕科技制药有限公司。

杂质A的名称为(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。

杂质B的名称为(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。

杂质C的名称为(1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。

AUW220D型精密电子天平可购自岛津公司；LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，LC-20AT型高效液相色谱泵可购自岛津公司，SPD-M20A DAD检测器可购自岛津公司，SIL-20A自动进样器可购自岛津公司，LcSolution工作站可购自岛津公司；Waters 1525型高效液相色谱泵可购自沃特世公司，AD-H(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱可购自大赛璐公司；Agilent ZorbaxC18(250mm×4.6mm,3.5μm)可购自安捷伦有限公司。

实施例1、本发明检测替格瑞洛中手性异构体杂质的高效液相色谱方法

色谱柱：AD-H，4.6mm×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇(90:10)，乙醇中加入0.1％～0.5％ml/ml的二乙胺

溶剂：流动相

柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长242nm)。

进样体积：20μL。

检测步骤：

取杂质A、B和C对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL含杂质各5μg的对照品溶液。

取替格瑞洛样品适量，用乙醇溶解后，加溶剂稀释，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。

取替格瑞洛适量，用乙醇溶解后，加入杂质A、B和C对照品溶液，用溶剂稀释，配制成混合溶液。

测定法：取上述溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1～图6。

图1为杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为65.553min。

图2为杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间为42.595min。

图3为杂质C对照品溶液的HPLC图，杂质C的保留时间为53.713min。

图4为混合杂质对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为70.675min，杂质B的保留时间为45.761min，杂质C的保留时间为58.058min。

图5为供试品溶液的HPLC图，替格瑞洛主峰的保留时间为40.045min。

图6为供试品和杂质A、杂质B和杂质C混合溶液的HPLC图，替格瑞洛的保留时间为39.658min，杂质B的保留时间为45.346min，杂质C的保留时间为57.591min，杂质A的保留时间为70.185min，替格瑞洛与杂质B，以及杂质之间的分离度分别为2.688，5.153，4.472。

结果表明，本发明的色谱条件下，替格瑞洛与杂质之间的分离度高，可以实现替格瑞洛中多种手性杂质含量的同时检测。

对比试验1：

色谱柱：Agilent Zorbax C184.6mm×250mm，3.5μm；

流动相A：磷酸盐缓冲液①〔取1.0mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH值至3.0)10ml，加水至900ml〕-乙腈(90:10)；

流动相B：磷酸盐缓冲液②〔取1.0mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调pH值至3.0)10ml，加水至300ml〕-乙腈(30:70)；

溶剂：乙腈-水(50:50)

柱温：35℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长242nm)。

梯度洗脱条件如下：

取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的杂质A对照品溶液。

取杂质B适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的杂质B对照品溶液。

取杂质C适量，加溶剂配制成每1mL约含0.5mg的杂质C对照品溶液。

取替格瑞洛适量，加溶剂配制成每1mL约含替格瑞洛0.5mg的供试品溶液。

测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图7～10所示。

图7为对比试验1色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A保留时间为29.493min。

图8为对比试验1色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间29.450min。

图9为对比试验1色谱条件下杂质C对照品溶液的HPLC图，杂质C的保留时间为29.461min。

图10为对比试验1色谱条件下供试品溶液的HPLC图，替格瑞洛的保留时间29.457min。

结果表明，杂质A、杂质B、杂质C和替格瑞洛保留时间几乎无区别，该方法完全不能进行杂质A、杂质B和杂质C分离检测。

对比试验2：

色谱柱：OD-H，4.6mm×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇(70:30)

溶剂：流动相

柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长242nm)。

进样体积：20μL。

取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5μg的杂质A对照品溶液。

取杂质B对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含10μg的杂质B对照品溶液。

取杂质C对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含20μg的杂质C对照品溶液。

取替格瑞洛样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含20μg的供试品溶液。

取替格瑞洛和杂质A、杂质B、杂质C对照品溶液适量，加溶剂稀释至每1ml含各成分0.5μg的混合溶液。

测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图11～17所示。

图11为对比试验2色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为12.500min。

图12为对比试验2色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间为9.796min。

图13为对比试验2色谱条件下杂质C对照品溶液的HPLC图，杂质C的保留时间为11.189min。

图14为对比试验2色谱条件下替格瑞洛供试品溶液的HPLC图，替格瑞洛峰保留时间为9.415min。

图15为对比试验2色谱条件下混合溶液的HPLC图，杂质C保留时间为11.224min，杂质A保留时间为12.519min，分离度较好，但是替格瑞洛和杂质B的色谱峰几乎完全重合，不能准确检测杂质B。

对比试验3：

色谱柱：AD-H，4.6mm×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇(85:15)

溶剂：流动相

柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长242nm)。

进样体积：20μL。

取杂质A对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含25μg的杂质A对照品溶液。

取杂质B对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含50μg的杂质B对照品溶液。

取杂质C对照品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含5μg的杂质C对照品溶液。

取杂质A、杂质B、杂质C对照品溶液适量，加溶剂稀释至每1ml含各杂质0.5μg的混合杂质溶液。

取替格瑞洛样品适量，用溶剂溶解，配制成每1mL约含0.5mg的供试品溶液。

取替格瑞洛和杂质A、杂质B、杂质C对照品溶液适量，加溶剂稀释至每1ml含各杂质0.5μg，替格瑞洛0.5mg的混合溶液。

测定法：取上述溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图16～21所示。

图16为对比试验3色谱条件下杂质A对照品溶液的HPLC图，杂质A的保留时间为32.182min。

图17为对比试验3色谱条件下杂质B对照品溶液的HPLC图，杂质B的保留时间为21.799min。

图18为对比试验3色谱条件下杂质C对照品溶液的HPLC图，杂质C的保留时间为27.382min。

图19为对比试验3色谱条件下替格瑞洛供试品溶液的HPLC图，替格瑞洛峰保留时间为19.806min。

图20为对比试验3色谱条件下混合杂质溶液的HPLC图，杂质B保留时间为22.099min，杂质C保留时间为27.480min，杂质A保留时间为32.733min。

图21为对比试验3色谱条件下供试品和杂质混合溶液的HPLC图，杂质C保留时间为27.392min，杂质A保留时间为32.541min，分离度较好，但是替格瑞洛主峰拖尾处将杂质B的色谱峰掩盖了。因此，对比试验3的方法也不能准确检测杂质B。

为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。

试验例1、本发明检测方法的方法学研究

本试验例中各种试验均采用如下条件：

色谱柱：AD-H，4.6mm×250mm，5μm；

流动相：正己烷-乙醇(90:10)，乙醇中加入0.1％～0.5％的二乙胺

溶剂：流动相

柱温：30℃；流速：1.0ml/min；UV检测器(检测波长242nm)。

进样体积：20μL。

1、检测波长

取替格瑞洛，用溶剂溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，照紫外-可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IVA)在200～400nm范围内进行光谱扫描，紫外光谱图如图22所示。

结果显示，替格瑞洛在200～300nm均有吸收，杂质A、杂质B和杂质C均为替格瑞洛的手性异构体，其紫外光谱图无区别，因此选择在200～300nm范围内选择测定波长，而替格瑞洛在242nm波长处检测，基线噪音较小，其他杂质对杂质A、杂质B和杂质C无干扰，因此，最终选择242nm作为替格瑞洛手性异构体检测的检测波长。

2、专属性试验

取替格瑞洛适量，用乙醇溶解后，加流动相稀释制成每1mL中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液。另取替格瑞洛中杂质A、杂质B、杂质C适量，杂质对照品溶液，另取杂质对照品溶液混合，用流动相稀释配制混合杂质溶液。分别精密取上述混合杂质对照品溶液、供试品溶液及溶剂各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如图1～6所示。

结果表明，在本发明检测方法的条件下，替格瑞洛样品及替格瑞洛中其余杂质对杂质A、杂质B、杂质C的测定无干扰，证明本发明检测方法的专属性强。

3、标准曲线和线性范围

精密量取杂质A、杂质B、杂质C对照品溶液适量，用流动相稀释制成一系列浓度的对照品溶液。分别精密取不同浓度的对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。分别测定峰面积，结果见表1。

表1、线性关系

以杂质对照品溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算杂质(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的线性回归方程及相关系数r，标准曲线如图25所示。

结果表明，本发明检测方法中杂质A的浓度在0.275μg/mL～2.204μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝22540.6837X-2199.8432，r＝0.9994；杂质B的浓度在0.268μg/mL～2.145μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝25575.0896X-1514.7421，r＝0.9996；杂质C的浓度在0.254μg/mL～2.034μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程：Y＝26287.5744X-1548.7861，r＝0.9995，证明本发明方法线性范围广，准确度高。

此外，从标准曲线方程和图可以看出，斜率远远大于截距，标准曲线接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。

4、精密度试验

取试验例1第3项下的混合杂质对照品溶液3#，精密取20μL，注入高效液相色谱仪，连续进样6次，按照本发明的检测方法分别测定峰面积，结果见表2。

表2、精密度试验结果

计算得到杂质A峰面积的RSD为：1.45％，杂质B峰面积的RSD为：2.54％，杂质C峰面积的RSD为：2.26％，证明本发明的检测方法精密度优异。

5、定量限

量取试验例第3项下混合杂质对照品溶液6#适量，加流动相稀释，精密量取20μl，注入液相色谱仪，按照本发明的检测方法测定峰面积及基线噪音，结果见表3。

表3、定量限试验结果

杂质名称	浓度(μg/mL)	定量限(ng)
			杂质A	0.138	2.76
杂质B	0.134	2.68
			杂质C	0.127	2.54

杂质A、杂质B和杂质C的峰高均约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N＝10计，得杂质A的定量限为2.76ng，杂质B的定量限为2.68ng，杂质C的定量限为2.54ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足杂质定量测定的要求。

6、重复性试验

精密称取替格瑞洛6份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。精密量取上述6份供试品溶液各20μL，按照本发明的检测方法进行检测，按外标法以峰面积计算杂质A、杂质B和杂质C的含量，结果见表4。

表4、重复性试验结果

样品编号

1

2

3

4

5

6

杂质A

未检出

杂质B

未检出

杂质C

0.019％

0.018％

0.016％

0.019％

0.017％

0.020％

由上述结果可知，本发明检测方法的重复性良好。

7、溶液稳定性试验

精密称取替格瑞洛101mg，置20mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，得供试品溶液。分别于配制后0h、1h、2h、4h、6h、8h进样20μL，记录色谱图，考察其供试品溶液中杂质A、杂质B和杂质C的稳定性情况，结果见表5。

表5、供试品溶液稳定性试验结果表

放置时间	0h	2h	4h	6h	8h
						杂质A	未检出	未检出	未检出	未检出	未检出
杂质B	未检出	未检出	未检出	未检出	未检出
						杂质C	0.019％	0.020％	0.018％	0.019％	0.017％

由上述结果可知，在配制后8小时内供试品溶液中杂质A、杂质B均未检出，杂质C检出结果无明显变化，证明本发明检测方法供试品溶液稳定。

8、回收率试验

精密称取替格瑞洛9份，各约10mg，分别置20mL量瓶中，加入试验例第3项下各杂质浓度约为20μg/mL的对照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL各3份，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率供试品溶液。分别精密取9份回收率供试品溶液及试验例第4项下的对照品溶液各20μL进样测定，记录色谱图，计算杂质A、杂质B和杂质C的测得量、对照品加入量及回收率，结果见表6～8。

计算公式：

式中：a为供试品中所含异构体杂质的量(μg)；

b为异构体杂质对照品加入量(μg)；

c为异构体杂质的测得量(μg)。

表6、杂质A回收率试验结果

结果表明，本发明检测方法测定替格瑞洛中的手性异构体杂质A，回收率在100.6％～106.0％之间，相对标准偏差为1.75％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。

表7、杂质B回收率试验结果

结果表明，本发明检测方法测定替格瑞洛中的手性异构体杂质B，回收率在98.9％～103.6％之间，相对标准偏差为1.90％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。

表8、杂质C回收率试验结果

结果表明，本发明检测方法测定替格瑞洛中的手性异构体杂质C，回收率在98.4％～103.0％之间，相对标准偏差为1.74％，证明本发明的检测方法回收率好，准确度高。

综上所述，本发明提供了一种替格瑞洛中异构体杂质含量的新检测方法，各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对杂质B和杂质A、杂质C的准确检测，而且，操作简便，容易控制，检测成本低，并具有良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，为监控替格瑞洛药物中异构体杂质的含量提供了一种行之有效的检测方法，进一步保证了替格瑞洛的产品质量和患者的用药安全。

Claims

1.一种替格瑞洛中异构体杂质含量的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：

a、取异构体杂质的对照品，制备对照品溶液；

b、取待检的替格瑞洛样品，制备供试品溶液；

色谱柱：固定相为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)；

流动相：正己烷-乙醇，正己烷与乙醇的体积比为88％：12％～92％：8％，所述的乙醇中含有0.1％～0.5％ml/ml的二乙胺；

检测波长：230nm～250nm；

d、按外标法以峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，得到替格瑞洛样品中的异构体杂质含量；

所述的异构体杂质同时包括(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇、(1R,2R,3S,5R)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇和(1S,2S,3R,5S)-3-[7-{[(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基}-5-丙硫基-3H-1,2,3-***[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)环戊烷-1,2-二醇。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a中，制备对照品溶液的溶剂为步骤c中的流动相；步骤b中，制备供试品溶液的溶剂为步骤c中的流动相。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述的色谱柱为CHIRALPAK^®AD-H，长度为250mm，内径为4.6mm，填料的粒径为5μm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述色谱柱的柱温为25℃～35℃。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，正己烷与乙醇的体积比为90％：10％；所述的乙醇中含有0.2％ml/ml的二乙胺。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述流动相的流速为0.9ml/min～1.1ml/min。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述流动相的流速为1.0ml/min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，所述的检测波长为242nm。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤c中，进样体积为10μl～50μl。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：进样体积为20μl。