CN104161172A - 一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物饲料和生物工程的技术领域，具体涉及一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法。以花生粕为原料，与水混合并搅拌均匀后灭菌，灭菌后按花生粕重量接入2%（v/w）黑曲霉（CGMCC9183）孢子液，在28℃~32℃下培养24~28h，每4h翻料一次；培养完毕后按花生粕重量接入10%（v/w）戊糖片球菌（CGMCC9182），混合均匀，37℃~46℃厌氧发酵36~42h，发酵结束后60℃干燥、粉碎，制得益生肽。益生肽的多肽含量达到25%以上，乳酸含量达到8.0%以上，乳酸菌活菌数达10⁹CFU/g以上，酸性蛋白酶达到200U/g以上。本发明生产成本低、发酵过程易于控制，产品质量稳定。

Description

一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法

技术领域

本发明属于动物饲料和生物工程的技术领域，具体涉及一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法。 

背景技术

花生粕是花生仁经压榨提炼油料后的副产品，含丰富的植物蛋白。花生粕的营养价值较高，其代谢能是粕类中最高的，粗蛋白质含量达48%以上，是我国重要的植物来源蛋白饲料，我国每年花生粕资源约在300多万吨左右。然而，由于花生粕的蛋白品质和其他植物蛋白一样，都以大分子结构存在，且存在抗营养因子，阻碍蛋白的消化、吸收，蛋白的利用率相对偏低。 

然而，目前对花生粕的开发利用还相对较少，要获得高含量（绝对量高于25%）的多肽都是通过液体酶解的方法进行，产品得率较低，干燥成本过高，且由于产品应用面较窄，替代原料丰富，难以实现在花生粕上的规模化生产。最近，固态发酵由于含水量少，基本不产生废弃物，环境污染少，容易处理等优点，被研究人员应用与花生粕的高值化中。目前，采用芽孢杆菌和乳酸菌共同发酵产生发酵花生粕，作为饲料原料得到了较大的关注。然而，由于芽孢杆菌产生中性蛋白酶，在乳酸菌共同发酵下，发酵体系快速变为酸性，芽孢杆菌及中性蛋白酶难以发挥作用，且芽孢杆菌和乳酸菌分别为好氧微生物和厌氧微生物，两者对氧的需求不一致，微生物生长有限（产品乳酸菌10⁸CFU/g），也导致产品的有益代谢产物含量有限，如多肽含量在8%左右，乳酸含量3%左右。 

为解决花生粕饲用品质的缺陷，结合目前饲料领域常用的多肽产品、益生菌、益生素和酶制剂，通过生物技术处理过程，将这些有益添加剂的功能集于一身，制备了益生肽。首先，发酵过程可以看作营养物质在体外的预消化过程，花生粕中抗营养因子被分解去除，大分子蛋白质被分解成多肽和部分小肽，肽的吸收具有转运速度快、耗能低、载体不易饱和等优点且各种肽之间转运无竞争性与抑制性，动物组织还可以直接利用肽中的氨基酸合成组织蛋白，减少能量消耗；其次，幼龄动物胃肠道生理及微生物区系发育还未健全，胃分泌盐酸能力较差，盐酸缺乏后造成胃中pH值升高而抑制胃蛋白酶活性而且随着在饲料中的添加，使得营养物质的消化率较低，发酵过程积累的外源消化酶和有益代谢物的大量补充，有助于改善肠道微生物区系平衡，增强动物机体免疫力，显著提高营养物质在动物体内的消化利用效率。同时，由于食品安全越来越受到关注，欧盟已在2006年全面禁止在饲料中添加抗生素，寻找抗生素替代品的工作也已取得一定的进展。研究发现，在饲料中添加益生菌（乳酸菌）或其代谢产物乳酸能有效改善动物肠胃的微生物环境，有效防止消化道疾病，激发机体免疫功能，提高机体抗病、抗应激能力，提高饲料的利用率和动物生产性能。 

因此，在目前动物营养理论体系的基础上，针对目前存在技术的不足，通过好氧微生物和厌氧微生物两步发酵，实现花生粕蛋白的体外降解，积累有益的代谢产物多肽和消化酶，同时富集大量的益生菌，制备益生肽，对提高饲料的利用率和动物生产性能，缓解抗生素滥用具有重要的作用，对饲料工业和养殖业的健康持续发展具有变革性的意义。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用花生粕二步固态发酵生产益生肽，益生肽的多肽含量达到25%以上，乳酸含量达到8.0%以上，乳酸菌活菌数达到10⁹ CFU/g以上，酸性蛋白酶达到200U/g以上。二步固态发酵分别为好氧发酵和厌氧发酵，所采用微生物符合《饲料添加剂品种目录（2013）》，分别为高产酸性蛋白酶的黑曲霉（CGMCC No.9183）和耐高温、快速高产乳酸的戊糖片球菌（CGMCC No.9182）。 

戊糖片球菌，圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，球菌。利用葡萄糖、木糖、***糖，半乳糖，甘露糖，氨基葡萄糖和纤维二糖等多种糖产酸，耐酸、耐胆盐，具有很好的肠道定植能力。 

黑曲霉 ，黑褐色，顶囊大，球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、黑褐色，平滑或粗糙。菌丝发达多分枝，有隔多核的多细胞真菌。产酸性蛋白酶、植酸酶、纤维素酶和木聚糖酶等。 

戊糖片球菌的培养步骤为： 

戊糖片球菌经活化斜面接入MRS培养基37℃培养36h，而后以5%接种量进行逐级扩培12h，直至足够的固态发酵用量。

MRS培养基（g·L-1）：葡萄糖20，牛肉膏10，胰蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，MgSO₄ 0.1，MnSO₄·H₂O 0.05，吐温-80 1，pH自然，121 ℃灭菌20 min。 

黑曲霉的培养步骤为： 

黑曲霉经活化斜面后，划线马铃薯培养基平板30℃培养5d，用无菌水冲洗平板，制成孢子悬浮液。

马铃薯培养基：马铃薯 20g，蔗糖 2g，自来水 100mL，琼脂 2g ，pH 自然（约6.0） 121℃灭20min。 

马铃薯处理方法： 马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液加糖，补足水至100ml，装入三角瓶。 

本发明的技术方案为： 

一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，步骤如下：

以花生粕为原料，按料水重量比1:0.8-1:1.1与自来水混合均匀后115-121℃灭菌10-20min，灭菌后按花生粕重量的2%（v/w）接入黑曲霉孢子液，混合均匀后在28℃~32℃下培养24~28h，每4h翻料一次；培养完毕后将3批次混合，按花生粕重量接入10%（v/w）戊糖片球菌，混合均匀后在37℃~46℃下厌氧发酵36~42h，发酵结束后60℃干燥、粉碎，制得益生肽；所述的黑曲霉（Aspergillus niger）保藏至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间2014年5月20日，其保藏编号为CGMCC No.9183；戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）保藏至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏时间2014年5月20日，其的保藏编号为CGMCC No.9182。

本发明的有益效果为： 

本发明通过筛选效果优异的菌群，并通过优化制备工艺和各个参数，提供了一种新的生产益生肽的方法，具体为利用花生粕二步固态发酵生产益生肽，得到的益生肽的多肽含量达到25%以上，乳酸含量达到8.0%以上，乳酸菌活菌数达到10⁹ CFU/g以上，酸性蛋白酶达到200U/g以上。该产品实现花生粕中大分子蛋白的体外预消化，并积累有益的代谢产物乳酸、易消化吸收的多肽和酸性蛋白酶，富集有益的乳酸菌。

本发明得到的益生肽产品，在饲料配方中添加5%左右，可提高动物的消化吸收能力，调节动物消化道微生态平衡，抑制大肠杆菌、沙门氏菌等致病微生物生长，增强动物的防病抗病能力。 

总之，本发明的制备方法易于控制，得到的益生肽产品质量稳定， 性能好，该方法具备突出的实质性特点和显著地进步。 

对比效果：

采用一步发酵法制备的发酵花生粕，多肽含量为8%，乳酸含量为3.0%，有益菌活菌数量为10⁸CFU/g，远低于本方法所制备的益生肽。

试验例：

以添加6%鱼粉的基础饲料为试验对照组，用益生肽分别替代饲料中的2%、4%、6%的鱼粉（相当于鱼粉总量的1/3，2/3，3/3）,配成等氮、等能的饲料，同时在各鱼粉替代组补充晶体赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸，使其达到和对照组一致的水平。饲料原料全部用粉碎机粉碎，过40目筛，混合均匀后挤压制成沉性颗粒饲料(制粒温度85℃)，通风避光处晾干，塑料袋密封。进行8周饲养实验：

表1  本发明所制备的益生肽代替鱼粉对罗非鱼生长的影响

注：同行数据具不同字母者，表示差异显著(P<0.05)

表2  益生肽代替鱼粉对罗非鱼形体指标的影响

注：同行数据具不同字母者，表示差异显著(P<0.05)

由表1，表2可知，在鱼粉含量为6%的罗非鱼饲料中，在补充赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸的条件下，本发明所制备的益生肽可代替鱼粉用量的2／3(4%)，试验组罗非鱼生长指标及形体指标与对照组相当甚至优于对照组。本发明产品益生肽替代部分鱼粉的饲养过程中，改善了罗非鱼体内酸碱平衡，提高了消化吸收利用率，提高了免疫力，减少了养殖过程中带来的水体污染。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。 

实施例1

以花生粕为原料，按料水比1:0.8与自来水混合均匀后121℃灭菌20min，灭菌后按花生粕重量的2%（v/w）接入黑曲霉（CGMCC No.9183）孢子液，混合均匀后在28℃~32℃下培养28h，每4h翻料一次；培养完毕后将3批次混合，按花生粕重量接入10%（v/w）戊糖片球菌（CGMCC No.9182），混合均匀后在37℃~46℃下厌氧发酵42h，发酵结束60℃后干燥、粉碎，制得益生肽。益生肽的多肽含量达到28.4%，乳酸含量达到8.8%，乳酸菌活菌数达到1.2×10⁹ CFU/g，酸性蛋白酶达到228U/g。

实施例2

以花生粕为原料，按料水比1:0.8与自来水混合均匀后121℃灭菌20min，灭菌后按花生粕重量的2%（v/w）接入黑曲霉（CGMCC No.9183）孢子液，混合均匀后在28℃~32℃下培养26h，每4h翻料一次；培养完毕后将3批次混合，按花生粕重量接入10%（v/w）戊糖片球菌（CGMCC No.9182），混合均匀后在37℃~46℃下厌氧发酵36h，发酵结束60℃后干燥、粉碎，制得益生肽。益生肽的多肽含量达到26.2%，乳酸含量达到8.3%，乳酸菌活菌数达到1.0×10⁹ CFU/g，酸性蛋白酶达到212U/g。

实施例3

以花生粕为原料，按料水比1:1.1与自来水混合均匀后120℃灭菌15min，灭菌后按花生粕重量的2%（v/w）接入黑曲霉（CGMCC No.9183）孢子液，混合均匀后在28℃~32℃下培养28h，每4h翻料一次；培养完毕后将3批次混合，按花生粕重量接入10%（v/w）戊糖片球菌（CGMCC No.9182），混合均匀后在37℃~46℃下厌氧发酵36h，发酵结束60℃后干燥、粉碎，制得益生肽。益生肽的多肽含量达到25.4%，乳酸含量达到8.2%，乳酸菌活菌数达到1.0×10⁹ CFU/g，酸性蛋白酶达到201U/g。

  

以上显示了和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围内所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，步骤如下：

以花生粕为原料，按料水重量比1:0.8-1:1.1与自来水混合均匀后115-121℃灭菌10-20min，灭菌后按花生粕重量的2%（v/w）接入黑曲霉孢子液，混合均匀后在28℃~32℃下培养24~28h，每4h翻料一次；培养完毕后将3批次混合，按花生粕重量接入10%（v/w）戊糖片球菌，混合均匀后在37℃~46℃下厌氧发酵36~42h，发酵结束后60℃干燥、粉碎，制得益生肽。

2.根据权利要求1所述的利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，其特征在于，所述的黑曲霉为高产酸性蛋白酶的黑曲霉，保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC9183。

3.根据权利要求1所述的利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，其特征在于，所述的戊糖片球为耐高温、快速产乳酸的戊糖片球菌，保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，其的保藏编号为CGMCC9182。

4.根据权利要求3所述的利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，其特征在于，所述的戊糖片球菌的培养步骤为：

戊糖片球菌经活化斜面接入MRS培养基37℃培养36h，而后以5%接种量进行逐级扩培12h，直至足够的固态发酵用量；

MRS培养基（g·L-1）：葡萄糖20，牛肉膏10，胰蛋白胨10，酵母膏5，K₂HPO₄ 2，柠檬酸三铵2，乙酸钠5，MgSO₄ 0.1，MnSO₄·H₂O 0.05，吐温-80 1，pH自然，121 ℃灭菌20 min。

5.根据权利要求2所述的利用花生粕二步固态发酵生产益生肽的方法，其特征在于，所述的黑曲霉的培养步骤为：

黑曲霉经活化斜面后，划线马铃薯培养基平板30℃培养5d，用无菌水冲洗平板，制成孢子悬浮液；

马铃薯培养基：马铃薯 20g，蔗糖 2g，自来水 100mL，琼脂 2g ，pH 自然（约6.0） 121℃灭20min；

马铃薯处理方法： 马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min，用纱布过滤，滤液加糖，补足水至100ml，装入三角瓶。

6.如权利要求1-5任一项所述的方法制备的益生肽。

7.如权利要求1-5任一项所述的方法制备的益生肽，多肽含量达到25%以上，乳酸含量达到8.0%以上，乳酸菌活菌数达到10⁹ CFU/g以上，酸性蛋白酶达到200U/g以上。

8.如权利要求6或7所述的益生肽在制备饲料中的应用。