CN105699375B - 使用分光光度法测定氨基葡萄糖的方法 - Google Patents

使用分光光度法测定氨基葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种使用分光光度法测定氨基葡萄糖的方法，该方法可用于对食品、保健食品、药品或其原材料中的氨基葡萄糖及其类似物含量进行测定。该方法包括如下步骤：制备标准氨基葡萄糖储备液，制备样品溶液，标准对照品及供试品显色及测定；根据对照品溶液和供试品溶液的吸光度以及对照品溶液浓度计算所述制品中的氨基葡萄糖或其类似物的含量。本发明方法高效，快速，灵敏和准确，可用于氨基葡萄糖原料，食品及保健食品中氨基葡萄糖，药品中氨基葡萄糖的分析。

Description

使用分光光度法测定氨基葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及一种食品、保健食品、药品或其原材料中的氨基葡萄糖及其类似物的含量测定方法。特别是涉及一种采用分光光度计测定食品、保健食品、药品或其原材料中的氨基葡萄糖及其类似物的含量测定方法。
背景技术
氨基葡萄糖是一种可以人体内合成的物质，是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份，亦是软骨细胞进行生物合成与代谢必不可少的底物。随着年龄的增长，人体内的氨基葡萄糖的缺乏越来越严重，以致引发骨关节疾病和骨关节炎。大量医学研究表明：氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长，改善关节活动，缓解关节疼痛。它对治疗风湿性关节炎症有良好的疗效，是合成抗生素和抗癌药物的主要原料，还可应用于食品，化妆品和饲料添加剂中。
目前常用的氨基葡萄糖含量检测方法有：紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、高效阴离子色谱法、气相色谱法、滴定法、液相色谱质谱联用法。当保健食品及药品中复配组分较多时，上述方法具有多种瓶颈问题，如操作复杂、影响因素多、专属性不强、灵敏度低、或不易推广等。
随着氨基葡萄糖在保健食品及药品中越来越广泛的应用，建立一套快速，灵敏，简便，准确的分析方法迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于解决现有氨基葡萄糖测定方法存在的操作复杂、专属性差、和/或灵敏度低等缺陷，提供一种可见分光光度法测定原料、食品、保健食品或药品中氨基葡萄糖中的氨基葡萄糖或其类似物的含量的分析方法，并且期待该方法快速、灵敏、简便、和/或准确。已经出人意料地发现，使用本发明方法能够有效地实现上述一个或多个目的。本发明基于此发现而得以完成。
为此，本发明第一方面提供了一种测定制品中的氨基葡萄糖或其类似物含量的方法，该方法使用分光光度法进行测定，包括如下步骤：
(1)标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品1-200mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用pH2-10缓冲溶液稀释并定容至刻度作为对照品储备液(需要说明的是，使用盐酸氨基葡萄糖配制的对照品溶液可以用于测定其它形式的氨基葡萄糖例如用于测定硫酸氨基葡萄糖，只要在最后计算时作简单的换算即可)；
(2)样品溶液的制备：取相当于0.1-250mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为供试品溶液；
(3)标准对照品及供试品显色及测定：精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入0.5％-10％的茚三酮溶液0.5-10ml，再加入0-10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入0.5％-10％的茚三酮溶液0.5-10ml，再加入0-10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；将对照品及供试品待显色溶液置于70-100℃水浴中显色10-100min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至25ml，混匀；采用分光光度计在200-800nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定；
(4)根据对照品溶液和供试品溶液的吸光度以及对照品溶液浓度计算所述制品中的氨基葡萄糖或其类似物的含量。
根据本发明第一方面的方法，其中所述制品选自：包含氨基葡萄糖或其类似物的食品、保健食品、药品，或者制备它们的氨基葡萄糖或其类似物原料。
根据本发明第一方面的方法，其中所述氨基葡萄糖类似物选自：盐酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖、氨基葡萄糖硫酸钾盐、氨基葡萄糖枸橼酸钙等氨基葡萄糖有机酸盐及氨基葡萄糖无机酸盐等。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中，取盐酸氨基葡萄糖对照品20-50mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，配制对照品储备液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲溶液是pH6-8的缓冲溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲溶液是采用酸，碱及盐配制的不同pH值缓冲溶液，其中酸包括盐酸，柠檬酸，甲酸，乙酸等，碱包括氢氧化钠，氢氧化钾等，盐包括，氯化钠，柠檬酸钠，甲酸钠，乙酸钠等，pH2-10缓冲溶液也可为以上所提到的酸、碱、盐的单溶液。根据本发明第一方面的方法，其中所述缓冲溶液选自：柠檬酸钠溶液、乙酸钠溶液、甲酸钠溶液等。所述缓冲溶液的浓度是0.1～0.5mol/L，例如其浓度是0.1～0.3mol/L，例如其浓度是0.2mol/L。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(2)中，所取的供试品中精密称取相当于含50-150mg氨基葡萄糖的供试品，以用于制备供试品溶液。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中还包括采用分光光度计在200-800nm波长范围内对显色后的对照品溶液进行扫描以确定其最大吸收波长。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中对照品溶液及供试品溶液在氨基葡萄糖的最大吸收波长处测定吸光度。
根据本发明第一方面的方法，其中采用分光光度计在560～570nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定。根据本发明第一方面的方法，其中采用分光光度计在565nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，分别精密量取对照品储备液和供试品溶液各0.5～1ml置于25ml比色管中，以进行显色反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，茚三酮溶液浓度为1％～5％。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，每支比色管中的茚三酮溶液的添加量为0.5～2ml，例如1ml。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，在添加茚三酮溶液后，再加入5-10ml缓冲溶液，接着进行加热显色反应。
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(3)中，在热水浴中显色反应处理50～100min。
已经发现，本发明下文实施例1-7中所检测的制品或对照品试验，均获得了令人满意的结果。需要说明的是，在本发明步骤(3)经水浴加热处理并用缓冲溶液定容后，至分光光度法测定之前(这一时间段在本文中可以表示为T，定容后即刻进行测定时T表示为0小时)，都能够并且均是在1小时之内完成的。但是，已经发现，这些实施例1-7中所检测全部供试品或对照品溶液，在T大于1小时候后，特别是大于2小时候后，其吸光度值会有明显的降低。具体地讲，实施例1-7中所检测全部测试液，对于同一测试液，在T＝1小时时各测试液吸光度值相当于相应测定液在T＝0小时时的98～101％，在T＝2小时时各测试液吸光度值相当于相应测定液在T＝0小时时的95～97％，在T＝3小时时各测试液吸光度值相当于相应测定液在T＝0小时时的93～96％，在T＝5小时时各测试液吸光度值相当于相应测定液在T＝0小时时的90～93％；例如对于实施例1的供试品溶液和对照品溶液，其在T＝3小时时吸光度值分别相当于相应测定液在T＝0小时时的94.7％和95.2％。这表明，尽管通常能够在1小时之内完成测试任务，但是这种方法学缺陷仍然是期待克服的。本发明人在补充的试验中发现，当在重复进行实施例1-7的全部试验时，向所用缓冲溶液中额外添加0.15％(w/v)酒石酸氢钾时，可以完全克服上述问题，并且不会影响测定结果，例如测得4个实例中的供试品目标物含量与其产品标示含量一致，均在产品标示含量的98～102％范围内，最大吸收波长亦为565nm并且吸收光谱未变化，线性相关性试验变化中线性回归方程为y＝0.046898x-0.82357，相关系数R2＝0.9992，添加回收率试验中平均回收率为100.3％；特别是，缓冲溶液中额外添加0.15％(w/v)酒石酸钾钠，各种类型的测试溶液具有优异的稳定性，在T＝1、T＝2、T＝3、T＝4、T＝5时均基本无变化，在这些时间点各测试液吸光度值相当于相应测定液在T＝0小时时的98～101％范围内；例如对于实施例1供试品溶液和对照品溶液，其在T＝3小时时吸光度值分别相当于相应测定液在T＝0小时时的99.1％和99.6％。这种在缓冲溶液中添加适量试剂显著改善测试溶液稳定性的效果，是现有技术完全无法预期的。但是，在上面这些使用酒石酸钾钠的补充试验中，当将酒石酸钾钠改为枸橼酸钠时，却不能实现上述改善测试溶液稳定性的目的，这些结果是根本无法从现有技术获得解释的。因此，在本发明的一个实施方案中，所述缓冲溶液中还添加有酒石酸钾钠。在一个实施方案中，酒石酸钾钠在缓冲溶液中的浓度是0.1～0.3％(w/v)，优选浓度是0.15％(w/v)。
本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1显示了采用分光光度计对氨基葡萄糖对照溶液显色后的扫描谱图(图中显示了480-800nm区间的吸收情况)。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。在本文中，如未特别指明测定的波长，均指565nm。
实施例1、分光光度法测定氨基葡萄糖条件的选择
标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用pH6缓冲溶液(0.2mol/L乙酸钠溶液)稀释并定容至刻度作为对照品储备液。
样品溶液的制备：取相当于100mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为供试品溶液。
标准对照品及供试品显色及测定：精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入1％的茚三酮溶液3ml，再加入10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入1％的茚三酮溶液3ml，再加入10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀。将对照品及供试品待显色溶液置于70℃水浴中显色100min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至25ml，混匀；采用分光光度计在200-810nm波长下对显色后的对照品及供试品进行测定。测定两份溶液在565nm处的吸光度，计算供试品中氨基葡萄糖或其类似物的含量。本例供试品是主成分为盐酸氨基葡萄糖的药品。
实施例2、分光光度法测定氨基葡萄糖条件的选择
标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品30mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用pH8缓冲溶液(0.2mol/L乙酸钠溶液)稀释并定容至刻度作为对照品储备液。
样品溶液的制备：取相当于100mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为供试品溶液。
标准对照品及供试品显色及测定：精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入1％的茚三酮溶液1ml，再加入8ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入1％的茚三酮溶液1ml，再加入8ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀。将对照品及供试品待显色溶液置于90℃水浴中显色70min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至25ml，混匀；采用分光光度计在200-800nm波长下对显色后的对照品及供试品进行测定。测定两份溶液在565nm处的吸光度，计算供试品中氨基葡萄糖或其类似物的含量。本例供试品是主成分为硫酸氨基葡萄糖的市售食品。
实施例3、分光光度法测定氨基葡萄糖条件的选择
标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品20mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用pH7缓冲溶液(0.2mol/L乙酸钠溶液)稀释并定容至刻度作为对照品储备液。
样品溶液的制备：取相当于50mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为供试品溶液。
标准对照品及供试品显色及测定：精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入5％的茚三酮溶液3ml，再加入5ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入5％的茚三酮溶液3ml，再加入5ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀。将对照品及供试品待显色溶液置于100℃水浴中显色50min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至25ml，混匀；采用分光光度计在200-800nm波长下对显色后的对照品及供试品进行测定。测定两份溶液在565nm处的吸光度，计算供试品中氨基葡萄糖或其类似物的含量。本例供试品是主成分为氨基葡萄糖硫酸钾盐的市售保健食品。
实施例4、分光光度法测定氨基葡萄糖条件的选择
标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品50mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用pH6缓冲溶液(0.2mol/L乙酸钠溶液)稀释并定容至刻度作为对照品储备液。
样品溶液的制备：取相当于150mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为供试品溶液。
标准对照品及供试品显色及测定：精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入2％的茚三酮溶液5ml，再加入10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入2％的茚三酮溶液5ml，再加入10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀。将对照品及供试品待显色溶液置于100℃水浴中显色60min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至25ml，混匀；采用分光光度计在200-800nm波长下对显色后的对照品及供试品进行测定。测定两份溶液在565nm处的吸光度，计算供试品中氨基葡萄糖或其类似物的含量。本例供试品是主成分为氨基葡萄糖枸橼酸钙的市售保健食品。
以上实施例1-4，通过对照品溶液与供试品溶液进行扫描，结果显示对照品溶液与供试品溶液二者的吸收光谱吻合，最大吸收波长均相同，表明各供试品中的主成分均为氨基葡萄糖或其类似物。另外，经计算，已经测得4个实例中的供试品目标物含量与其产品标示含量一致(均在产品标示含量的98～102％范围内；本领域通常要求在90～110％范围内)。
实施例5、最大吸收波长确定
取盐酸氨基葡萄糖对照品25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用0.2mol/L乙酸钠溶液稀释并定容至刻度作为对照品储备液。
精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入1％的茚三酮溶液1ml，再加入8ml 0.2mol/L乙酸钠溶液；将对照品待显色溶液置于90℃水浴中显色70min，取出迅速冷却至室温，加入0.2mol/L乙酸钠溶液定容至25ml，采用分光光度计对显色后的对照品进行全扫测定，扫描谱图见图1(图中显示了480-800nm区间)，从图中可以看出最大吸收波长为565nm。
实施例6、线性相关性试验
标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品25mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用0.2mol/L乙酸钠溶液稀释并定容至刻度作为对照品储备液。
标准对照品溶液显色及测定：精密量取对照品储备液0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0ml，置于25ml比色管中，加入1％的茚三酮溶液1ml，再加入8ml 0.2mol/L乙酸钠溶液；将对照品待显色溶液置于90℃水浴中显色70min，取出迅速冷却至室温，加入0.2mol/L乙酸钠溶液定容至25ml，采用分光光度计在565nm波长下对显色后的对照品及供试品进行测定，结果见表1。
表1：线性相关性试验测定结果
编号 1 2 3 4 5 6
浓度(μg/ml) 20 24 28 32 36 40
吸光度 0.1249 0.2803 0.5078 0.6700 0.8592 1.0583
线性回归方程：y＝0.046899x-0.82356，相关系数R2＝0.9992
试验结果表明，在20-40μg/ml浓度范围内，溶液浓度值与吸收值线性关系良好。
实施例7、添加回收率试验
分别精密称取盐酸氨基葡萄糖适量，加入到氨基葡萄糖样品中，置于100ml容量瓶中，加0.2mol/L乙酸钠稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为回收率测定溶液，计算结果见表2。
表2：添加回收率测定结果
通过本发明的实施，完善地建立了氨基葡萄糖的高效，快速，灵敏和准确的定性定量分析方法，为氨基葡萄糖在食品，保健食品及药品中的应用及检测奠定了良好基础。

Claims (15)

1.测定制品中的氨基葡萄糖或其类似物含量的方法，氨基葡萄糖的类似物选自：盐酸氨基葡萄糖、硫酸氨基葡萄糖、氨基葡萄糖硫酸钾盐、氨基葡萄糖枸橼酸钙，该方法使用分光光度法进行测定，包括如下步骤：
(1)标准氨基葡萄糖储备液的制备：取盐酸氨基葡萄糖对照品1-200mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，用缓冲溶液稀释并定容至刻度，作为对照品储备液；所述缓冲溶液是pH6-8的乙酸钠溶液，并且该缓冲溶液中还添加有重量/体积百分比浓度为0.15％的酒石酸钾钠；
(2)样品溶液的制备：取相当于0.1-250mg氨基葡萄糖的供试品，精密称定，置于100ml容量瓶中，加上一步骤所用缓冲溶液稀释，超声提取15min，定容至刻度，过滤，续滤液作为供试品溶液；
(3)标准对照品及供试品显色及测定：精密量取对照品储备液适量，置于25ml比色管中，加入0.5％-10％的茚三酮溶液0.5-10ml，再加入0-10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；精密量取供试品溶液适量，置于25ml比色管中，加入0.5％-10％的茚三酮溶液0.5-10ml，再加入0-10ml上一步骤所用缓冲溶液，混匀；将对照品及供试品待显色溶液置于70-100℃水浴中显色10-100min，取出迅速冷却至室温，加入上一步骤所用缓冲溶液定容至25ml，混匀；采用分光光度计在200-800nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定；
(4)根据对照品溶液和供试品溶液的吸光度以及对照品溶液浓度计算所述制品中的氨基葡萄糖或其类似物的含量。
2.根据权利要求1的方法，其中所述制品选自：包含氨基葡萄糖或其类似物的食品、药品，或者制备它们的氨基葡萄糖或其类似物原料。
3.根据权利要求1的方法，步骤(1)中，取盐酸氨基葡萄糖对照品20-50mg，精密称定，置于25ml容量瓶中，配制对照品储备液。
4.根据权利要求1的方法，所述缓冲溶液的浓度是0.1～0.3mol/L。
5.根据权利要求1的方法，所述缓冲溶液的浓度是0.2mol/L。
6.根据权利要求1的方法，步骤(2)中，所取的供试品中精密称取相当于含50-150mg氨基葡萄糖的供试品，以用于制备供试品溶液。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中还包括采用分光光度计在200-800nm波长范围内对显色后的对照品溶液进行扫描以确定其最大吸收波长。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中对照品溶液及供试品溶液在氨基葡萄糖的最大吸收波长处测定吸光度。
9.根据权利要求1的方法，其中采用分光光度计在560～570nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定。
10.根据权利要求1的方法，其中采用分光光度计在565nm波长下对显色后的对照品溶液及供试品溶液的吸光度进行测定。
11.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，分别精密量取对照品储备液和供试品溶液各0.5～1ml置于25ml比色管中，以进行显色反应。
12.根据权利要求1至11任一项的方法，步骤(3)中，茚三酮溶液浓度为1％～5％。
13.根据权利要求1至11任一项的方法，步骤(3)中，每支比色管中的茚三酮溶液的添加量为0.5～2ml。
14.根据权利要求1至11任一项的方法，步骤(3)中，在添加茚三酮溶液后，再加入5-10ml缓冲溶液，接着进行加热显色反应。
15.根据权利要求1至11任一项的方法，步骤(3)中，在热水浴中显色反应处理50～100min。
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