CN105687252A - 丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用，属于医药领域。本发明通过如上应用指出，丁酸杆菌通过提高超高氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力，以及减少肝组织中的丙二醛含量来减轻急性肝损伤中的氧化应激反应，同时还可减少IL-1β、IL-6和TNF-α在肝组织中的积累，即丁酸杆菌具有抗氧化应激和抗炎症反应的作用，能够有效治疗肝损伤，恢复正常肝功能。此外，丁酸杆菌的主要代谢产物为丁酸，这也利于对肝脏的保护。

Description

丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用。

背景技术

急性肝损伤(acuteliverinjury，简称ALI)是指患者在无慢性肝病的基础上，由各种病因引起的肝脏功能的异常，其是急性肝功能衰竭的基础，严重或持续的肝损伤将最终导致肝功能衰竭，对患者造成极大的安全隐患。所以，提供一种治疗急性肝损伤的药物十分必要。

研究表明，引起肝急性损伤的病因主要有病毒感染、药物使用不当、乙醇摄入过多、食入有毒食物、放射性损伤、全身感染等，而上述这些病因均造成患者体内产生氧化应激和炎症，基于此，现有技术多专注于开发一些抗氧化和抗炎症的保肝药物，由于对这些保肝药物是否会给患者带来副作用的不明确性，将这些保肝药物用于临床仍需要很长的一段时间。可见，有必要开发一种安全可靠的急性肝损伤药物。

丁酸杆菌(Clostridiumbutyricum)，又称酪酸梭菌、酪酸梭状芽孢杆菌、酪酸杆菌、酪酸菌、丁酸梭状芽孢杆菌、丁酸梭菌、丁酸菌，是一种应用广泛的益生菌，其可在肠道内产生酶和维生素类有益物质，促进营养物质的消化吸收，常用于治疗腹泻、肠炎。但是，到目前为止，尚未发现有关丁酸杆菌治疗急性肝损伤的应用。如若将丁酸杆菌用于治疗急性肝损伤，其对于获取一种安全可靠的急性肝损伤药物具有重要的意义。

发明内容

本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供了一种丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用。具体技术方案如下：

本发明实施例提供了丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用。

具体地，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物包括治疗有效量的丁酸杆菌，且所述丁酸杆菌以活细胞的形式存在。

作为优选，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物中，所述丁酸杆菌的数目为3×10⁸CFU/g-6×10⁹CFU/g。

进一步地，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物还包括与所述丁酸杆菌相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

具体地，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物为药学上可接受的剂型。

具体地，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。

具体地，所述丁酸杆菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心所保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年1月22日，保藏为丁酸杆菌WZ001菌株，保藏编号为CGMCCNo.8808。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

本发明实施例提供了丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用，发明人研究发现，丁酸杆菌通过提高超高氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力，以及减少肝组织中的丙二醛含量来减轻急性肝损伤中的氧化应激反应，同时还可减少IL-1β、IL-6和TNF-α在肝组织中的积累，即丁酸杆菌具有抗氧化应激和抗炎症反应的作用，能够有效治疗肝损伤，恢复正常肝功能。此外，丁酸杆菌的主要代谢产物为丁酸，这也利于对肝脏的保护。可见，本发明实施例公开了丁酸杆菌可用于治疗急性肝损伤，对于预防或者治疗急性肝损伤具有重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的存活率示意图。

图2-1是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的ALT活性示意图；

图2-2是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的AST活性示意图；

图3是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的HE染色后肝脏组织的第一病理示意图；

图4本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的PAS染色后肝脏组织中第二病理示意图；

图5-1是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的SOD活性示意图；

图5-2是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的CAT活性示意图；

图5-3是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的MDA含量示意图；

图6-1是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的IL-1β含量示意图；

图6-2是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的IL-6含量示意图；

图6-3是本发明实施例1提供的正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中的TNF-α含量示意图。

其中，以上各图中的附图标记分别表示：

N正常组，

M模型组，

C丁酸杆菌预处理组。

具体实施方式

除非另有定义，本发明实施例所用的所有技术术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。其中，本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量，该“治疗有效量”根据实际情况是可以调整和变化的，并最终由医务人员确定，其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度等。

本发明实施例提供了丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用。

发明人研究发现，丁酸杆菌通过提高超高氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力，以及减少肝组织中的丙二醛含量来减轻急性肝损伤中的氧化应激反应，同时还可减少IL-1β、IL-6和TNF-α在肝组织中的积累，即丁酸杆菌具有抗氧化应激和抗炎症反应的作用，能够有效治疗肝损伤，恢复正常肝功能。此外，丁酸杆菌的主要代谢产物为丁酸，这也利于对肝脏的保护。可见，本发明实施例公开了丁酸杆菌可用于治疗急性肝损伤，对于预防或者治疗急性肝损伤具有重要的意义。

具体地，该治疗和/或预防急性肝损伤药物包括治疗有效量的丁酸杆菌，且丁酸杆菌以活细胞的形式存在。可以理解的是，丁酸杆菌作为该急性肝损伤药物中的活性成分，其以活细胞(即活生物)的形式存在时，能够发挥较佳的治疗急性肝损伤的作用。作为优选，该急性肝损伤药物中，丁酸杆菌的活细胞数目为3×10⁸CFU/g-6×10⁹CFU/g，举例来说，可以为5×10⁸CFU/g、9×10⁸CFU/g、1×10⁹CFU/g、3×10⁹CFU/g、6×10⁹CFU/g等，优选为5×10⁸CFU/g。

进一步地，该治疗和/或预防急性肝损伤药物还可包括与丁酸杆菌相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。举例来说，此处的“其他药类”指的是与丁酸杆菌相配伍，且不会使丁酸杆菌发生失活、活性降低、发生水解等理化反应，且器与丁酸杆菌协同作用后，能提高丁酸杆菌治疗急性肝损伤效果的药类。而上述的载体可以为本领域常用的药物载体，例如壳聚糖、脂质体、海藻酸、琼脂、纤维蛋白、胶原蛋白以及合成型高分子聚合载体等。上述的辅料为无生理活性，不影响药物制剂活性药物疗效、含量测定和稳定性，且主要目的是方便制剂的制备和临床应用的材料，举例来说，其可以为本领域常用的淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、轻质氧化镁、碳酸钙、干淀粉、羟甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、泡腾崩解剂、交联聚维酮等。

具体地，该治疗和/或预防急性肝损伤药物可为药学上可接受的剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液等。相应地，根据实际的药物剂型，该药物的给药方式可选自吸入、吹入口、鼻给药、经***化给药、胃肠外或直肠给药、局部椎管给药等。

其中，本发明实施例所述的丁酸杆菌优选为由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心所保藏，保藏为丁酸杆菌WZ001菌株，保藏编号为CGMCCNo.8808的丁酸杆菌。利用该丁酸杆菌WZ001菌株，可有效恢复恢复肝功能，降低患者由急性肝损伤导致的死亡率。

进一步可以理解的是，本发明实施例所述的急性肝损伤的受体不仅仅是针对人类，还可针对动物，例如大鼠等。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图，以具体实施例的方式，对本发明实施方式作进一步地详细描述。在以下具体实施例中，所涉及的操作未注明条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用原料未注明生产厂商及规格者均为可以通过市购获得的常规产品。

由四氯化碳(CCl₄)导致的肝脏损伤是检验肝脏保护药剂的经典模型。CCl₄经内质网多功能细胞色素P450加氧酶系生物转化后产生的三氯甲基自由基和活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)能引起肝脏损伤。这些自由基和活性氧簇能通过细胞氧化应激反应启动脂质和蛋白质过氧化反应，最终导致肝脏细胞损伤，加剧炎症反应。利用CCl₄所建立的模型的优点是，CCl₄能在几小时内形成肝炎，并随后产生坏死和脂肪肝等症状，与人体急性肝损伤的发病模式非常相似。

基于上述，本发明通过以下具体实施例验证了丁酸杆菌对于急性肝损伤的防护与治疗作用，所采用的急性肝损伤模型由CCl₄在小鼠中进行复制而得到。通过检测病理变化、氧化应激和炎症来评价及确定丁酸杆菌对急性肝损伤的治疗作用。

以下实施例中，所采用的试剂和药物如下所示：

丁酸杆菌母株，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心所保藏，保藏为丁酸杆菌WZ001菌株，保藏编号为CGMCCNo.8808；

TPY液体培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；

用于测定过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的试剂盒及PAS染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；

BCA蛋白定量试剂盒，丙二醛(MDA)测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所)；

用于测定IL-1β、IL-6、TNF-α的ELISA试剂盒均购自上海西唐生物技术有限公司。

所采用的实验动物为：雄性ICR小鼠，体重(25-30)g，购自温州医科大学实验动物中心。小鼠根据国际动物保护和利用协会标准进行饲养，动物协议得到温州医科大学实验动物伦理协会批准(NO.wydw2012-0107)。

实施例1

丁酸杆菌培养

将丁酸杆菌母株在TPY液体培养基中进行厌氧培养，并将处于对数增长期内的丁酸杆菌对丁酸杆菌预处理组的小鼠进行灌胃处理。

ALI造模及动物分组

本实施例对小鼠腹腔注射CCl₄进行造模(其中，将CCl₄溶于植物油中进行注射，注射剂量0.1ml/kg小鼠)，16小时后收集小鼠的血清和肝脏用于后续指标检测。

具体地，将30只小鼠随机分成3组：正常组、模型组和丁酸杆菌预处理组。其中，丁酸杆菌预处理组的小鼠在采用CCl₄造模前5天，每天以5×10⁸CFU丁酸杆菌/每个小鼠的剂量，对小鼠进行丁酸杆菌灌胃，然后采用CCl₄造模；

模型组的小鼠在采用CCl₄造模前5天，以无菌的TPY液体培养基进行灌胃，然后采用CCl₄造模；

正常组的小鼠仅采用无菌的TPY液体培养基进行灌胃，并不作任何CCl₄造模处理，其目的用作对比参照。

存活率分析

为了评价丁酸杆菌在各ALI模型中的保护作用，对68只小鼠(10只正常组、28只模型组、30只丁酸杆菌预处理组)的腹腔注射了3ml/kg致死剂量的CCl₄。

以上各组小鼠的存活率数据请参见图1，由图1可知，ALI模型的生存率在被丁酸杆菌预处理后的9h到36h显著增加。在四氯化碳处理起效的第6h之前，丁酸杆菌预处理组和模型组死亡率都很低，无明显差异。然而，在第9h后，组间的存活率差异变得显著，一直持续到第36小时(17/30比5/28)。结果表明，通过对小鼠进行丁酸杆菌预处理，相比模型组，丁酸杆菌预处理组的小鼠的存活率(p<0.01)明显提高，可见，丁酸杆菌降低了给予小鼠四氯化碳致死剂量后的死亡率，其对于改善、预防及治疗急性肝损伤具有积极的作用。

血清转氨酶活性测定

由于ALT和AST是反映肝细胞损害的重要因素，因此本实施例用试剂盒测定ALT、AST在血清中的活性。使用722N分光光度计(上海科学仪器有限公司)在510nm处测定各组小鼠肝脏组织中以上各种酶的吸光度。根据厂商提供的单位进行计算，酶活性的单位为IU/L。

实验结果如图2-1和图2-2所示(数据被表示为平均值±SD(n＝10).**:P＜0.01)。结果表明，当各组小鼠经CCl₄处理后，模型组中ALT和AST在血清中的活力显著提高(p<0.01)。相反，经过丁酸杆菌预处理后，丁酸杆菌小鼠中由CCl₄造成的血清中ALT和AST的活力变化则明显降低(p<0.01)。可见，丁酸杆菌能够有效减轻CCl₄诱导的小鼠肝脏细胞损伤。

肝脏组织的病理变化检测

将各组小鼠的肝脏标本在4％(质量体积浓度，g/100ml)多聚甲醛溶液中浸泡，并进行石蜡包埋，将5μm厚处的肝脏组织进行HE染色，在X400和X100倍的显微镜下观察肝脏组织的病理变化。

结果如图3所示，可见，从正常组小鼠的肝脏组织中可以观察到正常的肝小叶结构和肝细胞结构。但是在经过四氯化碳处理后的模型组的小鼠中，其肝脏组织明显被损害，显微镜下观察到严重的肝细胞坏死和炎性细胞浸润，特别是在围绕在中央静脉的区域内。然而，丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织的病变则明显减弱，其与模型组相比，肝脏细胞的坏死面积，结构损伤以及炎细胞浸润都有了明显的减轻。

肝脏糖原的检测

由于糖原颗粒含量是一个反映肝细胞损害的经典参数，因此本实施例对小鼠肝脏组织进行了PAS染色来检测其中糖原颗粒含量的变化。将各组小鼠的肝脏标本在4％(质量体积浓度，g/100ml)多聚甲醛溶液中浸泡，并进行石蜡包埋，将5μm厚处的肝脏组织进行PAS染色，在X400和X100倍的显微镜下观察肝脏组织的糖原变化。

如图4所示，正常组小鼠的肝脏组织内存在的丰富糖原颗粒，而在经过四氯化碳处理后的模型组的小鼠中，其肝脏组织中存在的糖原颗粒显著减少，而丁酸杆菌预处理组中小鼠的肝脏组织中糖原颗粒的含量则相比模型组有明显增加。可见，丁酸杆菌能有效减轻由四氯化碳诱导的小鼠肝脏病理损害。

氧化应激反应在急性肝损伤中是很重要的因素，本实施例通过测定各组小鼠肝脏组织中SOD和CAT的活力以及MDA的含量来反应氧化应激反应的程度和评价丁酸杆菌的作用。该过程中实验数据被表示为平均值±SD(n＝10).**:P＜0.01。

SOD活性检测

具体地，采用黄嘌呤氧化酶法测定各组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。使用722N分光光度计(上海科学仪器有限公司)在550nm处测定该SOD酶的吸光度，按照SOD的测定试剂盒说明书操作，SOD的酶活性单位为U/mgprot。

CAT活性检测

根据钼酸铵比色法测定各组小鼠肝脏组织中CAT活性，使用722N分光光度计(上海科学仪器有限公司)在405nm处测定该CAT酶吸光度，按CAT的测定试剂盒说明书操作。CAT的酶活性单位为U/mgprot。

MDA含量测定

采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定各组小鼠肝脏组织中MDA含量，使用ELx800酶标仪(BioTekInstruments,Inc.,USA)在波长532nm处测定MDA的吸光度。根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，单位为nmol/mgprot。

结果如图5-1、图5-2及图5-3所示，经四氯化碳处理后的模型组中各小鼠肝脏组织中SOD和CAT的活力相比正常组明显降低，并且其肝脏组织中的MDA含量明显提高。而丁酸杆菌预处理组中小鼠肝脏组织中SOD和CAT活力则相比模型组明显提高，并且其中MDA的含量相比模型组明显降低(p<0.01)。可见，丁酸杆菌能够有效减轻小鼠肝组织中由四氯化碳诱导的急性肝损伤时的氧化应激反应。

IL-1β、IL-6及TNF-α的测定

炎症反应在急性肝损伤中扮演了很重的角色，基于此本实施例采用ELISA试剂盒测定各组小鼠肝脏组织中IL-1β、IL-6及TNF-α含量，按试剂盒说明书操作。每100μl匀浆由相应的初级抗体包被于96孔板上，孵化3小时。由PBST溶液(磷酸缓冲液(PhosphateBufferSolution)+Tween-20)冲洗2次后，加入100μl生物共轭剂，室温下孵化45min。冲洗出去非特异性结合，加入100μl酶联亲和素后孵化45min。PBST溶液冲洗后，每孔加入100μl发光液。20min后加入反应终止剂。使用ELx800酶标仪(BioTekInstruments,Inc.,USA)在波长450nm处测定IL-1β、IL-6及TNF-α的吸光度。根据标准曲线计算IL-1β、IL-6及TNF-α含量。

结果如图6-1、图6-2及图6-3所示，相比正常组，四氯化碳处理后的模型组中，小鼠肝脏组织中IL-1β，IL-6和TNF-α的含量达到了极高的水平，而相比模型组，丁酸杆菌预处理组的小鼠肝脏中，IL-1β，IL-6和TNF-α的含量则显著降低(p<0.01)。这表明丁酸杆菌能有效减轻小鼠肝组织中由四氯化碳诱导的急性肝损伤时的过激的炎症反应。

其中，以上实验数据用平均数±标准差表示，采用Bonferroni法测定数据差异性，log-rank法分析存活实验数据，并用Kaplan-Meier生存曲线表示。p<0.05表示存在差异。

综上可知，在由四氯化碳引起小鼠的急性肝损伤实验中，对小鼠进行丁酸杆菌预处理能明显减弱其肝脏产生氧化应激，炎症反应和损伤几率，这表明了丁酸杆菌对急性肝损伤具有保护作用，并且支持了其进一步在临床应用的可能性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.丁酸杆菌在制备治疗和/或预防急性肝损伤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物包括治疗有效量的丁酸杆菌，且所述丁酸杆菌以活细胞的形式存在。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物中，所述丁酸杆菌的数目为3×10⁸CFU/g-6×10⁹CFU/g。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物还包括与所述丁酸杆菌相配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述治疗和/或预防急性肝损伤药物为药学上可接受的剂型。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。

7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述丁酸杆菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心所保藏，保藏为丁酸杆菌WZ001菌株，保藏编号为CGMCCNo.8808。