CN105693865B - 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 - Google Patents
包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105693865B CN105693865B CN201610052268.9A CN201610052268A CN105693865B CN 105693865 B CN105693865 B CN 105693865B CN 201610052268 A CN201610052268 A CN 201610052268A CN 105693865 B CN105693865 B CN 105693865B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- fragment
- crm197
- fusion protein
- interest
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 192
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 192
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 181
- 108010071134 CRM197 (non-toxic variant of diphtheria toxin) Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 title claims abstract description 13
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 title claims abstract description 8
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 149
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims abstract description 59
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 54
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 47
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 24
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 16
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 11
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 abstract description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 108
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 description 67
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 38
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 21
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 17
- 108010080271 hecolin Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 101710132653 Protein M2 Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101000977023 Azospirillum brasilense Uncharacterized 17.8 kDa protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101000961984 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 30.3 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000644901 Drosophila melanogaster Putative 115 kDa protein in type-1 retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 6
- 101000747702 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp2 Proteins 0.000 description 6
- 101000758599 Escherichia coli Uncharacterized 14.7 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000768930 Lactococcus lactis subsp. cremoris Uncharacterized protein in pepC 5'region Proteins 0.000 description 6
- 101000976302 Leptospira interrogans Uncharacterized protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101000778886 Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai (strain 56601) Uncharacterized protein LA_2151 Proteins 0.000 description 6
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 6
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 6
- 101001121571 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P2 Proteins 0.000 description 6
- 101000818098 Spirochaeta aurantia Uncharacterized protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 6
- 101001026590 Streptomyces cinnamonensis Putative polyketide beta-ketoacyl synthase 2 Proteins 0.000 description 6
- 101000750896 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized protein Synpcc7942_2318 Proteins 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 101000916321 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 101000760088 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 20.9 kDa protein Proteins 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 6
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N (2s)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-aminoacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HKZAAJSTFUZYTO-LURJTMIESA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010060123 Conjugate Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 229940031670 conjugate vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940031999 pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 229940031767 13-valent pneumococcal conjugate vaccine Drugs 0.000 description 1
- QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-azaniumylacetyl)amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetate Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O QMOQBVOBWVNSNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 229940124951 Menveo Drugs 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000156302 Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132593 Protein E2 Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 231100000645 Reed–Muench method Toxicity 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010001064 glycyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000000091 immunopotentiator Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55544—Bacterial toxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16311—Influenzavirus C, i.e. influenza C virus
- C12N2760/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16311—Influenzavirus C, i.e. influenza C virus
- C12N2760/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段在融合蛋白中作为分子内佐剂增强与其融合的目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本发明还涉及增强目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，形成融合蛋白。本发明还涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。本发明还涉及编码所述融合蛋白的分离的核酸，包含所述核酸的构建体和载体，以及包含所述核酸的宿主细胞。本发明还涉及所述融合蛋白的用途，其用于制备药物组合物或疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体而言，本发明涉及白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段在融合蛋白中作为分子内佐剂增强与其融合的目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的用途。本发明还涉及增强目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的免疫原性的方法，其包括将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，形成融合蛋白。本发明还涉及包含CRM197或其片段以及目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)的融合蛋白，其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。本发明还涉及编码所述融合蛋白的分离的核酸，包含所述核酸的构建体和载体，以及包含所述核酸的宿主细胞。本发明还涉及所述融合蛋白的用途，其用于制备药物组合物或疫苗。
背景技术
已对白喉毒素(diphtheria toxin，DT)进行了深入的研究。结构研究显示，白喉毒素由三个结构域组成：N端的催化结构域C(aa 1-190，C domain)(其也称为A片段)，中间转膜结构域T(aa 201-384，T domain)，以及C端的受体结合位点结构域R(aa 386-535，Rdomain)(Choe S,Bennett M,Fujii G,et al.，Nature.1992.357:216～222)。利用白喉毒素的前两个结构域与白介素2(IL-2)融合而制备的ONTAK(DAB389-IL-2)在1999年被美国FDA批准上市，用于成人皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。这证实白喉毒素的三个结构域可以进行拆分并发挥其各自的功能。
CRM197(Cross-Reacting Materials 197)是白喉毒素的一种无毒突变体(Uchida，T.，A.M,Pappenheimer，Jr.，R.Gregory，et al.,J.Biol.Chem.1973.248:3838-3844)，其与编码DT的野生型基因相比存在单个核苷酸突变，导致第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Ratti et al.,Nucleic AcidsResearch.1984.12：4063-4070)。
研究表明，CRM197虽然具有与野生型DT类似的结构(即，具有上述3个结构域)，但其A片段丧失了与NAD结合的能力，不能结合EF2并因而丧失了天然DT所具有的细胞毒性，这表明第52位氨基酸残基Gly在DT与NAD的结合中起着重要作用(K.Moyner,G.Christiansen,Acta path microbial immunolscand sect C.1984,92:17-23)。CRM197虽然丧失了细胞毒性，但其却保留了与野生型DT相当的、极强的免疫原性，因此其常被用作蛋白载体，用于与其他半抗原交联从而制备结合疫苗。
早在1985年，Porter等人就将Hib表面的多糖分别交联至CRM197和DT蛋白载体并制成疫苗，并且研究两者的免疫原性的差异。实验结果表明，两种交联疫苗的免疫效果没有显著差异，二者都能刺激幼儿机体产生较强的免疫反应和免疫记忆(Porter Anderson，Micheal E.Pichichero and Richard A.J.Clin.Invest.1985:52-59)。在比较与各种蛋白载体交联的肺炎球菌结合疫苗后发现，以CRM197为蛋白载体的疫苗在动物实验和临床试验中均能产生较好的免疫效果，且CRM197安全，无毒负作用(Black,S.,H.Shinefield,etal.Pediatr Infect Dis J,2000,19(3)；187-195)。目前以CRM197为蛋白载体的肺炎球菌结合疫苗主要有：PCV7、PCV9，PCV13等。临床试验结果证明，这些疫苗在2岁以下的儿童中均具有较好的免疫原性和安全性(Barricarte,A.,J.Castilla,et al.Clin Infect Dis,2007,44(11):1436-1441；Madhi,S.,P.Adrian,et al.Vaccine,2007,25(13):2451-2457；Duggan,S.T.Drugs,2010,70(15):1973-1986)。将CRM197与脑膜炎奈瑟氏菌(N.menigitidis)表面多糖交联可制备流行性脑膜炎的结合疫苗。例如，以CRM197为蛋白载体的Meningitec(Wyeth Pharmaceuticals)、Menjugate(Novartis vaccines)、Menveo(Novartis vaccines)等疫苗已经上市。
CRM197虽然失去酶活性和细胞毒性，但仍可与DT的特异受体HB-EGF(heparin-binding EGF-like growth factor，肝素结合性表皮生长因子)结合。因为这种受体一般在癌变组织中表达上调，所以CRM197与DT一样具有抗肿瘤效应(Buzzi,S.,D.Rubboli,etal.Immunotherapy,2004,53(11))。研究还发现，CRM197能透过血脑屏障(Blood-Brain-Barrier BBB)，从而可以用作脑部药物投递的载体(Gaillard,P.J.,and A.G.de Boer.JControl Release,2006,116(2)：60-62)。
虽然已报道CRM197具有多种功能，尤其是具有较强的免疫原性而可用作免疫佐剂，但是迄今为止从未报道过，CRM197可以用作分子内佐剂在融合蛋白中增强与其融合的目标蛋白的免疫原性。本发明以戊型肝炎衣壳蛋白为例，首次证实了CRM197或其片段在融合蛋白中能够增强与其融合的蛋白的免疫原性，从而可用作分子内佐剂。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，术语“CRM197”是指白喉毒素的一种无毒突变体，其与野生型白喉毒素相比，差异在于第52位的氨基酸残基由Gly变为Glu(G.Giannini，R.Rappuoli，G.Rattiet al.,Nucleic Acids Research.1984.12：4063-4070)。白喉毒素是本领域技术人员熟知的(参见例如，Choe S,Bennett M,Fujii G,et al.，Nature.1992.357:216-222)，其氨基酸序列可见于例如GenBank登录号AAV70486.1。
在本发明中，CRM197的示例性氨基酸序列提供于SEQ ID NO:2中。因此，在本发明中，当涉及CRM197的序列时，其使用SEQ ID NO:2所示的序列来进行描述。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸残基”中的第1-190位氨基酸残基是指，SEQ ID NO:2的第1-190位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，可在SEQ ID NO:2中天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响CRM197生物学特性。因此，在本发明中，术语“CRM197”意欲包括所有此类多肽和变体，包括SEQ ID NO:2所示的多肽以及其天然或人工的变体，所述变体保留了CRM197的生物学特性，即，具有强免疫原性且无细胞毒性。并且，当描述CRM197的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO:2所示的多肽的序列片段，还包括该多肽的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“CRM197的第1-190位氨基酸残基”意欲包括，SEQ ID NO:2的第1-190位氨基酸残基，以及SEQ ID NO:2所示的多肽的变体(天然或人工)中的相应片段。
根据本发明，戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)衣壳蛋白是指由HEV ORF2编码的蛋白。HEV ORF2的序列是本领域公知的(参见，例如DDBJ数据登录号：D11092)。在本发明中，当涉及HEV ORF2的序列时，其使用DDBJ数据登录号：D11092所示的序列来进行描述。例如，表述“HEV ORF2编码的多肽的第368-606位氨基酸残基”中的第368-606位氨基酸残基是指，D11092编码的多肽的第368-606位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HEV ORF2或其编码的多肽中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能(例如抗原性，免疫原性等等)。因此，在本发明中，术语“HEV ORF2”应包括所有此类序列和其变体，包括例如D11092所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HEV ORF2(或其编码的多肽)的序列片段时，其不仅包括D11092(或其编码的多肽)的序列片段，还包括D11092(或其编码的多肽)的天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HEV ORF2编码的多肽的第368-606位氨基酸残基”包括，D11092编码的多肽的第368-606位氨基酸残基，以及D11092编码的多肽的变体(天然或人工)中的相应片段。HEV衣壳蛋白的示例性氨基酸序列(D11092中的ORF2所编码的多肽)描述于SEQ IDNO:31中。
根据本发明，流感病毒(Influenza viruses)M2蛋白是指由A型或B型流感病毒基因组第七节段编码或C型流感病毒基因组第六节段编码的蛋白。流感病毒M2蛋白的示例性氨基酸序列描述于SEQ ID NO:32中。
根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
根据本发明，当在蛋白/多肽的背景中使用时，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与参照蛋白/多肽(例如，本发明的CRM197)的氨基酸序列相比，具有一个或多个(例如1-10个或1-5个或1-3个)氨基酸差异(例如，保守氨基酸置换)，或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了参照蛋白/多肽的必要特性。在本发明中，CRM197的必要特性可以指，具有强免疫原性且无细胞毒性；HEV衣壳蛋白和流感病毒M2蛋白的必要特性可以指其抗原性和/或免疫原性。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫***能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。免疫原性是抗原最重要的性质，一种抗原能否成功地诱导宿主产生免疫应答取决于三方面的因素：抗原的性质、宿主的反应性和免疫方式。
根据本发明，术语“免疫原性片段”是指这样的多肽片段，其至少部分地保留了所源自的蛋白的免疫原性。例如，HEV衣壳蛋白的免疫原性片段是指，HEV衣壳蛋白的至少部分地保留了免疫原性的片段，例如本发明中描述的HEV-239，E2或E2s等(参见，Li等人，J BiolChem.280(5):3400-3406(2005)；Li等人，PLoS Pathogens.5(8):e1000537(2009))；流感病毒M2蛋白的免疫原性片段是指，M2蛋白的至少部分地保留了免疫原性的片段，例如本发明中描述的M2e(参见，Fiers W等人，Vaccine.27(45):6280-6283(2009))。
根据本发明，HEV-239(或简称239)是指由HEV ORF2编码的多肽(即，HEV衣壳蛋白)的第368-606位氨基酸残基组成的多肽；E2是指由HEV ORF2编码的多肽的第394-606位氨基酸残基组成的多肽；E2s指由HEV ORF2编码的多肽的第455-606位氨基酸残基组成的多肽。
根据本发明，术语“M2e”是指，由流感病毒M2蛋白的第1-24位氨基酸残基组成的多肽。
在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达***”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达***，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
根据本发明，术语“分子内佐剂”是指这样的佐剂，其与目的蛋白(即，抗原)形成融合蛋白，从而其与抗原存在于一个相同的分子(即，包含其与抗原的融合蛋白)中，并充当该抗原的佐剂以增强该抗原的免疫原性。即，分子内佐剂是能够增强与之融合表达的目的蛋白(抗原)的免疫原性的佐剂，其通常为多肽片段。在本发明中，分子内佐剂特别地是指白喉毒素无毒突变体CRM197或其片段。
将两种或更多种蛋白融合表达以形成融合蛋白的技术是本领域公知的(参见例如，J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995)。通常，通过使用重组DNA技术将编码两种或更多种蛋白的DNA片段符合读框地连接在一起，并进行蛋白质表达来获得融合蛋白。任选地，可使用或不使用接头来将两种或更多种蛋白融合表达。
根据本发明，术语“接头”是指用于连接两个分子(例如蛋白)的短肽。通常，通过将编码该短肽的多核苷酸序列引入(例如，通过PCR扩增或连接酶)分别编码所要连接的两种目的蛋白的两个DNA片段之间，并进行蛋白质表达来获得融合蛋白，例如目的蛋白1-接头-目的蛋白2。如本领域技术人员公知的，接头包括但不限于柔性连接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3等等。
根据本发明，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HEV或流感病毒感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HEV或流感病毒感染)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现：在将CRM197或其片段与目的蛋白(例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段)融合表达后，CRM197或其片段显著增强了目的蛋白的免疫原性。即，CRM197或其片段可以通过与目的蛋白融合表达而作为分子内佐剂增强目的蛋白的免疫原性。
因此，在一个方面，本发明涉及一种融合蛋白，其包含CRM197或其片段以及目的蛋白，并且其中CRM197或其片段增强了目的蛋白的免疫原性。
在一个优选实施方案中，CRM197片段例如包含，CRM197的催化结构域C(aa 1-190，其在本申请中也称为A片段)，转膜结构域T(aa 201-384)，和/或受体结合位点结构域R(aa386-535)。例如，CRM197片段可以包含A片段，或者A片段和转膜结构域T。
在另一个优选实施方案中，CRM197片段包含CRM197的aa 1-190，例如包含CRM197的aa 1-389。在另一个优选实施方案中，CRM197片段由CRM197的aa 1-190或aa 1-389组成。在本申请中，CRM197的示例性氨基酸序列示于SEQ ID NO:2中，其相应的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1中。
在一个优选实施方案中，目的蛋白例如可以是HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。在另一个优选实施方案中，HEV衣壳蛋白的免疫原性片段可以包含或者是例如HEV-239(HEV衣壳蛋白aa 368-606)，E2(HEV衣壳蛋白aa 394-606)或E2s(HEV衣壳蛋白aa455-606)等。在另一个优选实施方案中，M2蛋白的免疫原性片段可以包含或者是例如M2e(M2蛋白aa 1-24)。
在一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白中的CRM197或其片段可连接至目的蛋白的N端和/或C端，任选地使用接头进行连接。用于连接2个肽段的接头是本领域公知的，包括但不限于柔性连接肽，例如Gly-Gly-Gly-Gly，Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，Gly-Gly-Ser-Ser和(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3等等。此类接头是本领域公知的，并且其选择完全在本领域技术人员的能力范围之内。
在一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白可以包含CRM197或其片段，以及HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接。例如，根据本发明的融合蛋白可以是具有SEQ ID NO:4，6，8，10，12，14，16或18所示氨基酸序列的蛋白。
在一个优选实施方案中，根据本发明的融合蛋白可以包含CRM197或其片段，以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接。例如，根据本发明的融合蛋白可以是具有SEQ ID NO:34，36，38，40，42或44所示氨基酸序列的蛋白。
在本发明的融合蛋白中，CRM197或其片段出人意料地显著增强了与之融合(任选地，使用接头)的目的蛋白例如HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性，从而可用作分子内佐剂。
在另一个方面，本发明提供了编码如上所定义的融合蛋白的多核苷酸。还提供的是包含此类多核苷酸的构建体。
在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含编码如上所定义的融合蛋白的多核苷酸或者含有此类多核苷酸的构建体。本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。
在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
在另一个方面，还提供了包含本发明的多核苷酸或构建体或载体的宿主细胞或者生物体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。在一个实施方案中，所述生物体是植物或者动物。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含根据本发明的融合蛋白，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。取决于融合蛋白中所使用的目的蛋白，本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防和/或治疗各种疾病(即，能够被目的蛋白预防和/或治疗的疾病)。例如，当使用的目的蛋白是HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段时，本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗HEV感染和与HEV感染相关的疾病例如戊型肝炎；当使用的目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段时，本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗流感病毒感染和与流感病毒感染相关的疾病例如流感。
在另一个方面，本发明还涉及根据本发明的融合蛋白用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗能够被目的蛋白预防和/或治疗的疾病。取决于融合蛋白中所使用的目的蛋白，本发明的药物组合物可以用于预防和/或治疗各种疾病。例如，当使用的目的蛋白是HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段时，本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗HEV感染和与HEV感染相关的疾病例如戊型肝炎；当使用的目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段时，本发明的药物组合物可用于预防和/或治疗流感病毒感染和与流感病毒感染相关的疾病例如流感。
在另一个方面，本发明还涉及预防和/或治疗HEV感染或与HEV感染相关的疾病例如戊型肝炎的方法，其包括施用有效量的根据本发明的融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接。
在另一个方面，本发明还涉及预防和/或治疗流感病毒感染或与流感病毒感染相关的疾病例如流感的方法，其包括施用有效量的根据本发明的融合蛋白或包含所述融合蛋白的药物组合物，所述融合蛋白包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接。
在另一个方面，本发明提供了增强目的蛋白的免疫原性的方法，其包括获得包含上文所定义的CRM197或其片段与目的蛋白的融合蛋白，从而增强目的蛋白的免疫原性。
在一个优选实施方案中，任选地使用上文所定义的接头，将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，从而获得融合蛋白。在一个优选实施方案中，目的蛋白是如上所述的HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了增强HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的方法，其包括获得包含CRM197或其片段与HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白，从而增强HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段的免疫原性。在一个优选实施方案中，任选地使用接头，将CRM197或其片段与HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段融合表达，从而获得融合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了增强流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的方法，其包括获得包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白，从而增强流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性。在一个优选实施方案中，任选地使用接头，将CRM197或其片段与流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段融合表达，从而获得融合蛋白。
在另一个方面，本发明涉及CRM197或其片段用于增强目的蛋白的免疫原性的用途，其特征在于获得包含CRM197或其片段与目的蛋白的融合蛋白。
在一个优选实施方案中，任选地使用接头，将CRM197或其片段与目的蛋白融合表达，从而获得融合蛋白。在一个优选实施方案中，目的蛋白是如上所述的HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及CRM197或其片段用于增强HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的用途，其特征在于获得包含CRM197或其片段与HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白。在一个优选实施方案中，任选地使用接头，将CRM197或其片段与HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段融合表达，从而获得融合蛋白。
在另一个实施方案中，本发明涉及CRM197或其片段用于增强流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的免疫原性的用途，其特征在于获得包含CRM197或其片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段的融合蛋白。在一个优选实施方案中，任选地使用接头，将CRM197或其片段与流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段融合表达，从而获得融合蛋白。
发明的有益效果
本发明首次证实，CRM197及其片段可以用作分子内佐剂，用于增强目的蛋白的免疫原性。因此，本发明提供了CRM197及其片段的新用途，并且提供了新的增强目的蛋白的免疫原性的方法。
此外，由于本发明的融合蛋白展示了比单独的目的蛋白更强的免疫原性，因此，本发明为制备药物或者疫苗提供了新的选择，并且可以实现更有效地预防和治疗相应疾病。
例如，本发明的包含CRM197(或其片段)以及HEV衣壳蛋白(或其免疫原性片段)的融合蛋白展示比单独的HEV衣壳蛋白(或其免疫原性片段)更强的免疫原性，从而该融合蛋白可以用于制备药物组合物，且更有效地预防和治疗HEV感染和与HEV感染相关的疾病例如戊型肝炎。
例如，本发明的包含CRM197(或其片段)以及流感病毒M2蛋白(或其免疫原性片段)的融合蛋白展示比单独的流感病毒M2蛋白(或其免疫原性片段)更强的免疫原性，从而该融合蛋白可以用于制备药物组合物，且更有效地预防和治疗流感病毒感染和与流感病毒感染相关的疾病例如流感。例如，当将M2e蛋白融合至CRM197(或其片段)的N端时，所形成的融合蛋白可形成四聚体或其他多聚体构象，并且在体外与保护性单抗O19(参见，Fu等，Virology,2009,385:218-226)具有良好的反应性(参见图12B)，且在体内具有良好的免疫原性(参见图14)，因此，所形成的融合蛋白可用于研制通用的流感疫苗。
关于序列信息的说明
本发明涉及的序列的信息提供于下表中。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了在实施例2中构建的各种融合蛋白的克隆设计。其中，使用的接头(Linker，在本申请中也简写为L)为15个氨基酸残基的柔性片段，其序列为GGGGSGGGGSGGGG；使用的CRM197包含535个氨基酸，其序列示于SEQ ID NO:2；389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸残基(aa 1-389)的多肽；A是指包含CRM197的第1-190位氨基酸残基(aa 1-190)的多肽；E2是指包含HEV衣壳蛋白第394-606位氨基酸残基(aa 394-606)的多肽；E2s是指包含HEV衣壳蛋白第455-606位氨基酸残基(aa 455-606)的多肽。
图2显示了实施例2中构建的融合蛋白的表达、纯化和复性的SDS-PAGE分析结果。其中，图2A使用的样品为菌体超声破碎后离心获得的沉淀(即包涵体)，图2B使用的样品为4M尿素溶解上清，图2C使用的样品为8M尿素溶解上清，图2D使用的样品为复性至PBS中的蛋白。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：CRM197-L-E2；泳道2：CRM197-L-E2s；泳道3：389-L-E2；泳道4：389-L-E2s；泳道5：389-E2s；泳道6：A-L-E2；泳道7：A-L-E2s；泳道8：A-E2s。结果显示，所构建的融合蛋白均可在包涵体中表达，并且A-L-E2和A-L-E2s在4M和8M尿素中均可溶解，而其余融合蛋白则需8M尿素才能溶解。此外，结果还显示，经透析复性后可获得纯度在80％左右的融合蛋白。
图3显示了经层析纯化后的融合蛋白A-L-E2的SDS-PAGE结果。其中，泳道1为经层析纯化后复性至PBS中的A-L-E2，泳道2为经沸水煮10分钟的泳道1的A-L-E2样品。结果显示，经过两步层析纯化后，A-L-E2的纯度可达到90％以上。
图4显示了使用实施例2中构建的融合蛋白与HEV中和单抗8C11进行的蛋白质印迹(Western blotting)的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：对照蛋白HEV-239；泳道2：对照蛋白E2，泳道3：CRM197-L-E2；泳道4：CRM197-L-E2s；泳道5：389-L-E2；泳道6：389-L-E2s；泳道7：389-E2s；泳道8：A-L-E2；泳道9：A-L-E2s；泳道10：A-E2s。结果显示，测试的所有融合蛋白与HEV特异性中和单抗8C11均具有显著的反应性。
图5显示了使用实施例2中构建的融合蛋白与HEV特异性单抗进行的间接法ELISA的结果。横坐标为用于ELISA的HEV特异性单抗或CRM197多抗血清，纵坐标为同样的抗体稀释浓度下ELISA测定的OD读值。图5A显示了包含E2的融合蛋白的ELISA结果，图5B显示了包含E2s的融合蛋白的ELISA结果。结果显示，E2s蛋白与CRM197或其片段融合后，与HEV特异性单抗的反应性显著提高，其中A-L-E2s和A-E2S的反应性提高最为显著；E2蛋白与CRM197或其片段融合后，保留或提高了与HEV特异性单抗的反应性。
图6显示了使用蛋白A-L-E2、HEV-239或E2与HEV特异性单抗进行的间接法ELISA的结果，其中截断值(cutoff)定义为3倍阴性均值。结果显示，A-L-E2与HEV特异性单抗的反应性与HEV-239和E2蛋白相当。
图7显示了融合蛋白A-L-E2的沉降速率(Sedimentation Velocity,SV)的分析结果。结果显示，融合蛋白A-L-E2主要以二聚体形式存在，并且存在少量的四聚体。
图8显示了实施例2中构建的融合蛋白与HEV-239的免疫原性的比较。在0周时进行初次免疫，在2周和4周时进行加强免疫，初次免疫和加强免疫的剂量均为5μg或均为0.5μg。图8A为5μg剂量组的免疫血清的抗体滴度的比较结果，图8B为0.5μg剂量组的免疫血清的抗体滴度的比较结果。结果显示，在5μg和0.5μg剂量组中，小鼠血清在第四周均发生抗HEV阳转，并且抗体滴度在第五或六周时达到最高。特别地，在5μg剂量组中，使用A-L-E2获得的抗体滴度最高，其在第6周时高达106；并且，各融合蛋白诱导的抗体滴度均高于HEV-239蛋白或与之相当。在0.5μg剂量组中，各融合蛋白诱导的抗体滴度均显著高于HEV-239，并且A-L-E2蛋白在第5周时诱导的抗体滴度高达106。此外，在5μg和0.5μg剂量组中，使用E2和E2s获得的免疫血清均没有发生阳转。从以上结果可知，实施例2所构建的各种融合蛋白的免疫原性均显著高于单独的抗原蛋白(E2和E2s)，这表明本发明的CRM197或其片段显著增强了与其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子内佐剂。
图9显示了在实施例6中构建的各种融合蛋白的克隆设计。其中，使用的接头(Linker，在本申请中也简写为L)为10个氨基酸残基的柔性片段，其序列为GGGGSGGGGS；使用的CRM197包含535个氨基酸，其序列示于SEQ ID NO:2；389是指包含CRM197的第1-389位氨基酸残基(aa 1-389)的多肽；A是指包含CRM197的第1-190位氨基酸残基(aa 1-190)的多肽；M2是指流感病毒M2蛋白，其序列示于SEQ ID NO:32；M2e是指包含流感病毒M2蛋白的第1-24位氨基酸残基(aa1-24)的多肽。
图10展示了实施例6中构建的融合蛋白的表达、纯化和复性的SDS-PAGE分析结果。其中，泳道M：蛋白分子量标记。
图10A使用的样品为菌体超声破碎后离心获得的沉淀(即包涵体)和上清：
泳道1：从用CRM197-L-M2e转化的菌体获得的包涵体；
泳道2：从用CRM197-L-M2e转化的菌体获得的上清；
泳道3：从用389-L-M2e转化的菌体获得的包涵体；
泳道4：从用389-L-M2e转化的菌体获得的上清；
泳道5：从用A-L-M2e转化的菌体获得的包涵体；
泳道6：从用A-L-M2e转化的菌体获得的上清。
图10B使用的样品为菌体超声破碎后离心获得的沉淀(即包涵体)和上清：
泳道1：从用M2e-L-A转化的菌体获得的包涵体；
泳道2：从用M2e-L-A转化的菌体获得的上清；
泳道3：从用M2e-L-389转化的菌体获得的包涵体；
泳道4：从用M2e-L-389转化的菌体获得的上清；
泳道5：从用M2e-L-CRM197转化的菌体获得的包涵体；
泳道6：从用M2e-L-CRM197转化的菌体获得的上清。
图10C使用的样品为经分离且复性至PBS中的融合蛋白，并且在进行SDS-PAGE分析时，未使用β-巯基乙醇，且蛋白样品经煮沸处理(10分钟)或者未经煮沸处理：
泳道1：A-L-M2e蛋白，未经煮沸处理的；
泳道2：A-L-M2e蛋白，经煮沸处理的；
泳道3：389-L-M2e蛋白，未经煮沸处理的；
泳道4：389-L-M2e蛋白，经煮沸处理的；
泳道5：CRM197-L-M2e蛋白，未经煮沸处理的；
泳道6：CRM197-L-M2e蛋白，经煮沸处理的。
图10D使用的样品为经分离且复性至PBS中的融合蛋白，并且在进行SDS-PAGE分析时，使用了β-巯基乙醇，且蛋白样品经煮沸处理(10分钟)或者未经煮沸处理：
泳道1：A-L-M2e蛋白，未经煮沸处理的；
泳道2：A-L-M2e蛋白，经煮沸处理的；
泳道3：389-L-M2e蛋白，未经煮沸处理的；
泳道4：389-L-M2e蛋白，经煮沸处理的；
泳道5：CRM197-L-M2e蛋白，未经煮沸处理的；
泳道6：CRM197-L-M2e蛋白，经煮沸处理的。
图10E使用的样品为经分离且复性至PBS中的融合蛋白，并且在进行SDS-PAGE分析时，未使用β-巯基乙醇，且蛋白样品经煮沸处理(10分钟)或者未经煮沸处理：
泳道1：M2e-L-A蛋白，未经煮沸处理的；
泳道2：M2e-L-A蛋白，经煮沸处理的；
泳道3：M2e-L-389蛋白，未经煮沸处理的；
泳道4：M2e-L-389蛋白，经煮沸处理的；
泳道5：M2e-L-CRM197蛋白，未经煮沸处理的；
泳道6：M2e-L-CRM197蛋白，经煮沸处理的。
图10F使用的样品为经分离且复性至PBS中的融合蛋白，并且在进行SDS-PAGE分析时，使用了β-巯基乙醇，且蛋白样品经煮沸处理(10分钟)或者未经煮沸处理：
泳道1：M2e-L-A蛋白，未经煮沸处理的；
泳道2：M2e-L-A蛋白，经煮沸处理的；
泳道3：M2e-L-389蛋白，未经煮沸处理的；
泳道4：M2e-L-389蛋白，经煮沸处理的；
泳道5：M2e-L-CRM197蛋白，未经煮沸处理的；
泳道6：M2e-L-CRM197蛋白，经煮沸处理的。
图10A-10F的结果显示，所构建的融合蛋白均可在包涵体中表达，并且经纯化和复性后，可获得纯度为80％左右的融合蛋白。
图11显示了使用实施例6中构建的融合蛋白与抗M2e单抗5D1以及CRM197单抗1E6进行的蛋白质印迹的结果。其中，图11A，11B，11C和11D的泳道1-6所代表的样品分别对应于图10C，10D，10E和10F的泳道1-6所代表的样品，且使用抗M2e特异性单抗5D1。图11E，11F，11G和11H的泳道1-6所代表的样品分别对应于图10C，10D，10E和10F的泳道1-6所代表的样品，且使用CRM197特异性单抗1E6。结果显示，测试的所有融合蛋白与抗M2e特异性单抗5D1以及CRM197特异性单抗1E6均具有显著的反应性。
图12显示了使用实施例6中构建的融合蛋白与各种抗M2e特异性单抗进行的间接法ELISA的结果。横坐标为用于ELISA的抗M2e特异性单抗以及抗CRM197特异性单抗，纵坐标为同样的抗体稀释浓度下ELISA测定的OD读值。其中，图12A显示了M2e融合在CRM197或其片段的C端的融合蛋白的ELISA结果，图12B显示了M2e融合在CRM197或其片段的N端的融合蛋白的ELISA结果。结果显示，与单独的M2e蛋白相比，包含M2e蛋白以及CRM197或其片段的融合蛋白，与各种抗M2e特异性单抗的反应性保持不变或者显著提高。
图13显示了实施例6中构建的各种融合蛋白的沉降速率的分析结果。其中，图13A：CRM197-L-M2e；图13B：389-L-M2e；图13C：A-L-M2e；图13D：M2e-L-CRM197；图13E：M2e-L-389；图13F：M2e-L-A。结果显示，融合蛋白A-L-M2e和M2e-L-A主要以单体和四聚体的形式存在；389-L-M2e主要以二聚体和多聚体形式存在；M2e-L-389主要以单体和多聚体形式存；CRM197-L-M2e主要以二聚体和多聚体形式存在；和，M2e-L-CRM197主要以单体和多聚体形式存在。
图14显示了实施例6中构建的融合蛋白与GST-M2e的免疫原性的比较。在0周时进行初次免疫，在2周和4周时进行加强免疫，初次免疫和加强免疫的剂量均为5μg或均为0.5μg。图14A为5μg剂量组的免疫血清的抗体滴度的比较结果，图14B为0.5μg剂量组的免疫血清的抗体滴度的比较结果。结果显示，在5μg和0.5μg剂量组中，在第二次加强免疫后，各融合蛋白诱导的抗体滴度均显著高于GST-M2e。从上述结果可知，实施例6所构建的各种融合蛋白的免疫原性均显著高于单独的抗原蛋白(GST-M2e)，这表明本发明的CRM197或其片段(无论其是位于融合蛋白的N端，还是C端)显著增强了与其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子内佐剂。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.CRM197基因的克隆
以从购自ATCC(NO 53281)的白喉棒状杆菌C7(β197)菌株中提取的基因组DNA作为模板，以CRM197F(SEQ ID NO：19)为正向引物，CRM197R(SEQ ID NO：20)为反向引物，在PCR仪(Biometra，T3)中按照如下条件进行PCR反应，从而制备编码CRM197的全长基因。
PCR扩增后，得到大小特异的1.6kb左右的产物。经测序获得扩增产物(即，CRM197全长基因)的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，其编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。
实施例2.包含CRM197或其片段以及HEV衣壳蛋白片段的融合蛋白的设计与克隆
在本实施例中，示例性地构建了表达融合蛋白的载体。所构建的各种示例性融合蛋白的克隆设计参见图1，其各自包含CRM197或其片段以及HEV衣壳蛋白片段，并且任选地使用接头。
使用接头的融合蛋白的克隆
以实施例1获得的扩增产物(即，CRM197全长基因)为模板，以CRM197F(SEQ ID NO：19)为正向引物(在其5'端引入限制性内切酶NdeI位点CAT ATG，ATG为大肠杆菌***中的起始密码子)，并且分别以CRM197-linker R(SEQ ID NO：21)、389-linker R(SEQ ID NO：22)、A-linker R(SEQ ID NO：23)为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶BamHI位点GGA TCC)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。所使用的引物的序列列于表1。
扩增产物分别为1600bp、1200bp和600bp左右的大小特异的DNA片段。
另外，以pTO-T7-E2(Li，et al.JBC.2005.28(5):3400-3406)为模板，分别以E2F(SEQ ID NO：24)和E2sF(SEQ ID NO：25)为正向引物(其5'端引入限制性内切酶BamHI位点GGA TCC),以Drp59R(SEQ ID NO：26)为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶EcoRI位点GAA TTC)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。
扩增产物分别为600bp和450bp左右的大小特异的DNA片段。
将以上得到的扩增产物分别与商售的pMD 18-T载体(TAKARA公司生产)连接，并分别命名为pMD 18-T-CRM197-L、pMD 18-T-389-L和pMD 18-T-A-L以及pMD 18-T-E2和pMD18-T-E2s。分别经NdeI/BamHI和BamHI/EcoRI酶切鉴定，得到pMD 18-T-CRM197-L、pMD 18-T-389-L、pMD 18-T-A-L、pMD 18-T-E2和pMD 18-T-E2s的阳性克隆。
利用M13(+)引物确证，所获得的pMD 18-T-CRM197-L、pMD18-T-389-L、pMD 18-T-A-L、pMD 18-T-E2和pMD 18-T-E2s中均***了正确的目的核苷酸序列。
将pMD 18-T-CRM197-L、pMD 18-T-389-L和pMD 18-T-A-L质粒用NdeI/BamHI酶切。然后将所获得的酶切片段连接入经NdeI/BamHI酶切处理的pTO-T7原核表达载体(罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57)中，并转入大肠杆菌ER2566(购自Invitrogen公司)；提取质粒，经NdeI/BamHI酶切鉴定得到分别***了CRM197-L、389-L和A-L片段的阳性质粒pTO-T7-CRM197-L、pTO-T7-389-L和pTO-T7-A-L。
用BamHI/EcoRI酶切处理pTO-T7-CRM197-L、pTO-T7-389-L、pTO-T7-A-L、pMD 18-T-E2和pMD 18-T-E2s。将获得的E2和E2s片段的每一个分别连接到BamHI/EcoRI酶切处理后的pTO-T7-CRM197-L、pTO-T7-389-L和pTO-T7-A-L载体上。经NdeI/EcoRI酶切鉴定得到分别***了CRM197-L-E2(SEQ ID NO:3,4)、CRM197-L-E2s(SEQ ID NO:5,6)、389-L-E2(SEQ IDNO:7,8)、389-L-E2s(SEQ ID NO:9,10)、A-L-E2(SEQ ID NO:11,12)或A-L-E2s(SEQ ID NO:13,14)的阳性表达载体pTO-T7-CRM197-L-E2、pTO-T7-CRM197-L-E2s、pTO-T7－389-L-E2、pTO-T7-389-L-E2s、pTO-T7-A-L-E2和pTO-T7-A-L-E2s。
不使用接头的融合蛋白389-E2s和A-E2s的克隆
利用3个PCR反应构建表达389-E2s和A-E2s的载体。第1个PCR反应以CRM197全长基因为模板，以CRM197F为正向引物(在其5'端引入限制性内切酶NdeI位点CAT ATG，ATG为大肠杆菌***中的起始密码子)；分别以389-E2s R(SEQ ID NO:27)和A-E2s R(SEQ ID NO:28)为反向引物进行扩增，获得融合蛋白的N端片段。第2个PCR反应以CRM197全长基因为模板，分别以389-E2s F(SEQ ID NO:29)和A-E2s F(SEQ ID NO:30)为正向引物，以DrP59R为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶EcoRI位点GAA TTC)进行扩增，获得融合蛋白的C端片段。第1个和第2个PCR反应在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行。
第3个PCR反应以对应的第1个和第2个PCR反应的扩增产物为模板(如以389-E2sF和389-E2sR为引物得到的2个片段作为用于扩增389-E2s的模板)，以CRM197F和DrP59R为引物，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行扩增。
扩增产物分别为1600bp和1000bp左右的特异性DNA片段。将得到的扩增产物分别与商售的pMD 18-T载体(TAKARA公司生产)连接，然后分别经NdeI/EcoRI酶切鉴定，得到pMD18-T-389-E2s和pMD18-T-A-E2s的阳性克隆。
利用M13(+)引物确证，所获得的pMD 18-T-389-E2s和pMD 18-T-A-E2s中分别***了正确的目的核苷酸序列SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17，其编码的氨基酸序列分别为SEQID NO:16和SEQ ID NO:18。
将pMD 18-T-389-E2s和pMD 18-T-A-E2s质粒用NdeI/EcoRI酶切。然后将所获得的酶切片段分别连接入经NdeI/EcoRI酶切处理的pTO-T7原核表达载体(罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57)中。然后经NdeI/EcoRI酶切鉴定得到分别***了389-E2s和A-E2s的阳性表达载体pTO-T7-389-E2s和pTO-T7-A-E2s。
本实施例中使用的引物的序列列于表1。
表1：引物序列
取1μL的pTO-T7-CRM197-L-E2、pTO-T7-CRM197-L-E2s、pTO-T7－389-L-E2、pTO-T7-389-L-E2s、pTO-T7-389-E2s、pTO-T7-A-L-E2、pTO-T7-A-L-E2s和pTO-T7-A-E2s质粒(0.15mg/ml)分别转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自Invitrogen公司)，将其涂布于含卡那霉素(终浓度100mg/ml，下同)的固体LB培养基(成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管，在37℃180转/分钟下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃保存。
实施例3.实施例2所构建的融合蛋白的表达与纯化
融合蛋白的表达与包涵体纯化
从-70℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃180rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右，再转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃180rpm下振荡培养4-5小时。当OD600达1.5左右时，加入IPTG至终浓度0.4mM，在37℃下振荡诱导4个小时。
诱导后，以8000g离心5min收集菌体，然后按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl)的比例用裂解液重悬菌体，冰浴，用超声破碎仪(Sonics VCX750型超声破碎仪)处理菌体(处理条件：工作时间15min，脉冲2s，暂停4s，输出功率55％)。菌体裂解液以12000rpm，4℃离心5min(下同)，弃上清保留沉淀(即包涵体)；然后用等体积2％Triton-100洗涤沉淀，振荡30min，离心弃上清；再用Buffer I(20mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，5mM EDTA)重悬沉淀，振荡30min，离心弃上清；然后用2M尿素重悬沉淀，37℃振荡30min，离心得上清和沉淀；保留上清，并继续用等体积4M尿素重悬沉淀，37℃振荡30min，以12000rpm，4℃离心15min得上清和沉淀；保留上清(即，4M尿素溶解上清)，并继续用等体积8M尿素重悬沉淀，37℃振荡30min，离心并保留上清(即，8M尿素溶解上清)。
获得的各种级分的SDS-PAGE分析(以考马斯亮蓝染色进行显现，下同，方法参照《分子克隆》第2版)如图2所示。结果表明，融合蛋白均表达于包涵体中(见图2A)，并且CRM197-L-E2、389-L-E2、A-L-E2、A-E2s主要溶于4M尿素中(见图2B)，CRM197-L-E2s、389-L-E2s、A-L-E2s、389-E2s主要溶于8M尿素中(见图2C)。将包含有融合蛋白的4M尿素溶解上清或者8M尿素溶解上清透析到PBS中，得到纯度为80％左右的融合蛋白(见图2D)。
融合蛋白A-L-E2的阴离子交换色谱纯化
样品为如上所述获得的纯度为约80％的A-L-E2蛋白溶液。
仪器***：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱***。
层析介质：Q Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司)。
柱规格：15mm×20cm。
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH 7.7+4M尿素
20mM磷酸盐缓冲液pH 7.7+4M尿素+1M NaCl。
流速：6mL/min
检测器波长：280nm。
洗脱程序为：150mM NaCl洗脱目的蛋白，300mM NaCl洗脱杂蛋白。收集150mM NaCl洗脱级分。
融合蛋白A-L-E2的疏水相互作用色谱纯化
仪器***：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱***。
层析介质：Phenyl Sepharose Fast Flow(GE Healthcare公司)。
柱体积：15mm×20cm
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH 7.7+4M尿素+0.5M(NH4)2SO4
20mM磷酸盐缓冲液pH 7.7+4M尿素
流速：5mL/min。
检测器波长：280nm。
样品：将前一步骤获得的150mM NaCl洗脱级分透析至20mM磷酸盐缓冲液pH 7.7+4M尿素+0.5M(NH4)2SO4缓冲液中，用作样品。
洗脱程序为：0.3M(NH4)2SO4洗脱杂蛋白，0.1M及0M(NH4)2SO4洗脱目的蛋白，收集0.1M及0M(NH4)2SO4洗脱级分。
将上述0.1M及0M(NH4)2SO4洗脱级分透析复性至PBS中，然后取10μl进行SDS-PAGE分析；以考马斯亮兰染色显示电泳条带。结果显示，经过上述纯化步骤后，A-L-E2融合蛋白的纯度大于90％(参见图3)。
实施例4.实施例2所构建的融合蛋白的性质分析
通过蛋白质印迹法测定融合蛋白的抗体反应性
通过蛋白质印迹法测定各融合蛋白与HEV中和单抗8C11(参见，Zhang等人,Vaccine.23(22):2881-2892(2005))和抗CRM197多抗血清(使用本领域公知的方法，通过用CRM197免疫小鼠而制备获得该血清，并且该血清用商售的CRM197进行了反应性确认)的反应性。经透析复性的样品经SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维膜上，用于进行杂交；用5％脱脂奶封闭膜2h，然后加入按一定比例稀释(单抗以1:500稀释，多抗血清以1:1000稀释)的单抗8C11，反应1h；用TNT(50mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)，150mmol/L NaCl，0.05％Tween 20)洗膜3次，每次10min；然后加入羊抗鼠碱性磷酸酶(KPL产品)，反应1h；用TNT洗膜3次，每次10min；然后用NBT和BCIP(PROTOS产品)显现。用各融合蛋白与HEV中和单抗8C11进行的蛋白质印迹法的检测结果示于图4。结果显示，所有的融合蛋白与HEV特异性中和单抗8C11均具有显著的反应性。
通过EILSA检测融合蛋白与多株HEV特异性抗体的反应性
通过间接EILSA检测各融合蛋白以及对照蛋白E2和HEV-239与多株HEV特异性抗体(顾颖等人，病毒学报.19(3):217-223(2003))的反应性。将经透析复性的样品稀释于1XPBS(1μg/ml)中，然后以100μl/孔加入96孔微孔板(北京万泰公司)中，并在37℃下温育2h；弃去包被液，用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗板一次，然后加入200μl/孔封闭液(2％明胶，5‰Casein，1‰Proclin300，于PBS中)，并在37℃下温育2h；检测时弃去封闭液，以100μl/孔加入按一定比例稀释(检测E2s及其融合蛋白时，以1:10000稀释；检测E2及其融合蛋白时，以1:100000稀释；对比检测A-L-E2、239和E2蛋白的反应性时，单抗以1mg/ml的初始浓度进行10倍梯度系列稀释，多抗则以原始浓度进行同样的稀释)的HEV单抗，并在37℃下温育1-2h；用PBST洗板五次，然后以100μl/孔加入HRP标记的羊抗鼠(KPL产品)(1：5000)，并在37℃下温育30min；用PBST洗板五次，然后以100μl/孔加入HRP底物(北京万泰公司生产)，并在37℃下温育15min；以50μl/孔加入2M硫酸终止反应，然后用酶标仪(Sunrise型号，Tecan公司产品)读取OD450/620值。各融合蛋白与各单抗的ELISA检测结果示于图5。结果显示，E2s蛋白在与CRM197或其片段融合后，与单抗的反应性显著提高，其中A-L-E2s和A-E2s的活性提高最为显著；E2蛋白在与CRM197或其片段融合后，均保留了与HEV特异性单抗的反应性。
经层析纯化的融合蛋白A-L-E2的反应性分析
使用间接法ELISA对经两步层析纯化的融合蛋白A-L-E2的反应性进行分析(具体方法可参见上一步骤)。该ELISA的结果示于图6。结果显示，A-L-E2与HEV特异性单抗的反应性与对照蛋白HEV-239和E2相当。
融合蛋白A-L-E2的沉降速率分析
本实验中使用的仪器为美国Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测***及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法(c(s)算法，参见P.Schuck等人,Biophys J78:1606-1619(2000))分析制备的融合蛋白A-L-E2的沉降系数。分析结果示于图7。结果显示，融合蛋白A-L-E2主要以二聚体形式存在，并且部分二聚体可进一步聚合成四聚体形式。
实施例5.实施例2所构建的融合蛋白的免疫原性分析
融合蛋白的诱导抗体滴度
本实验中使用的小鼠为雌性，6周龄BALB/C小鼠。使用铝佐剂，将通过实施例3的方法制备的复性至PBS中的融合蛋白以及对照蛋白HEV-239、E2和E2s分别腹腔注射入小鼠中以进行免疫，注射体积为1ml，并且使用2个剂量组(5μg剂量组或者0.5μg剂量组)。在0周时进行初次免疫，在2周和4周时进行加强免疫。
用HEV-239包板，通过与上述类似的间接ELISA法来检测融合蛋白以及对照蛋白诱导的血清抗体滴度。免疫后三个月内的血清抗体滴度的检测结果示于图8。结果显示，在5μg和0.5μg剂量组中，小鼠血清在第四周均发生抗HEV阳转，并且抗体滴度在第五或六周时达到最高。特别地，在5μg剂量组中，使用A-L-E2获得的抗体滴度最高，其在第6周时高达106；并且，各融合蛋白诱导的抗体滴度均高于HEV-239蛋白或与之相当。在0.5μg剂量组中，各融合蛋白诱导的抗体滴度均显著高于HEV-239，并且A-L-E2蛋白在第5周时诱导的抗体滴度高达106。此外，在5μg和0.5μg剂量组中，使用E2和E2s获得的免疫血清均没有发生阳转。从以上结果可知，所构建的融合蛋白的免疫原性均显著高于单独的抗原蛋白(E2和E2s)，这表明本发明的CRM197或其片段显著增强了与其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子内佐剂。
融合蛋白A-L-E2的半数有效剂量(ED50)的考察
在本实验中，通过测定半数有效剂量(ED50)来考察融合蛋白的免疫原性。所使用的实验动物为3-4周龄的雌性BALB/c小鼠。将A-L-E2与铝佐剂混合，起始剂量为1μg/只，以1:3进行连续稀释，共计八个剂量组。另外，将HEV-239(戊肝重组疫苗)作为对照，其起始剂量为1.6μg/只，以1:4进行连续稀释，共计4个剂量组。以上每组各使用6只小鼠，免疫方式为单次腹腔注射。
免疫四周后，抽取外周静脉血，分离血清，使用上述ELISA法来确定血清阳转率。当100倍稀释的血清的ELISA读值高于截断值(即，3倍的阴性均值)时，其被确认为阳性。按照Reed-Muench法进行半数有效剂量(ED50)的计算。融合蛋白A-L-E2的血清阳转率的结果示于表2，HEV-239疫苗的血清阳转率的结果示于表3。
表2：A-L-E2在小鼠体内诱导HEV抗体阳转的ED50
表3：HEV-239疫苗在小鼠体内诱导HEV抗体阳转的ED50
结果显示，HEV-239的ED50是A-L-E2的ED50的11倍，这表明本发明的CRM197或其片段显著增强了与其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子内佐剂。同时，由于融合蛋白A-L-E2的免疫原性显著高于病毒样颗粒形式的HEV-239疫苗，因此，其可用于制备更有效的新型戊肝疫苗。
实施例6.包含CRM197或其片段以及流感病毒M2e蛋白的融合蛋白的设计与克隆
在本实施例中，示例性地构建了表达融合蛋白的载体。所构建的各种示例性融合蛋白的克隆设计参见图9，其各自包含CRM197或其片段以及流感病毒M2e蛋白，并且任选地使用接头。
融合蛋白的克隆
M2e融合于CRM197或其片段的C端
以实施例1获得的扩增产物(即，CRM197全长基因)为模板，以CRM197F1(SEQ IDNO：45)为正向引物(在其5'端引入限制性内切酶NdeI位点CAT ATG，ATG为大肠杆菌***中的起始密码子)，并且分别以CRM197-linker R1(SEQ ID NO：46)、389-linker R1(SEQ IDNO：47)、A-linker R1(SEQ ID NO：48)为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶BamHI位点GGA TCC)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。所使用的引物的序列列于表4。
扩增产物分别为1600bp、1200bp和600bp左右的大小特异的DNA片段。
另外，以质粒PHW2000(本室保存，含有M2全长基因)为模板，分别以M2eF1(SEQ IDNO：49)为正向引物(其5'端引入限制性内切酶BamHI位点GGA TCC),以M2eR(SEQ ID NO：50)为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶EcoRI位点GAA TTC)，在PCR热循环仪(BiometraT3)中按照如下条件进行PCR反应。所使用的引物的序列列于表4。
扩增产物为70bp左右的大小特异的DNA片段。
将以上得到的扩增产物分别与商售的pMD 18-T载体(TAKARA公司)连接，并分别命名为pMD 18-T-CRM197-L1、pMD 18-T-389-L1和pMD18-T-A-L1以及pMD 18-T-M2e。分别经NdeI/BamHI和BamHI/EcoRI酶切鉴定，得到pMD 18-T-CRM197-L1、pMD 18-T-389-L1、pMD18-T-A-L1、pMD 18-T-M2e的阳性克隆。
利用M13(+)引物确证，所获得的pMD 18-T-CRM197-L1、pMD 18-T-389-L1、pMD 18-T-A-L1、pMD 18-T-M2e中均***了正确的目的核苷酸序列。
将pMD 18-T-CRM197-L1、pMD 18-T-389-L1和pMD 18-T-A-L1质粒用NdeI/BamHI酶切。然后将所获得的酶切片段连接入经NdeI/BamHI酶切处理的pTO-T7原核表达载体(罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57)中，并转入大肠杆菌ER2566(购自Invitrogen公司)；提取质粒，经NdeI/BamHI酶切鉴定得到分别***了CRM197-L1、389-L1和A-L1片段的阳性质粒pTO-T7-CRM197-L1、pTO-T7-389-L1和pTO-T7-A-L1。
用BamHI/EcoRI酶切处理pTO-T7-CRM197-L1、pTO-T7-389-L1、pTO-T7-A-L1、pMD18-T-M2e。将获得的M2e片段分别连接到经BamHI/EcoRI酶切处理的pTO-T7-CRM197-L1、pTO-T7-389-L1和pTO-T7-A-L1载体上。经NdeI/EcoRI酶切鉴定得到分别***了CRM197-L-M2e(SEQ ID NO:33,34)、389-L-M2e(SEQ ID NO:35,36)、A-L-M2e(SEQ ID NO:37,38)的阳性表达载体pTO-T7-CRM197-L-M2e、pTO-T7-389-L-M2e、pTO-T7-A-L-M2e。
M2e融合于CRM197或其片段的N端
以质粒PHW2000(本室保存，含有M2全长基因)为模板，分别以M2eF2(SEQ ID NO：51)为正向引物(在其5'端引入限制性内切酶NdeI位点CAT ATG，ATG为大肠杆菌***中的起始密码子),以M2e-Linker R(SEQ ID NO：52)为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶BamHI位点GGA TCC)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。
扩增产物为100bp左右的大小特异的DNA片段。
另外，以实施例1获得的扩增产物(即，CRM197全长基因)为模板，以CRM197F2(SEQID NO：53)为正向引物(在其5'端引入限制性内切酶BamHI位点GGA TCC)，并且分别以CRM197R2(SEQ ID NO：54)、389R(SEQ ID NO：55)、A R(SEQ ID NO：56)为反向引物(在其5'端引入限制性内切酶EcoRI位点GAA TTC)，在PCR热循环仪(Biometra T3)中按照如下条件进行PCR反应。所使用的引物的序列列于表4。
扩增产物分别为1600bp、1200bp和600bp左右的大小特异的DNA片段。
将以上得到的扩增产物分别与商售的pMD 18-T载体(TAKARA公司生产)连接，并分别命名为pMD 18-T-M2e-L以及pMD 18-T-CRM197、pMD 18-T-389和pMD 18-T-A。分别经NdeI/BamHI和BamHI/EcoRI酶切鉴定，得到pMD 18-T-CRM197、pMD 18-T-389、pMD 18-T-A、pMD18-T-M2e-L的阳性克隆。
利用M13(+)引物确证，所获得的pMD 18-T-CRM197、pMD 18-T-389、pMD 18-T-A、pMD 18-T-M2e-L中均***了正确的目的核苷酸序列。
将pMD 18-T-M2e-L质粒用NdeI/BamHI酶切。然后将所获得的酶切片段连接入经NdeI/BamHI酶切处理的pTO-T7原核表达载体(罗文新等，生物工程学报，2000，16:53-57)中，并转入大肠杆菌ER2566(购自Invitrogen公司)；提取质粒，经NdeI/BamHI酶切鉴定得到***了M2e-L片段的阳性质粒pTO-T7-M2e-L。
用BamHI/EcoRI分别酶切处理pTO-T7-M2e-L、pMD 18-T-CRM197、pMD 18-T-389、pMD 18-T-A。将获得的CRM197、389、A片段分别连接到BamHI/EcoRI酶切处理后的pTO-T7-M2e-L载体上。经NdeI/EcoRI酶切鉴定得到，分别***了M2e-L-CRM197(SEQ ID NO:39,40)、M2e-L-389(SEQ ID NO:41,42)、M2e-L-A(SEQ ID NO:43,44)的阳性表达载体pTO-T7-M2e-L-CRM197、pTO-T7-M2e-L-389、pTO-T7-M2e-L-A。
本实施例中使用的引物的序列列于表4。
表4：引物序列
取1μL的pTO-T7-CRM197-L-M2e、pTO-T7-389-L-M2e、pTO-T7-A-L-M2e、pTO-T7-M2e-L-CRM197、pTO-T7-M2e-L-389和pTO-T7-M2e-L-A质粒(0.15mg/ml)分别转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自Invi trogen公司)，将其涂布于含卡那霉素(终浓度100mg/ml，下同)的固体LB培养基(成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管，在37℃180转/分钟下振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃保存。
实施例7.实施例6所构建的融合蛋白的表达、分离和复性
从-70℃超低温冰箱中取出5μL菌液，接种于5mL含卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃180rpm下振荡培养直至OD600达0.5左右，再转接到500mL含卡那霉素的LB培养基中，在37℃180rpm下振荡培养4-5小时。当OD600达1.5左右时，加入IPTG至终浓度0.4mM，在37℃下振荡诱导4个小时。
诱导后，以8000g离心5min收集菌体，然后按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2，300mM NaCl)的比例用裂解液重悬菌体，冰浴，用超声破碎仪(Sonics VCX750型超声破碎仪)处理菌体(处理条件：工作时间15min，脉冲2s，暂停4s，输出功率55％)。菌体裂解液以12000rpm，4℃离心5min(下同)，分别收集超声破碎后的上清和沉淀(即包涵体)；然后用等体积2％Triton-100洗涤沉淀，振荡30min，离心弃上清；再用Buffer I(20mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，5mM EDTA)重悬沉淀，振荡30min，离心弃上清；然后用2M尿素重悬沉淀，37℃振荡30min，离心得上清和沉淀；保留上清，并继续用等体积4M尿素重悬沉淀，37℃振荡30min，以12000rpm，4℃离心15min得上清和沉淀；保留上清(即，4M尿素溶解上清)，并继续用等体积8M尿素重悬沉淀，37℃振荡30min，离心并保留上清(即，8M尿素溶解上清)。
获得的各种级分通过SDS-PAGE进行分析(以考马斯亮蓝染色进行显现，下同，方法参照《分子克隆》第2版)。结果表明，融合蛋白均表达于包涵体中(见图10A和图10B)，并且CRM197-L-M2e、389-L-M2e、M2e-L-CRM197和M2e-L-389主要溶于8M尿素中，A-L-M2e和M2e-L-A主要溶于4M尿素中。将包含A-L-M2e或M2e-L-A的4M尿素溶解上清和包含CRM197-L-M2e、389-L-M2e、M2e-L-CRM197或M2e-L-389的8M尿素溶解上清分别透析到PBS中，得到纯度为80％左右的融合蛋白(见图10C-10F)。
实施例8.实施例6所构建的融合蛋白的性质分析
通过蛋白质印迹法测定融合蛋白的抗体反应性
通过蛋白质印迹法测定各融合蛋白与流感病毒M2e单抗5D1及CRM197单抗1E6(由本实验室自制)的反应性。经透析复性的样品经SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维膜上，用于进行杂交；用5％脱脂奶封闭膜2h，然后加入以1:500稀释的单抗5D1，反应1h；用TNT(50mmol/L Tris·Cl(pH 7.5)，150mmol/L NaCl，0.05％Tween 20)洗膜3次，每次10min；然后加入羊抗鼠碱性磷酸酶(KPL产品)，反应1h；用TNT洗膜3次，每次10min；然后用NBT和BCIP(PROTOS产品)显现。用各融合蛋白与流感病毒M2e单抗5D1(图11A-图11D)或CRM197单抗1E6(图11E-图11H)进行的蛋白质印迹法的检测结果示于图11中。结果显示，所有的融合蛋白与流感病毒M2e特异性单抗5D1及CRM197特异性单抗1E6均具有显著的反应性。
通过EILSA检测融合蛋白与多株M2e特异性抗体及CRM197特异性单抗的反应性
通过间接EILSA检测各融合蛋白和对照蛋白GST-M2e与多株M2e特异性抗体和CRM197特异性抗体1E6的反应性(本实验所使用的抗体均是现有技术已知的，或商购可得的或本实验室自制的)。例如，O19抗体是现有技术已知的流感保护性抗体(参见，Fu等，Virology,2009,385:218-226)。将经透析复性的样品稀释于1X PBS(1μg/ml)中，然后以100μl/孔加入96孔微孔板(北京万泰公司)中，并在37℃下温育2h；弃去包被液，用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗板一次，然后加入180μl/孔封闭液(2％明胶，5‰Casein，1‰Proclin300，于PBS中)，并在37℃下温育2h；检测时弃去封闭液，以100μl/孔加入按一定比例稀释(以0.002mg/ml的初始浓度进行2倍梯度系列稀释)的抗M2e抗体或CRM197抗体，并在37℃下温育1h；用PBST洗板五次，然后以100μl/孔加入HRP标记的羊抗鼠(KPL产品)(1：5000)，并在37℃下温育30min；用PBST洗板五次，然后以100μl/孔加入HRP底物(北京万泰公司生产)，并在37℃下温育15min；以50μl/孔加入2M硫酸终止反应，然后用酶标仪(Sunrise型号，Tecan公司产品)读取OD450/620值。各融合蛋白与各种抗体的ELISA检测结果示于图12A和图12B。结果显示，与单独的M2e蛋白相比，M2e蛋白在与CRM197或其片段融合后，与各种抗M2e特异性单抗的反应性保持不变或者显著提高。
各种融合蛋白的沉降速率分析
本实验中使用的仪器为美国Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测***及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法(c(s)算法，参见P.Schuck等人,Biophys J78:1606-1619(2000))分析制备的各种融合蛋白的沉降系数。分析结果示于图13A-图13F。结果显示，实施例6所构建的各种融合蛋白中：A-L-M2e和M2e-L-A主要以单体和四聚体的形式存在；389-L-M2e主要以二聚体和多聚体形式存在；M2e-L-389主要以单体和多聚体形式存在；CRM197-L-M2e主要以二聚体和多聚体形式存在；和，M2e-L-CRM197主要以单体和多聚体形式存在。
实施例9.实施例6所构建的融合蛋白的免疫原性分析
本实验中使用的小鼠为雌性，6周龄BALB/C小鼠。使用铝佐剂，将复性至PBS中的各种实施例6所构建的融合蛋白以及对照蛋白GST-M2e分别腹腔注射入小鼠中以进行免疫，注射体积为1ml，并且使用2个剂量组(5μg剂量组或者0.5μg剂量组)。在0周时进行初次免疫，在2周和4周时进行加强免疫。
用GST-M2e包板，通过与上述类似的间接ELISA法来检测各种融合蛋白以及对照蛋白诱导的血清抗体滴度。免疫后四个月内的血清抗体滴度的检测结果示于图14A和图14B。结果显示，在第2次加强免疫后，所构建的各种融合蛋白的免疫原性均显著高于单独的抗原蛋白(GST-M2e)，这表明本发明的CRM197或其片段(无论其是位于融合蛋白的N端，还是C端)显著增强了与其融合的抗原蛋白的免疫原性，可以用作分子内佐剂。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (30)
1.一种融合蛋白，其包含白喉毒素无毒突变体CRM197的片段以及目的蛋白，并且其中CRM197的片段增强了目的蛋白的免疫原性，其中，所述CRM197的片段由CRM197的第1-389位氨基酸残基组成，并且，直接或者通过接头与所述目的蛋白连接。
2.权利要求1的融合蛋白，其中，所述CRM197的片段由SEQ ID NO:2的第1-389位氨基酸残基组成。
3.权利要求1的融合蛋白，其中，所述目的蛋白是HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段。
4.权利要求3的融合蛋白，其中，所述HEV衣壳蛋白的免疫原性片段包含或者是HEV衣壳蛋白的第368-606位氨基酸残基，HEV衣壳蛋白的第394-606位氨基酸残基或HEV衣壳蛋白的第455-606位氨基酸残基。
5.权利要求1的融合蛋白，其中，所述目的蛋白是流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。
6.权利要求5的融合蛋白，其中，所述M2蛋白的免疫原性片段包含或者是M2蛋白的第1-24位氨基酸残基。
7.权利要求1的融合蛋白，其中，在所述融合蛋白中，所述CRM197的片段连接至所述目的蛋白的N端和/或C端，任选地使用接头进行连接。
8.权利要求7的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含所述CRM197的片段以及HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接。
9.权利要求8的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8，10，或16所示。
10.权利要求7的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包含所述CRM197的片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接。
11.权利要求10的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:36或42所示。
12.编码权利要求1-11任一项的融合蛋白的多核苷酸。
13.包含权利要求12的多核苷酸的构建体。
14.包含权利要求12的多核苷酸或权利要求13的构建体的载体。
15.权利要求14的载体，其中，所述载体是表达载体。
16.包含权利要求12的多核苷酸或权利要求13的构建体或权利要求14或15的载体的宿主细胞。
17.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求1-11任一项的融合蛋白，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。
18.权利要求1-11任一项的融合蛋白用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗能够被所述目的蛋白预防和/或治疗的疾病。
19.权利要求18的用途，其中，所述融合蛋白包含CRM197的片段以及HEV衣壳蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接，并且所述药物组合物用于预防和/或治疗HEV感染和与HEV感染相关的疾病。
20.权利要求19的用途，其中，所述与HEV感染相关的疾病为戊型肝炎。
21.权利要求18的用途，其中，所述融合蛋白包含CRM197的片段以及流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段，二者任选地使用接头进行连接，并且所述药物组合物用于预防和/或治疗流感病毒感染和与流感病毒感染相关的疾病。
22.权利要求21的用途，其中，所述与流感病毒感染相关的疾病为流感。
23.用于增强目的蛋白的免疫原性的方法，其包括获得包含白喉毒素无毒突变体CRM197的片段与所述目的蛋白的融合蛋白，从而增强目的蛋白的免疫原性，其中，所述CRM197的片段由CRM197的第1-389位氨基酸残基组成，并且，直接或者通过接头与所述目的蛋白连接。
24.权利要求23的方法，其中，所述CRM197的片段由SEQ ID NO:2的第1-389位氨基酸残基组成。
25.权利要求23的方法，其中，直接或者使用接头，将所述CRM197的片段与所述目的蛋白融合表达，从而获得融合蛋白。
26.权利要求23-25任一项的方法，其中，所述目的蛋白是HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。
27.白喉毒素无毒突变体CRM197的片段用于增强目的蛋白的免疫原性的用途，其特征在于获得包含所述CRM197的片段与所述目的蛋白的融合蛋白，其中，所述CRM197的片段由CRM197的第1-389位氨基酸残基组成，并且，直接或者通过接头与所述目的蛋白连接。
28.权利要求27的用途，其中，所述CRM197的片段由SEQ ID NO:2的第1-389位氨基酸残基组成。
29.权利要求27的用途，其中，直接或者使用接头，将所述CRM197的片段与所述目的蛋白融合表达，从而获得融合蛋白。
30.权利要求27-29任一项的用途，其中，所述目的蛋白是HEV衣壳蛋白、流感病毒M2蛋白或其免疫原性片段。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110145419 | 2011-06-01 | ||
| CN2011101454192 | 2011-06-01 | ||
| CN201210181392.7A CN102807621B (zh) | 2011-06-01 | 2012-06-01 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210181392.7A Division CN102807621B (zh) | 2011-06-01 | 2012-06-01 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105693865A CN105693865A (zh) | 2016-06-22 |
| CN105693865B true CN105693865B (zh) | 2020-07-17 |
Family
ID=47231505
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610052268.9A Expired - Fee Related CN105693865B (zh) | 2011-06-01 | 2012-06-01 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
| CN201210181392.7A Expired - Fee Related CN102807621B (zh) | 2011-06-01 | 2012-06-01 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210181392.7A Expired - Fee Related CN102807621B (zh) | 2011-06-01 | 2012-06-01 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9512185B2 (zh) |
| EP (1) | EP2716661B1 (zh) |
| JP (1) | JP6048845B2 (zh) |
| KR (2) | KR101839496B1 (zh) |
| CN (2) | CN105693865B (zh) |
| AU (1) | AU2012265320B2 (zh) |
| BR (1) | BR112013030963B1 (zh) |
| MX (1) | MX346245B (zh) |
| WO (1) | WO2012163289A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201400047B (zh) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105693865B (zh) | 2011-06-01 | 2020-07-17 | 厦门大学 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
| EP3608332B1 (en) * | 2013-03-15 | 2022-06-01 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Vaccine against human rhinovirus |
| CN104140972B (zh) * | 2013-05-07 | 2018-01-23 | 上海惠盾生物技术有限公司 | 白喉毒素突变体crm197的制备方法 |
| JP6549560B2 (ja) * | 2013-05-14 | 2019-07-24 | 上海 ハイチャーム インコーポレーテッドＳｈａｎｇｈａｉ Ｈｙｃｈａｒｍ Ｉｎｃ． | 低免疫原性タンパク質に対するエピトープワクチンおよびその製造方法と使用 |
| CN103540616B (zh) * | 2013-10-23 | 2015-08-12 | 中国人民解放军***福州总医院 | 表达白喉毒素a片段的慢病毒载体***及其制备与应用 |
| BR102015020632A2 (pt) * | 2015-08-26 | 2017-03-01 | Da Silva Bastos Cesar | sistema e processo de obtenção e gestão de volume e con-centração de sanitizante otimizado para a aplicação no procedimento de desinfeção de um módulo aplicador de substâncias in ovo tendo como paradigma a informação do tamanho médio dos ovos férteis vacinados e ou alimentados |
| FR3044312B1 (fr) * | 2015-11-30 | 2017-12-08 | Biomerieux Sa | Polypeptides mutes de hev et leur utilisation pour le dosage d'anticorps anti-hev |
| US11203626B2 (en) | 2016-03-10 | 2021-12-21 | The Johns Hopkins University | Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses |
| BR112018068055A2 (pt) | 2016-03-10 | 2019-01-08 | Univ Johns Hopkins | métodos para produção de proteínas de fusão de toxina da difteria monoméricas livre de agregados e usos terapêuticas |
| US11965009B2 (en) | 2016-03-10 | 2024-04-23 | The Johns Hopkins University | Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses |
| CN109963586B (zh) * | 2016-07-21 | 2023-11-03 | 维克芙奥私人有限公司 | 作为抗疟疾疫苗的生物融合蛋白 |
| CN106432512B (zh) * | 2016-09-30 | 2022-03-01 | 康希诺生物股份公司 | 一种增强多糖抗原免疫原性蛋白载体及其制备方法与应用 |
| CN106699895B (zh) * | 2016-12-05 | 2020-08-04 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 一种新型融合抗原和包含其的检测试剂盒及应用 |
| US11951165B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| CA3048981A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Sutrovax, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
| CN107488218B (zh) * | 2017-09-13 | 2021-06-01 | 华兰生物疫苗股份有限公司 | 一种多肽、免疫原性偶联物和流感疫苗 |
| CN107522777B (zh) * | 2017-09-13 | 2021-06-11 | 华兰生物疫苗股份有限公司 | 用于预防或治疗流感病毒的多肽、免疫原性偶联物及用途 |
| EP3574915A1 (en) * | 2018-05-29 | 2019-12-04 | Neovacs | Immunogenic product comprising il-4 and/or il-13 for treating disorders associated with aberrant il-4 and/or il 13 expression or activity |
| CN112543649A (zh) * | 2018-07-04 | 2021-03-23 | Vaxcyte公司 | 免疫原性缀合物的改进 |
| CN114835822B (zh) * | 2022-04-22 | 2022-11-04 | 浙江洪晟生物科技股份有限公司 | 猪瘟病毒的多聚体疫苗及其制备方法 |
| CN118027189A (zh) * | 2024-04-11 | 2024-05-14 | 上海惠盾因泰生物科技有限公司 | 一种抗白喉毒素突变体抗体及crm197的纯化制备方法和应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1934127A (zh) * | 2003-12-17 | 2007-03-21 | 艾兰制药公司 | Αβ免疫原性肽载体－偶联物及其生产方法 |
| CN101050238A (zh) * | 2007-04-02 | 2007-10-10 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 白喉毒素与gm－csf突变体的融合蛋白及其编码基因与应用 |
| CN100467488C (zh) * | 2003-12-30 | 2009-03-11 | 默克专利有限公司 | Il-7融合蛋白 |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2231770T3 (es) | 1993-03-05 | 2005-05-16 | Wyeth Holdings Corporation | Nuevos plasmidos para la produccion de proteina crm y toxina difterica. |
| WO1997013855A1 (en) | 1995-10-10 | 1997-04-17 | Novartis Ag | Melanoma-associated protein |
| TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| UA81216C2 (en) * | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
| ES2307553T3 (es) | 1999-12-02 | 2008-12-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Composiciones y procedimientos para estabilizar moleculas biologicas tras liofilizacion. |
| GB0112687D0 (en) | 2001-05-24 | 2001-07-18 | Microbiological Res Authority | Pharmaceutical use of secreted bacterial effector proteins |
| BRPI0214188B8 (pt) | 2001-11-08 | 2021-05-25 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | anticorpo ou fragmento do mesmo, molécula de ácido nucléico, uso do anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo, kit de diagnóstico, composição farmacêutica, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira transformada com o vetor de expressão recombinante e método para detectar o antígeno do vírus da hepatite e ou o anticorpo contra o vírus da hepatite e em uma amostra |
| EP1587826A2 (en) * | 2003-01-30 | 2005-10-26 | Wyeth Holdings Corporation | Cross-protective epitopes of moraxella catarrhalis and use thereof |
| CA2519511A1 (en) | 2003-03-17 | 2004-09-30 | Wyeth Holdings Corporation | Mutant cholera holotoxin as an adjuvant and an antigen carrier protein |
| GB0409750D0 (en) * | 2004-04-30 | 2004-06-09 | Chiron Srl | Integration of meningococcal conjugate vaccination |
| EP2272531A3 (en) | 2004-04-30 | 2011-04-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Integration of meningococcal conjugate vaccination |
| GB0500787D0 (en) | 2005-01-14 | 2005-02-23 | Chiron Srl | Integration of meningococcal conjugate vaccination |
| EP1645283A1 (en) | 2004-10-08 | 2006-04-12 | Chiron Behring GmbH & Co. KG | Combination vaccine |
| GB0428394D0 (en) * | 2004-12-24 | 2005-02-02 | Chiron Srl | Saccharide conjugate vaccines |
| CN100999548B (zh) * | 2006-01-10 | 2010-09-08 | 海南天源康泽医药科技有限公司 | 白喉毒素突变体crm197及其制备方法 |
| CN100558747C (zh) * | 2006-04-06 | 2009-11-11 | 海南天源康泽医药科技有限公司 | 以白喉毒素突变体crm197为载体的免疫原及其制备方法与应用 |
| US20090010966A1 (en) * | 2007-06-21 | 2009-01-08 | Angelica Therapeutics, Inc. | Modified diphtheria toxins |
| AU2008267208B2 (en) * | 2007-06-26 | 2012-01-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates |
| US8080244B2 (en) | 2008-11-21 | 2011-12-20 | Los Alamos National Security, Llc | Anti-influenza M2e antibody |
| SI2445522T1 (sl) * | 2009-06-22 | 2017-10-30 | Wyeth Llc | Imunogeni sestavki antigenov Staphylococcusa aureusa |
| GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| WO2011036560A2 (en) * | 2009-09-23 | 2011-03-31 | Novartis Ag | Glycoconjugate compositions and methods for treatment of hiv |
| CN105693865B (zh) | 2011-06-01 | 2020-07-17 | 厦门大学 | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 |
-
2012
- 2012-06-01 CN CN201610052268.9A patent/CN105693865B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-01 KR KR1020147000012A patent/KR101839496B1/ko active IP Right Grant
- 2012-06-01 KR KR1020167029198A patent/KR101895768B1/ko active IP Right Grant
- 2012-06-01 MX MX2013014109A patent/MX346245B/es active IP Right Grant
- 2012-06-01 US US14/123,305 patent/US9512185B2/en active Active
- 2012-06-01 EP EP12793630.0A patent/EP2716661B1/en not_active Not-in-force
- 2012-06-01 BR BR112013030963-6A patent/BR112013030963B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-06-01 WO PCT/CN2012/076378 patent/WO2012163289A1/zh active Application Filing
- 2012-06-01 JP JP2014513045A patent/JP6048845B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-01 CN CN201210181392.7A patent/CN102807621B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-01 AU AU2012265320A patent/AU2012265320B2/en not_active Ceased
-
2014
- 2014-01-06 ZA ZA2014/00047A patent/ZA201400047B/en unknown
-
2016
- 2016-08-26 US US15/248,850 patent/US9764028B2/en active Active
- 2016-08-26 US US15/248,779 patent/US9757450B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1934127A (zh) * | 2003-12-17 | 2007-03-21 | 艾兰制药公司 | Αβ免疫原性肽载体－偶联物及其生产方法 |
| CN100467488C (zh) * | 2003-12-30 | 2009-03-11 | 默克专利有限公司 | Il-7融合蛋白 |
| CN101050238A (zh) * | 2007-04-02 | 2007-10-10 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 白喉毒素与gm－csf突变体的融合蛋白及其编码基因与应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Amino-acid sequence of fragment A, an enzymically active fragment from diphtheria toxin;DeLange RJ 等;《Proc Natl Acad Sci U S A》;19760131;第73卷(第1期);第69-72页 * |
| Expression and immunogenicity of a recombinant diphtheria toxin fragment A in Streptococcus gordonii;Lee CW 等;《Appl Environ Microbiol》;20040831;第70卷(第8期);第4569-4574页 * |
| Mutational analysis of essential interactions involved in the assembly of hepatitis E virus capsid;Li SW 等;《J Biol Chem》;20041122;第280卷(第5期);第3400-3401页 * |
| Universal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs;De Filette M 等;《Virology》;20050620;第337卷(第1期);第154页 * |
| 白喉毒素无毒变异体CRM197的表达及作为结合疫苗蛋白载体的初步应用;王春娥 等;《中国生物制品学杂》;20080831;第2l卷(第8期);摘要，第687页左栏 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102807621A (zh) | 2012-12-05 |
| KR20160135331A (ko) | 2016-11-25 |
| EP2716661A1 (en) | 2014-04-09 |
| US9764028B2 (en) | 2017-09-19 |
| BR112013030963B1 (pt) | 2020-12-01 |
| US20170014506A1 (en) | 2017-01-19 |
| BR112013030963A2 (pt) | 2016-09-06 |
| US20140134199A1 (en) | 2014-05-15 |
| KR101895768B1 (ko) | 2018-09-07 |
| US20170015713A1 (en) | 2017-01-19 |
| CN105693865A (zh) | 2016-06-22 |
| EP2716661B1 (en) | 2018-03-07 |
| WO2012163289A1 (zh) | 2012-12-06 |
| KR20140068843A (ko) | 2014-06-09 |
| US9757450B2 (en) | 2017-09-12 |
| AU2012265320A1 (en) | 2014-01-16 |
| EP2716661A4 (en) | 2015-01-14 |
| JP6048845B2 (ja) | 2016-12-21 |
| MX2013014109A (es) | 2014-06-05 |
| KR101839496B1 (ko) | 2018-03-19 |
| MX346245B (es) | 2017-03-13 |
| ZA201400047B (en) | 2015-06-24 |
| CN102807621B (zh) | 2016-04-13 |
| US9512185B2 (en) | 2016-12-06 |
| JP2014518061A (ja) | 2014-07-28 |
| AU2012265320B2 (en) | 2016-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105693865B (zh) | 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白 | |
| CN105792842B (zh) | 埃巴病毒疫苗 | |
| CA2803058C (en) | Homodimeric protein constructs | |
| CN113173977B (zh) | 一种双功能抗原、其制备方法及应用 | |
| AU2020411873A1 (en) | Mutant RSV F protein and use thereof | |
| DK2910634T3 (en) | Vaccine for the prevention of edema in pigs | |
| KR20230084478A (ko) | 면역원성 코로나 바이러스 융합 단백질 및 관련 방법 | |
| EP4313138A1 (en) | Sars-cov-2 subunit vaccine | |
| WO2011153959A1 (zh) | 流感病毒m2或ha片段与蛋白载体的缀合物及其制药应用 | |
| AU2016313660A1 (en) | Polypeptide carrier for presenting target polypeptide and uses thereof | |
| WO2023179588A1 (zh) | 截短的水痘-带状疱疹病毒囊膜糖蛋白gE | |
| WO2023246853A1 (zh) | 抗新型冠状病毒人源化多价结合蛋白及其应用 | |
| CN110548135B (zh) | 磷酸化多肽抗原疫苗及其制备方法和应用 | |
| US20240100149A1 (en) | Sars-cov-2 constructs, vaccines, and methods | |
| KR20220082042A (ko) | 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 | |
| CN106337038B (zh) | 一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用 | |
| JPH02502637A (ja) | 合成抗むしばワクチン | |
| WO2023137521A1 (en) | Chimeric polypeptides | |
| WO2023137519A1 (en) | Chimeric polypeptides | |
| AU2022366884A1 (en) | Engineering antigen binding to, and orientation on, adjuvants for enhanced humoral responses and immunofocusing | |
| WO2023170068A1 (en) | Latency-associated nuclear antigen (lana) carrier protein | |
| CN113527441A (zh) | 腺病毒抗原多肽及其应用 | |
| Ogun et al. | The oligomerization domain of C4-binding protein acts as an adjuvant: a fusion protein of MSP119 with the murine C4bp domain protects mice against malaria. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20200717 |