CN105695624A - 粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，包括以下步骤：a）将待测粗品肝素钠溶于含有氯化钠和乙醇的水溶液中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物；c）以待测粗品肝素钠总DNA为模板，采用猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增；d）将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，根据得到的特异性条带分子量大小来判断该待测粗品肝素钠的种属来源。本发明提供的鉴别方法可有效解决传统方法中存在的肝素对PCR抑制的问题，而且大大降低了成本，方法简洁明了，快速简便，重复性好，易操作，准确性高，适于在粗品肝素钠种属来源鉴别中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及药物来源检测方法，具体地说是一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法。
背景技术
肝素钠是黏多糖硫酸酯类物质，因其具有抗凝血作用，广泛应用于血栓形成或栓塞性疾病的临床治疗。近年来研究证明，肝素钠还具有降血脂作用。目前，肝素钠主要来源于猪、牛或羊的肠黏膜。但是，牛源性和羊源性的肝素钠存在被相关病毒感染的风险，且导致血小板减少症及血栓综合征等不良反应的发生概率要远远大于猪源性肝素钠。因此，在临床使用中人们会应尽量选择猪源性肝素钠。然而，实际生产中由于生产材料来源复杂等多方面原因，往往会导致猪来源的生产原料存在被牛、羊等来源的动物材料污染的可能性。因此，建立猪源、羊源、牛源等动物来源成分的鉴别方法对控制药品质量、防止异种动物源性成分的污染至关重要。
目前，现有技术中检测不同种属来源的肝素钠的方法主要有免疫化学和核酸检测等。其中荧光定量PCR方法核酸检测使用相对更为广泛，具体是先从粗品肝素钠中提取动物残留核酸，再采用荧光定量PCR进行检测。荧光定量PCR技术是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。这种检测方法结果较为精准，但是这种方法检测肝素钠时存在一定缺陷，因为肝素对PCR有很强的抑制活性，所以在做定量PCR前需要使用肝素酶对肝素钠样品进行前处理，其操作复杂繁琐、肝素酶和定量试剂费用高昂，这使得该方法在技术力量薄弱的中小企业使用受到了很大的局限。可见，研发成本低、操作便捷、准确度高的不同种属来源的肝素钠的鉴别方法是行业内积极探索的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，以解决现有检测方法要么无法控制肝素对后期PCR的抑制导致检测准确性降低，要么前处理操作繁琐复杂、成本较高的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，包括以下步骤：
（a）将待测粗品肝素钠溶于溶剂A中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，得待测粗品肝素钠总DNA；所述溶剂A为每100mL水中溶解有2g氯化钠和10g乙醇的混合溶液；所述粗品肝素钠、溶剂A、生物磁珠的质量体积比为30mg:1mL:30μL；
（b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别为：
猪源性成分鉴别引物：
上游引物：ATCTACATGATTCATTACAATTAC，
下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA；
羊源性成分鉴别引物：
上游引物：ACACAACTTCTACCACAACCC，
下游引物：AAACAATGAGGGTAACGAGGG；
牛源性成分鉴别引物：
上游引物：GCCATATACTCTCCTTGGTGACA，
下游引物：GTAGGCTTGGGAATAGTACGA；
（c）以步骤（a）所得待测粗品肝素钠总DNA作为DNA模板，采用步骤（b）设计的猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增，其扩增体系为：DNA模板3μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2倍PCR试剂预混液25μL，用ddH2O补齐至50μL；
PCR反应程序为：在95℃下预变性5min；在95℃下变性15s；在63℃下退火30s；在72℃下延伸30s；热循环次数为40次；得扩增产物；
（d）将所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如得到了分子量大小为150bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有猪源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为145bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有羊源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为271bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有牛源性肝素钠成分。
本发明步骤（a）中所述生物磁珠是指磁珠MG101，为天根生化科技（北京）有限公司的市售产品。所述生物磁珠是指能够吸附DNA的磁珠，由特殊工艺对磁性纳米颗粒的表面进行修饰，在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附的核酸，能够达到快速分离纯化核酸的目的。
本发明步骤（a）所述的通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA的具体步骤是：①将加入生物磁珠的待测粗品肝素钠溶液置于离心管中振荡10s，置于室温孵育10min，期间每隔3min振荡混匀10s；②将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时除去液体；③将离心管从磁力架上取下，加入6倍所述生物磁珠体积的漂洗液A，振荡混匀1min；④将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，除去液体；⑤将离心管从磁力架上取下，再加入6倍所述生物磁珠体积的漂洗液B，振荡混匀1min；⑥将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，除去液体；⑦重复步骤⑤-⑥一次；⑧再将离心管置于于磁力架上，56℃晾干5-10min；⑨将离心管从磁力架上取下，加入20μL的ddH2O，56℃振荡混匀5min；⑩将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，将得到的DNA转移至一个新离心管中即可；所述漂洗液A为每1L水中溶有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl和200g的PEG，其pH值为7.0；所述漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇。
本发明步骤（d）中所述的2倍PCR试剂预混液是指：Tris-HCl（pH值为8.3）20mmol/L、dNTP0.4mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl23mmol/L、taq酶0.05U/mL，溶剂为ddH2O。
本发明步骤（d）中所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳的具体工艺为：取20μL所述扩增产物加入上样缓冲液2μL，采用质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳20min。上样缓冲液是指1L水中溶解有0.01mol的EDTA、0.25g的溴酚兰、0.25g的二甲苯氰和50g的甘油的混合溶液。
本发明通过从粗品肝素钠中提取总DNA、设计特异性引物、PCR扩增反应以及电泳数据分析等一系列步骤准确地检测了粗品肝素钠的不同种属来源，同时也快速鉴别了该粗品肝素钠是否为混杂有羊源性或牛源性成分的产品，这为医药采购把关及临床医用提供了可靠的检验结果。本发明的特别创新之处在于对待测样品总DNA采用的是特定磁珠提取法，该方法有效解决了传统方法中存在的肝素对PCR抑制的问题，而且大大降低了成本，方法简洁明了，快速简便，重复性好，易操作，准确性高，适于在鉴定肝素粗品质量中推广应用。
附图说明
图1为鉴别猪、羊、牛源性粗品肝素钠的电泳图谱。图中1为分子量标准；2.为牛源性成分阴性对照；3为1000pg/μL牛源性成分扩增产物特异性条带；4为10000pg/μL猪源性成分扩增产物特异性条带；5为1000pg/μL猪源性成分扩增产物特异性条带；，6为100pg/μL猪源性成分扩增产物特异性条带；7为猪源性成分阴性对照；8为羊源性成分阴性对照；9为10000pg/μL羊源性成分扩增产物特异性条带；10为1000pg/μL羊源性成分扩增产物特异性条带；11为100pg/μL羊源性成分扩增产物特异性条带。
图2为鉴别猪源性粗品肝素钠中混杂羊源性成分的电泳图谱。图中1为分子量标准，2为产品含有质量百分比为10%的羊源性肝素钠的电泳条带；3为产品含有质量百分比为1%的羊源性肝素钠的电泳条带；4为产品含有质量百分比为0.1%的羊源性肝素钠的电泳条带；5为阴性对照。
图3为本发明与对比例提取粗品肝素钠中总DNA数量电泳图谱。图中1为分子量标准，2为样本A电泳条带，3为样本B电泳条带。
具体实施方式
下面实施例用于进一步详细说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。但不以任何形式限制本发明。
本发明中所述使用的生物磁珠来自天根生化科技（北京）有限公司市售的磁珠MG101。
实施例1猪源性粗品肝素钠样品的检测
（1）提取猪源性粗品肝素钠的总DNA：称取猪源性粗品肝素钠30mg溶于lmL的溶剂A中（100mL水中溶解有2gNaCl和10g乙醇的混合溶液），置于离心管中；向样本溶液中加入30μL生物磁珠，盖上管盖，振荡混匀10s；室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合，离心收集附着在管壁及管盖的液体；将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液A（漂洗液A为1L水中溶解有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl以及200g的PEG的混合溶液，pH7.0），振荡混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液B（漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇），振荡混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；重复步骤-一次；离心管于磁力架上，56℃晾干10min；将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE缓冲液，56℃振荡混匀5min；将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，小心将得到的DNA转移至一个新离心管中，得粗品肝素钠总DNA；
（2）、稀释：将步骤（1）得到的粗品肝素钠总DNA用纯化水稀释成浓度为10000pg/mL、1000pg/mL、100pg/mL的DNA模板；
（3）PCR扩增：
①配置PCR体系，50μL反应体系如下:
DNA模板3μL
上游引物1μL
下游引物1μL
2倍的PCR试剂预混液25μL
ddH2O补齐至50μL；
上述反应体系中的上游引物和下游引物采用猪源性成分鉴别引物：
上游引物：ATCTACATGATTCATTACAATTAC，
下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA；
2倍PCR试剂预混液的配置方法是：在1L超纯水中溶解有pH值为8.3的Tris-HCl20mmol、dNTP0.4mmol、KCl100mmol、MgCl23mmol、taq酶50U。
以纯化水替代DNA模板为阴性对照；
②PCR反应程序为:①在95℃下预变性5分钟；②在95℃下变性15秒；③在63℃下退火30秒；④在72℃下延伸30秒；热循环次数为40次；
对于上述三个不同浓度DNA模板以及阴性对照样品进行PCR扩增，得扩增产物；
（4）琼脂糖凝胶检测
取上述PCR的扩增产物20μL加入上样缓冲液（0.01MEDTA、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯氰、50%甘油）2μL，在质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶TAE电泳，电压100V，电泳20min，EB染色，紫外灯下观察，其结果见图1。图中可以看到本发明提供的方法可以检测到该样品中含有猪源性肝素钠成分，其特异性条带分子量大小为150bp。
实施例2羊源性粗品肝素钠样品的检测
（1）提取羊源性粗品肝素钠的总DNA：称取羊源性粗品肝素钠30mg溶于lmL的溶剂A中（100mL水中溶解有2gNaCl和10g乙醇的混合溶液），置于离心管中；向样本溶液中加入30μL生物磁珠，盖上管盖，振荡混匀10s；室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合，简短离心收集附着在管壁及管盖的液体；将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液A（漂洗液A为1L水中溶解有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl以及200g的PEG的混合溶液，pH7.0），振荡混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液B（漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇），振荡混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；重复步骤-一次；离心管于磁力架上，56℃晾干10min；将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE缓冲液，56℃振荡混匀5min；将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，小心将得到的DNA转移至一个新离心管中，得粗品肝素钠的总DNA；
（2）、稀释：将步骤（1）得到的粗品肝素钠的总DNA用纯化水稀释成浓度为10000pg/mL、1000pg/mL、100pg/mL的DNA模板；
（3）PCR扩增：
①配置PCR体系，50μL反应体系如下:
DNA模板3μL
上游引物1μL
下游引物1μL
2倍PCR试剂预混液25μL
ddH2O补齐至50μL；
上述反应体系中的上游引物和下游引物采用羊源性成分鉴别引物：
上游引物ACACAACTTCTACCACAACCC
下游引物AAACAATGAGGGTAACGAGGG
2倍PCR试剂预混液为：Tris-HCl（pH8.3）20mmol/L、dNTP0.4mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl23mmol/L、taq酶0.05U/μL；
以纯化水替代DNA模板为阴性对照；
②PCR反应程序为:①在95℃下预变性5分钟；②在95℃下变性15秒；③在63℃下退火30秒；④在72℃下延伸30秒；热循环次数为40次；
对于上述三个不同浓度DNA模板以及阴性对照样品进行PCR扩增，得扩增产物；
（4）琼脂糖凝胶检测
取上述PCR的扩增产物20μL加入上样缓冲液（0.01mol/LEDTA、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯氰、50%甘油）2μL，在质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶TAE电泳，电压100V，电泳20min，EB染色，紫外灯下观察，其结果见图1。图中可以看到本发明提供的方法可以检测到该样品中含有羊源性肝素钠成分，其特异性条带分子量大小为145bp。
实施例3牛源性粗品肝素钠样品的检测
（1）提取牛源性粗品肝素钠的总DNA：称取牛源性粗品肝素钠30mg溶于lmL的溶剂A中（100mL水中溶解有2gNaCl和10g乙醇的混合溶液），置于离心管中；向样本溶液中加入30μL生物磁珠，盖上管盖，振荡混匀10s；室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合，简短离心收集附着在管壁及管盖的液体；将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液A（漂洗液A为1L水中溶解有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl以及200g的PEG的混合溶液，pH7.0），振荡混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液B（漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇），振荡混匀1min；将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；重复步骤-一次；离心管于磁力架上，56℃晾干10min；将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE缓冲液，56℃振荡混匀5min；将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，小心将得到的DNA转移至一个新离心管中，得粗品肝素钠的总DNA；
（2）、稀释：将步骤（1）得到的粗品肝素钠的总DNA用纯化水稀释成浓度为10000pg/mL、1000pg/mL、100pg/mL的DNA模板；
（3）PCR扩增：
①配置PCR体系，50μL反应体系如下:
DNA模板3μL
上游引物1μL
下游引物1μL
2倍PCR试剂预混液25μL
ddH2O补齐至50μL；
上述反应体系中的上游引物和下游引物采用牛源性成分鉴别引物：
上游引物：GCCATATACTCTCCTTGGTGACA
下游引物：GTAGGCTTGGGAATAGTACGA
2倍PCR试剂预混液为：Tris-HCl（pH8.3）20mmol/L、dNTP0.4mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl23mmol/L、taq酶0.05U/μl；
以纯化水替代DNA模板为阴性对照；
②PCR反应程序为:①在95℃下预变性5分钟；②在95℃下变性15秒；③在63℃下退火30秒；④在72℃下延伸30秒；热循环次数为40次；
对于上述三个不同浓度DNA模板以及阴性对照样品进行PCR扩增，得扩增产物；
（4）琼脂糖凝胶检测
取上述PCR的扩增产物20μL加入上样缓冲液（0.01MEDTA、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯氰、50%甘油）2μL，在质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶TAE电泳，电压100V，电泳20min，EB染色，紫外灯下观察，其结果见图1，可以看到本发明提供的方法可以检测到该样品中含有牛源性肝素钠成分，其特异性条带分子量大小为271bp。
实施例4鉴别猪原性粗品肝素钠中是否混杂了羊源性成分
（1）混杂样品配制：将羊源性的粗品肝素钠50mg与猪源性的粗品肝素钠450mg混合，得到含10%羊来源肝素钠的混合样品；将含10%羊源性肝素钠的混合样品50mg与猪源性的粗品肝素钠450mg混合，得到含1%羊源性肝素钠的混合样品；将含1%羊源性肝素钠的混合样品50mg与猪源性的粗品肝素钠450mg混合，得到含0.1%羊源性成分的猪源性粗品肝素钠混合样品；混合时需搅拌，颗粒状物质需压成粉末；
（2）分别提取三个浓度的混杂样品中总DNA：分别称取步骤（1）配制的含有10%、1%、0.1%羊源性成分的猪源性粗品肝素钠混合样品30mg各自溶于lmL的溶剂A中（100mL水中溶解有2gNaCl和10g乙醇的混合溶液），置于离心管中；分别向样本溶液中加入30μL生物磁珠，盖上管盖，振荡混匀10s；分别室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合，简短离心1-2s以收集附着在管壁及管盖的液体；分别将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时，小心去除液体；分别将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液A（漂洗液A为1L水中溶解有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl以及200g的PEG的混合溶液，pH7.0），振荡混匀1min；分别将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；分别将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液B（漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇），振荡混匀1min；分别将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；分别重复步骤-一次；分别将离心管于磁力架上，56℃晾干10min；分别将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE缓冲液（10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA，pH值为8.0），56℃振荡混匀5min；分别将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，小心将核酸溶液转移至一个新离心管中，得三份粗品肝素钠的总DNA，作为下一步扩增的DNA模板；
（3）PCR扩增：
①配置PCR体系，50μL反应体系如下:
DNA模板3μL
上游引物1μL
下游引物1μL
2倍PCR试剂预混液25μL
ddH2O补齐至50μL；
上述反应体系中的上游引物和下游引物采用羊源性成分鉴别引物：
上游引物ACACAACTTCTACCACAACCC
下游引物AAACAATGAGGGTAACGAGGG
2倍PCR试剂预混液为：Tris-HCl（pH8.3）20mmol/L、dNTP0.4mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl23mmol/L、taq酶0.05U/μl；
以纯化水替代DNA模板为阴性对照；
②PCR反应程序为：①在95℃下预变性5分钟；②在95℃下变性15秒；③在63℃下退火30秒；④在72℃下延伸30秒；热循环次数为40次；
对于上述三个不同浓度DNA模板以及阴性对照样品进行PCR扩增，得扩增产物；
（4）琼脂糖凝胶检测
取上述PCR的扩增产物20μL加入上样缓冲液（0.01MEDTA、0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯氰、50%甘油）2μL，在质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶TAE电泳，电压100V，电泳20min，EB染色，紫外灯下观察，其结果见图2。图中可以看到其特异性条带分子量大小为145bp，说明该粗品肝素钠中混有羊源性肝素钠，而且即使产品中仅混有质量百分比浓度为0.1%的羊源性肝素钠也可以被本发明提供的方法准确测定和鉴别。
实施例5本发明与对比例提取粗品肝素钠的总DNA的精确性比较
（1）称取猪源性粗品肝素钠300mg溶于lmL的溶剂A中（100mL中含有2gNaCl和10g乙醇的水溶液），得样本A；同时称取猪源性粗品肝素钠30mg溶于lmL纯水中，得样本B；分别置于两支离心管中，分别同步进行以下操作；
（2）分别向样本A和样本B中加入30μL生物磁珠，盖上管盖，振荡混匀10s；
（3）分别室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀10s，使磁珠和核酸充分结合，简短离心收集附着在管壁及管盖的液体；
（4）将离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附时，小心去除液体；
（5）将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液A（漂洗液A为1L水中溶解有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl以及200g的PEG的混合溶液，pH7.0），振荡混匀1min；
（6）将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；
（7）将离心管从磁力架上取下，加入500μL漂洗液B（漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇），振荡混匀1min；
（8）将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；
（9）重复步骤（7）-（8）一次；
（10）离心管于磁力架上，56℃晾干10min；
（11）将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE溶液（10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA，pH值为8.0），56℃振荡混匀5min；
（12）将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，小心将得到的核酸溶液分别转移至一个新离心管中，得粗品肝素钠的总DNA；
（13）将样本A和样本B得到的粗品肝素钠的总DNA各取20μL进行凝胶电泳，结果见图3。从图3中可以看出将粗品肝素钠溶于本发明特制的溶剂（2%的NaCl和10%的乙醇的水溶液）中的样本A其最终提取的DNA明显多于只溶于水的样品B。且经过紫外分光光度计测定DNA260nm的光度值，以OD260相当于50μg/mL的DNA，样本A得到总DNA的浓度约为0.8μg/μL，样本B得到总DNA的浓度约为0.2μg/μL。可见，使用本发明提供的方法中提取粗品肝素钠中总DNA步骤得到的DNA的数量明显高于对照样本B的DNA数量，而且本发明先将粗品溶于溶剂A中避免了肝素对PCR的抑制作用，以此说明采用本发明提供的方法提取待测粗品肝素钠具有更高的检测灵敏度，可用于猪源性粗品肝素钠中混杂有微量其他来源成分产品的准确鉴别。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）将待测粗品肝素钠溶于溶剂A中，再加入生物磁珠，通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA，得待测粗品肝素钠总DNA；所述溶剂A为每100mL水中溶有2g氯化钠和10g乙醇；所述粗品肝素钠、溶剂A、生物磁珠的质量体积比为30mg:1mL:30μL；
（b）设计猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别为：
猪源性成分鉴别引物：
上游引物：ATCTACATGATTCATTACAATTAC，
下游引物：CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA；
羊源性成分鉴别引物：
上游引物：ACACAACTTCTACCACAACCC，
下游引物：AAACAATGAGGGTAACGAGGG；
牛源性成分鉴别引物：
上游引物：GCCATATACTCTCCTTGGTGACA，
下游引物：GTAGGCTTGGGAATAGTACGA；
（c）以步骤（a）所得待测粗品肝素钠总DNA作为DNA模板，采用步骤（b）设计的猪、羊、牛源性成分鉴别引物分别进行PCR扩增，其扩增体系为：DNA模板3μL、上游引物1μL、下游引物1μL、2倍浓度PCR试剂预混液25μL，用ddH2O补齐至50μL；
PCR反应程序为：在95℃下预变性5min；在95℃下变性15s；在63℃下退火30s；在72℃下延伸30s；热循环40次；得扩增产物；
（d）将所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如得到了分子量大小为150bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有猪源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为145bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有羊源性肝素钠成分；如获得了分子量大小为271bp的特异性条带，则表明该待测粗品肝素钠中含有牛源性肝素钠成分。
2.根据权利要求1所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，步骤（a）所述的通过磁珠法提取粗品肝素钠中的总DNA的具体步骤是：①将加入生物磁珠的待测粗品肝素钠溶液置于离心管中振荡10s，置于室温孵育10min，振荡；②将离心管放置于磁力架上静置1min，除去液体；③将离心管从磁力架上取下，加入6倍生物磁珠体积的漂洗液A，振荡混匀1min；④将离心管放置于磁力架上静置1min，除去液体；⑤将离心管从磁力架上取下，再加入6倍生物磁珠体积的漂洗液B，振荡混匀1min；⑥将离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，去除液体；⑦重复步骤⑤-⑥一次；⑧再将离心管置于磁力架上，56℃晾干5-10min；⑨将离心管从磁力架上取下，加入20μL的TE缓冲液，56℃振荡混匀5min；⑩将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附后，分离得到的DNA即为待测粗品肝素钠总DNA。
3.根据权利要求2所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，所述漂洗液A为每1L水中溶有0.8mol的LiCl、0.5mol的NaCl和200g的PEG，其pH值为7.0；所述漂洗液B为质量百分比浓度为80%的乙醇。
4.根据权利要求1所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，步骤（c）中所述的2倍浓度PCR试剂预混液是指：Tris-HCl20mmol/L、dNTP0.4mmol/L、KCl100mmol/L、MgCl23mmol/L，taq酶0.05U/μL。
5.根据权利要求1所述的粗品肝素钠不同种属来源的快速鉴别方法，其特征在于，步骤（d）中所述扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳的具体工艺为：取20μL所述扩增产物加入上样缓冲液2μL，采用质量百分比浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳20min。
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