CN105685477A - 一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的方法，包括以下主要步骤：将中草药粉碎后过60目筛备用；粉碎后的中草药加入到发酵罐中，并添加营养物和水作为培养基；发酵罐中培养基灭菌冷却后接入能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（<i>Bacillus subtilis</i>）HL-1进行液态好氧发酵；发酵结束后发酵液经过滤去除沉淀得到上清液，上清液再进行真空浓缩后得到浓缩液，浓缩液然后与吸附剂进行吸附，吸附体系经干燥和粉碎后即可制备成饲用抗生素替代物成品。本发明方法制备的饲用抗生素替代物富含枯草菌素和中草药有效成分，它有良好的促生长与抗病性能，在饲料行业中能完全替代饲用抗生素，有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的方法，属于饲料添加剂制备的技术领域。
背景技术
目前中国每年生产的大约21万吨抗生素原料中有9.7万吨用于畜牧养殖业，占年总产量46.1%。过量的使用抗生素不仅导致了养殖动物对抗生素药物的耐药性，使养殖动物的抗病能力下降，而且这些抗生素会随食物链进入人体，使人体在无意中产生耐药细菌，一旦生病就会增加治疗难度和费用，甚至有可能会产生“超级细菌”，出现无药可治的情况。随着人们生活质量的不断提高，对各类食品包括肉食品的卫生安全有了更高的要求，对“放心肉”、“绿色食品”的呼声也日渐强烈。因此，寻找抗生素的绿色替代品是我国饲料和养殖行业发展中亟待解决的问题。
中草药是中国医学宝库中的瑰宝，且中草药作为饲料添加剂，在我国古代已经开始。中草药具有无毒副作用、不易引发细菌抗药性、无残留等特性，作为一种饲用抗生素的绿色替代品在饲料工业得到了广泛的认可。从20世纪80年代起,中草药已被用于作饲用抗生素替代品,且取得了一定的应用效果。中草药经过微生物发酵后，其有效成分被充分释放，使其更具生物活性和疗效近年来更是研究热点。中国饲料〔2010，419（15）：13-17〕文献公开了从不同中草药原料中分离得到的米曲霉对中草药进行发酵，发酵料蒸煮液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑菌活性分别较对照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%。但以上对中草药的发酵只是局限在充分让中草药有效成分释放出来，从而提高抑菌活性，然而中草药有效成分的抗菌活性并没有提升。目前发酵中草药存在最大的问题是使用剂量偏大。这不仅增加了产品的使用成本，而且还影响饲料营养配比和适口性，从而使得发酵中草药仍没有在饲料工业得到广泛的应用。因此，急需大幅度提高发酵中草药中有效成分的抗菌活性，减少发酵中草药在饲料工业的使用剂量，以促进发酵中草药在饲料工业的广泛应用。
细菌素是一类由微生物产生的具有抗菌作用的蛋白或多肽，能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌。由于细菌素具有不污染环境、不会使致病菌产生耐药性、增强宿主免疫力等优点，被公认为是一种天然抑菌剂。但目前，由于高昂的生产成本使得细菌素的应用主要在食品领域，而在饲料行业的应用很少。细菌素在食品上的直接使用，也说明了细菌素对动物和人类是安全的。因此急需提细菌素的抗菌活性与降低其生产成本，以促进细菌素在饲料工业的应用。
1988年乳酸链球菌素首次作为食品添加剂得到FDA的认可，已有超过100个国家和地区在使用乳酸链球菌素作为食品防腐剂，从而促进了其他种类细菌素及在其他领域的研究。但目前细菌素的研究多集中于乳酸菌细菌素方面，而国际上对枯草芽孢杆菌产生的枯草菌素的研究则很少，国内更是少见。工业微生物（2008，38（4）：14～18）公开了一种枯草芽孢杆菌FB123产枯草菌素的液体发酵条件，但是对于提高枯草菌素的抗菌活性还没有研究报道。
申请人于2015年3月2日提出的发明申请201510092623.0“一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法”。该发明申请公开了以浓缩的水产品加工废水和中草药为原料，通过产枯草菌素枯草芽孢杆菌固态发酵制备一种富含中草药有效成分、枯草菌素和小肽的饲料添加剂。在该发明申请中，为了使得制备的饲料添加剂富含小肽，加入了过多的浓缩水产品加工废水，发酵培养基中碳氮比严重失衡，这既不利于枯草芽孢杆菌产生枯草菌素，也不利于枯草芽孢杆菌产非淀粉多糖酶来降解中草药细胞壁，从而大大降低了制备的饲料添加剂的抗菌活性。
发明内容
针对现有技术存在的问题，以及申请人提出的发明申请201510092623.0“一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法”所存在的不足，以申请人于2015年3月2日提出的发明申请201510092623.0为优先权，本发明提供了一种产枯草菌素枯草芽孢杆菌发酵中草药制备饲用抗生素替代物的方法。本发明的主要目的是不但要降低枯草菌素与中草药发酵的生产成本，而且还要提高中草药有效成分与枯草菌素的抗菌活性，从而降低枯草菌素与中草药在饲料工业的使用剂量，以促进枯草菌素与中草药在饲料工业的广泛的应用。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液备用；
（2）将中草药粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）粉碎后中草药加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
（4）将步骤（3）获得的发酵罐中的培养基于121℃灭菌20min；
（5）将灭菌后的发酵罐中的培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液；
（6）发酵过程的控制：发酵温度为28℃～30℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～450rpm，发酵时间为35～45h；
（7）成品处理：发酵结束后，发酵液经过滤去掉沉淀，收集上清液；上清液经真空浓缩至原体积的1/3～1/5；然后将浓缩液与吸附剂按质量比为1～3：1的比例进行混合吸附，吸附体系经干燥和粉碎后即可制备成饲用抗生素替代物成品。
所述步骤（1）中接入的枯草芽胞杆菌（Bacillussubtilis）HL-1能产生枯草菌素，该菌已于2015年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo．10379，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述步骤（2）中的中草药为甘草、连翘、车前草、苏子、五味子、马鞭草中的一种或其中两种以上的混合物。
所述步骤（3）中的中草药的加入量以添加的中草药的质量占水总质量百分比计，为5%～20%。所述步骤（3）中的营养物为由葡萄糖、蛋白胨、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占水总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，蛋白胨0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～8%。
所述步骤（7）中所用的吸附剂为玉米芯、稻壳粉、玉米粉、贝壳粉和沸石粉中的一种。
本发明与现有的技术相比，有如下优点。
（1）降低了饲用抗生素的绿色替代品的生产成本。本发明用产枯草菌素的枯草芽孢杆菌来进行液态发酵的方法，不但可发酵产生枯草菌素，而且还使得中草药的有效成分释放出来。本发明将枯草菌素的发酵与中草药的发酵合二为一，二者可分摊相关的生产成本，从而在总体上降低了饲用抗生素的绿色替代品的生产成本。
（2）提高了枯草菌素与中草药有效成分的抗菌活性，从而显著降低了枯草菌素与中草药有效成分的使用剂量。本发明从成千上万的中草药库上筛选出了其有效成分与枯草菌素具有协同抑菌效应的中草药。本发明不但将枯草菌素的发酵生成与中草药发酵合二为一，而且由于枯草菌素与中草药有效成分的相互作用，二者的抗菌活性都显著增强。这也是目前单一的中草药发酵与枯草菌素发酵生产所不具备的。正是由于本发明提高了所制备的枯草菌素与中草药有效成分的抗菌活性，从而使得本发明所制备的饲用抗生素替代物的使用剂量大大减少，其中所含的枯草菌素与中草药有效成分的实际使用剂量比单独使用时减少了几倍到几十倍。
与申请人2015年3月2日提出的发明申请201510092623.0“一种利用水产品加工废水和中草药制备饲用抗生素替代物的方法”相比，本发明申请中发酵原料中碳氮比为发酵生产的正常范围，这更有利于枯草菌素的发酵生产和中草药的发酵，因而本发明申请提供的技术方案所制备的饲料添加剂抗菌活性显著增强。另外，本发明申请采用液态发酵的方法，更容易大规模的生产。
本发明提供了一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法。本发明不但降低了饲用抗生素绿色替代品的生产成本；而且还大大降低了枯草菌素与中草药有效成分在饲料工业的使用剂量。本发明得到的富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物在华南地区的猪、鸡、对虾的养殖试验表明，用本发明方法制备的饲用抗生素替代物可完全替代饲用抗生素，明显降低养殖成本，取得显著的经济效益和社会效益。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就中草药的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液备用；将甘草粉碎后过60目筛备用。将10公斤粉碎的甘草、400克葡萄糖、600克蛋白胨、500克氯化亚铁、950克磷酸氢二钾和100公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；发酵罐中培养基于121℃灭菌20min后备用；向灭菌冷却的发酵罐中接入4公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液；发酵温度为30℃，无菌空气通入量为2.0vvm，发酵罐的转速为400rpm，发酵时间为38h；发酵结束后，发酵液经过滤去掉沉淀，收集上清液；上清液经蒸发浓缩至原体积的1/3；浓缩液被玉米芯按质量比为1.5：1的比例吸附；吸附体系经干燥和粉碎后即可制备成一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物成品。
实施例2：将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液备用；将甘草和五味子粉碎后过60目筛备用。将10公斤复合中草药（7.5公斤甘草+2.5公斤五味子）、400克葡萄糖、680克蛋白胨、550克氯化亚铁、900克磷酸氢二钾和100公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；发酵罐中培养基于121℃灭菌20min后备用；向灭菌冷却的发酵罐中接入4公斤枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液；发酵温度为28℃，无菌空气通入量为2.0vvm，发酵罐的转速为400rpm，发酵时间为42h；发酵结束后，发酵液经过滤去掉沉淀，收集上清液；上清液经蒸发浓缩至原体积的1/4；浓缩液被贝壳粉按质量比为1.5：1的比例吸附；吸附体系经干燥和粉碎后即可制备成一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物成品。
Claims (8)
1.一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产枯草菌素的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养16h，制备成枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液备用；
（2）将中草药粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）粉碎后中草药加入到发酵罐中，并向发酵罐中加入水和营养物，混匀后得到发酵培养基；
（4）将步骤（3）获得的发酵罐中的培养基于121℃灭菌20min；
（5）将灭菌后的发酵罐中的培养基冷却至室温，然后接入步骤（1）所制备的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液；
（6）发酵过程的控制：发酵温度为28℃～30℃，无菌空气通入量为0.5vvm～2.5vvm，发酵罐的转速为150rpm～450rpm，发酵时间为35～45h；
（7）成品处理：发酵结束后，发酵液经过滤去掉沉淀，收集上清液；上清液经真空浓缩至原体积的1/3～1/5；然后将浓缩液与吸附剂按质量比为1～3：1的比例进行混合吸附，吸附体系经干燥和粉碎后即可制备成饲用抗生素替代物成品。
2.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo．10379。
3.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的中草药为甘草、连翘、车前草、苏子、五味子、马鞭草中的一种或其中两种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的中草药的加入量以添加的中草药的质量占水总质量百分比计，为5%～20%。
5.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物为由葡萄糖、蛋白胨、氯化亚铁和磷酸氢二钾所组成的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占水总质量百分比计，分别为：葡萄糖0.01%～5%，蛋白胨0.01%～5%，氯化亚铁0.01%～5%，磷酸氢二钾0.01%～5%。
7.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）HL-1种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为0.1%～8%。
8.根据权利要求1所述的一种富含枯草菌素和中草药有效成分的饲用抗生素替代物的制备方法，其特征在于：所述步骤（7）中所用的吸附剂为玉米芯、稻壳粉、玉米粉、贝壳粉和沸石粉中的一种。
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