CN105683363A - 类胚体，基于细胞系的人工囊胚 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制造至少双层的细胞聚集体和/或人工囊胚和/或被称为类胚体的进一步发育的类胚体的方法，所述方法包括从至少一个滋养细胞和至少一个多能和/或全能细胞形成双层的细胞聚集体，以及培养所述聚集体以获得人工囊胚。这种人工囊胚具有围绕囊胚腔的滋养外胚层样组织和内部细胞团样组织。所述细胞聚集体可以从全能或多能干细胞类型或诱导的多能干细胞类型与滋养干细胞的组合来形成。类胚体的形成可以通过将所述细胞聚集体在优选地包含Rho/ROCK抑制剂、Wnt途径调节物、PKA途径调节物、PKC途径调节物、MAPK途径调节物、STAT途径调节物、Akt途径调节物、Tgf途径调节物和Hippo途径调节物中的一种或多种的培养基中培养来实现。本发明还涉及用于使至少双层的细胞聚集体生长成人工囊胚和生长成进一步发育的类胚体、胎儿或活动物的方法。本发明还涉及包含所提到的化合物和/或细胞聚集体的体外细胞培养物。

Description

类胚体，基于细胞系的人工囊胚

技术领域

本发明属于生命科学领域。

背景技术

干细胞能够增殖、分化并组织成任何胚胎和成年器官和组织。因此，它们对于医学来说极为重要。

干细胞可以通过从胚胎结构例如囊胚收获来获得。这需要牺牲妊娠动物。此外，从胚胎收获干细胞破坏了收获它们的胚胎结构，并且通常阻止该结构变成活动物。此外，干细胞有时也可以从成年动物通过提取适合的组织来获得。

或者，干细胞可以从分化的细胞通过被称为细胞重编程的程序来获得。细胞重编程提高细胞的潜能。因此，从许多不同细胞类型例如皮肤细胞产生干细胞是可能的。重编程的干细胞类似于干细胞，因为它们具有分化成胚胎和/或胚胎外组织的能力。

干细胞在体外可以无限增殖(“培养”)，同时保留它们的多能性和分化潜力。通过这种方式，干细胞可以被繁殖、遗传操作和储存，允许使用成批的细胞用于例如研究目的。这样的源自于单个细胞或少量细胞并且保持存活的细胞被称为细胞系。因此，细胞系在遗传上基本是均质的。

某些干细胞具有分化成胚胎或胚胎外组织的能力。例如，胚胎干细胞(“ES细胞”)具有主要分化成胚胎本身和一些胚胎外组织例如卵黄囊的能力，而滋养干细胞(“TS细胞”)具有主要分化成胚胎外组织例如胎盘组织的能力。因此，ES细胞和TS细胞两者都被当作多能干细胞。

此外，存在能够分化成任何组织、包括胚胎和胚胎外组织两者的干细胞。这样的干细胞被称为全能的(或有时称为万能的)。三个经典的实例是：

MacfarlanTS,GiffordWD,DriscollS,LettieriK,RoweHM,BonanomiD,FirthA,SingerO,TronoD,PfaffSL，“胚胎干细胞的潜能随着内源反转录病毒的活性而波动”(Embryonicstemcellpotencyfluctuateswithendogenousretrovirusactivity)，Nature2012Jul5；487(7405):57-63；doi:10.1038/nature11244；

MorganiSM,CanhamMA,NicholsJ,SharovAA,MiguelesRP,KoMS,BrickmanJM，“全能胚胎干细胞在基态培养条件下出现”(Totipotentembryonicstemcellsariseinground-statecultureconditions)，CellRep.2013Jun27；3(6):1945-57.doi:10.1016/j.celrep.2013.04.034.Epub2013Jun6.)

“具有获得性多能性的重编程细胞中的双向发育潜力”(Bidirectionaldevelopmentalpotentialinreprogrammedcellswithacquiredpluripotency)，ObokataH,SasaiY,NiwaH,KadotaM,AndrabiM,TakataN,TokoroM,TerashitaY,YonemuraS,VacantiCA,WakayamaT.Nature.2014Jan30；505(7485):676-80.doi:10.1038/nature12969.

胚胎干细胞可用于产生遗传修饰的物种。这通过将干细胞与从妊娠母体自然形成并随后收获的胚胎结构合并来进行。天然胚胎结构通常是桑椹胚或囊胚。将合并的胚胎干细胞和胚胎结构置于***母体的子宫中，以便发育并形成动物。因此，胚胎结构中天然存在的细胞和注射的胚胎干细胞两者一起生长成一个胚胎，随后生长成成年动物。这产生具有两种不同遗传概貌的动物，一种概貌由胚胎产生，另一种概貌由添加的胚胎干细胞产生。因此，天然胚胎结构例如囊胚被用作媒介以支持干细胞的发育：不存在囊胚或双层细胞结构的体外形成。得到的胚胎在体内进一步发育，以在分娩后产生活动物，其具有源自于天然桑椹胚/囊胚的组织以及源自于合并的细胞的组织，因此具有两种不同的遗传概貌。

具有两种不同遗传概貌的动物被称为嵌合体。通过将遗传修饰的干细胞与天然桑椹胚或囊胚合并而获得的嵌合体被用于形成遗传修饰的物种。这可以通过如下实现：选择包含所述遗传修饰的动物，舍弃不含遗传修饰的动物，随后繁育所选动物直至所述遗传修饰均匀地出现在该株系的所有动物中。

由于需要繁育程序来获得具有相同修饰的活动物株系，这种获得遗传修饰生物体的方式冗长、困难且费力。此外，它需要杀死大量动物以收获天然桑椹胚/囊胚或选择适合的嵌合幼崽。

胚胎干细胞也可以与四倍体胚胎结构合并。四倍体胚胎结构通过将从妊娠雌性通过收获获得的来自于2细胞阶段的胚胎结构的两个细胞融合来形成。得到的单个细胞失去了形成内部细胞团和胚胎的能力。因此，在植入子宫后，四倍体胚胎结构可以形成胎盘但不能形成胚胎。然而，可以在体外将四倍体胚胎结构与胚胎干细胞互补。得到的胚胎结构可以被***到子宫中，在那里它生长成进一步发育的胚胎。由于四倍体细胞仅形成胚胎外组织，因此添加的胚胎干细胞形成胚胎整体。

因此，这种所谓的四倍体互补技术允许形成遗传修饰的物种，同时避免嵌合体形成的中间步骤。

通过嵌合体繁育或通过四倍体互补技术获得的生成的遗传修饰的动物株系，还另外用于了解发育和疾病。

然而，使用四倍体互补形成动物仍需要从妊娠雌性收获的天然媒介例如2细胞阶段的胚胎结构，并因此受到这种媒介的可获得性的限制。

拟胚体(“EB”)被用于研究并从胚胎干细胞获得分化组织。拟胚体是通过胚胎干细胞的聚集获得的直径为200至4000μm的多细胞球。这通常通过将ES细胞(即2000个细胞)重悬浮在培养基悬滴(从培养皿的塑料盖悬垂的液滴)中来实现。在植入到动物中之后或进一步体外培养之后，EB分化并形成多种非多能细胞类型，但是不组织成生物体。EB培养和植入允许评估细胞系的分化潜力或启动ES细胞的分化作为形成更加分化的细胞类型的中间步骤。迄今为止，使用ES细胞形成的拟胚体不能形成囊胚或胎盘组织，因此它们不能用于获得胚胎或活动物。

体外授精涉及哺乳动物配子的体外组合。配子是仅具有半套染色体的生殖细胞(单倍体细胞)。在雌性配子(卵子)与雄性配子(***)融合后，两个半套染色体合并以形成第一个二倍体细胞，即合子。随后将体外产生的合子转移到子宫。因此，这种方法利用了原始生殖细胞的融合来获得自然分化以形成活囊胚的细胞。

EP2088191描述了iBLAST的形成，所述iBLAST通过对ES细胞进行遗传修饰以表达cdx2来形成滋养外胚层。这种技术的缺点在于从这种技术形成的胚胎可能无意地掺入来自于修饰的ES^TSi细胞的DNA，因此污染了从其获得的生物体的遗传概貌。

胚胎对于评估药物的潜力或物质对胚胎发育的毒性来说是有价值的。此外，它们对于观察组织分化、增殖和组织来说是有价值的。为此目的，可以将从妊娠动物收获的囊胚或其他胚胎细胞结构在体外培养，产生进一步发育的胚胎。这尤其允许研究和评估(i)细胞分化、组织发育和再生，(ii)物质对诸如分化、发育和再生的过程的影响，(iii)物质的毒性。然而，这样的研究阻止了胚胎结构变成活动物，并需要牺牲用于产生胚胎的母体动物。

目前，临床前药物发现的效能和安全性受到缺乏相关体外模型的阻碍。例如，欧洲动物试验替代方法验证中心(EuropeanCenterfortheValidationofAlternativeMethods)(ECVAM)目前使用胚胎干细胞试验(EST)，其利用EB向单一分化细胞类型(即心肌细胞)的分化。这种测定法不良地反映出物质对其他组织和器官的毒性。

(i)产生遗传修饰生物体、(ii)开发药物、(iii)评估毒性的过程是费力的，并需要牺牲大量妊娠哺乳动物、消耗重要资源(空间、饲料、工作)，而且法律要求高。本发明提出了使用细胞系形成人工囊胚作为使用从妊娠动物收获的胚胎的替代物。

发明概述

本发明提供了一种促进来自于细胞系的细胞组织成双层的细胞聚集体并随后成为人工囊胚的方法。这种人工囊胚可以在体内或体外进一步生长。术语“类胚体(blastoid)”是指源自于人工囊胚并且直至胎儿形成之前的胚胎结构，其包括成腔后的人工囊胚(成腔人工囊胚)和进一步发育的胚胎。

由于干细胞系可以近乎无限地繁殖，因此本发明的用于形成人工囊胚的方法总体上克服了与需要体内产生并从妊娠母体收获胚胎相关的伦理和现实问题。可以产生大量类胚体，这在目前通过其他手段是不可能的。这种方法也允许简化源自于人工囊胚的遗传修饰的或非遗传修饰的胚胎或组织的获得。所述方法还允许通过合并相似或不同物种的几种细胞系来形成胚胎和生物体。

本发明提供了一种制造至少双层的细胞聚集体或类胚体的体外方法，所述方法包括下列步骤：

-通过将至少一个滋养细胞与至少一个多能和/或全能细胞合并来形成初始细胞聚集体；

-在培养基中培养所述初始细胞聚集体，以获得包含内部细胞层和外部细胞层的至少双层的细胞聚集体，其中所述内部细胞层包含起源于所述至少一个多能和/或全能细胞并且能够形成胚胎的内部细胞，并且其中所述外部细胞层包含起源于所述至少一个滋养细胞并且能够至少形成滋养外胚层的外部细胞；以及

-优选地培养所述至少双层的细胞聚集体以获得类胚体。

本发明还涉及可以通过这种方法获得的双层的细胞聚集体和类胚体，包含双层的细胞聚集体或类胚体的细胞培养物，以及通过将类胚体放置在***母体的子宫中或通过在体外生长所述类胚体以从类胚体生长胚胎、胎儿或活动物的方法。

附图说明

图1：类胚体的体外制备和发育。(所有标尺条为200μm)。

图1a：微孔阵列芯片和12孔板。

图1b：接种在包含小鼠ES细胞聚集体的微孔中的自由悬浮的小鼠TS细胞(绿色)。标尺条为200μm。

图1c：作为外侧上的滋养干细胞(绿色)和内侧上的胚胎干细胞(红色)的未分层的(c左侧)和双层的(c右侧)聚集体的ES-TS细胞簇。图片在接种TS细胞后24小时获取。

图1d：包含滋养外胚层(d左侧，绿色)和明显的内部细胞团(d左侧，红色)以及成腔后的囊胚腔(d右侧，内部空腔)的类胚体。图片在接种TS细胞后70小时获取。标尺条为200μm。

图2：类胚体的分子表征。(所有标尺条为200μm)。

图2a：通过滋养干细胞中的核CDX2的表达所观察的类胚体中滋养外胚层的多能性。aa：使用DAPI染料的DNA染色和特异性针对CDX2的抗体染色。ab：特异性针对CDX2的抗体染色。

图2b：通过胚胎干细胞中的核Oct4的表达所观察的类胚体中内部细胞团的多能性。ba：使用DAPI染料的DNA染色。bb：表达在ES细胞的核内的H2B-RFP分子标志物。bc：针对Oct4的抗体染色。

图2c：通过Nanog表达所观察的上胚层的形成和通过Sox17和PDGFRa表达所观察的原始内胚层。Ca：在ES细胞中表达的Sox17(绿色)和Nanog(红色)荧光报告物。Cb：在ES细胞中表达的Sox17(绿色)和Nanog(红色)荧光报告物与亮视野图片的组合。Cc：在ES细胞中使用鬼笔环肽(红色)和PDGFRa(绿色)荧光报告物的F-肌动蛋白染色。

图3：类胚体的体外和体内发育。(所有标尺条为500μm)。

图3a：通过上胚层(Ep.)的延伸、内脏内胚层(V.E.)的形成和外胚盘锥体(Ect.C.)的形成，类胚体体外发育到原肠胚期。

图3b-c：类胚体在子宫(b)内的体内发育导致形成包括进一步发育的胚胎的蜕膜(c)。

图4：形成人工囊胚的最适条件的确定。

图4a：在24小时的培养后，在ES-TS细胞簇形成期间Y27632的浓度对包吞效率的影响。

图4b：在24小时的培养后，在ES-TS细胞簇形成期间TS细胞数量对包吞效率的影响。

图4c：成腔类胚体的得率随每个微孔的平均ES细胞数量的变化。成腔类胚体的得率用96小时的培养后成腔并因此形成人工囊胚或类胚体的ES-TS细胞簇的百分率来描述。使用10μMCHIR99021来增强成腔。

图4d：内部细胞团(ICM)的尺寸随每个微孔接种的ES细胞的平均数量的变化。作为成腔类胚体内ES细胞簇的投影面积来测量的ICM的尺寸，随着每个微孔接种的ES细胞数量的增加而增加。

图4e：Wnt途径激活剂CHIR99021浓度的增加与成腔类胚体得率的增加正相关。

图4f：通过添加最高浓度为1000μM的8Br-cAMP的PKA激活与ICM尺寸的增加正相关。

图4g：使用IGF2的Akt激活和使用HB-EGF的MAPK激活与通过CDX2免疫染色所显示的Cdx2表达的增加正相关。

图4h：使用GSK3抑制剂CHIR99021(3μM)或Wnt配体Wnt3a激活Wnt途径提高了成腔类胚体的得率。使用Wnt抑制剂XAV939抑制Wnt信号传导阻止了类胚体的成腔。

图4i：Wnt、PKC和PKA途径对ES-TS细胞簇成腔的影响。对照组只包括3μMCHIR99021作为成腔剂。向CHIR99021添加cAMP、Indo.V和cAMP+Indo.V提高了类胚体成腔的得率。

详细描述

哺乳动物通过融合雄性和雌性生殖细胞系(即单倍体细胞，分别为***和卵子)，从该组合形成第一个细胞(合子)来自然生育。由合子的连续生长产生的直至胎儿形成之前的任何细胞结构，被称为胚胎结构或胚胎细胞结构。因此，术语“胚胎结构”反映出在从受精到胎儿的发育中出现的任何结构，其中包括桑椹胚、囊胚和原肠胚的发育阶段。因此，术语胚胎结构包括尚未成腔成囊胚的结构。

在自然环境下合子的细胞***产生桑椹胚，它是包含8至20个细胞的球形胚胎细胞结构。桑椹胚的细胞是全能的，意味着这些细胞能够分化成任何胚胎或胚胎外细胞类型。当桑椹胚成熟时，形成内部充满流体的空腔。这一事件与桑椹胚细胞分化成外层(滋养外胚层)和内部细胞团(ICM或成胚细胞)相关。这种成腔的细胞结构被称为囊胚。因此，囊胚是哺乳动物胚胎结构发育中的一个阶段。

囊胚的滋养细胞包围内部细胞团(ICM)以及充满流体的囊胚空腔(囊胚腔)。囊胚的滋养细胞进一步发育以形成尤其是外胚盘锥体，最终从其与子宫的内壁相组合形成尤其是胎盘。胎盘是将发育中的胎儿连接到子宫壁以允许通过母体的血液供应进行营养摄取、废物消除和气体交换的器官。

内部细胞团由具有分化成任何身体组织的能力并因此是多能的细胞构成。内部细胞团细胞也形成某些胚胎外组织例如卵黄囊。

囊胚通过滋养外胚层和ICM的细胞的增殖和分化进一步自然发育成胚胎干细胞之外的细胞。来自于ICM的细胞的发育的第一步导致形成上胚层这种最终形成动物的组织和原始内胚层这种最终形成尤其是卵黄囊的组织。

在上胚层中，细胞通过形成三个组织层、即胚胎胚层继续分化。合在一起，它们将形成成年动物中存在的所有不同组织类型。三个胚胎胚层是内胚层、外胚层和中胚层；内胚层将发育成尤其是胃肠道和呼吸道，外胚层将发育成尤其是神经***、毛发和指甲，中胚层将发育成尤其是肌肉和***。一旦三个胚胎胚层形成之后，胚胎结构变成原肠胚。由于任何胚胎胚层中的细胞不能自然分化形成源自于其他胚胎胚层之一的组织，因此胚胎胚层中的细胞是专能而不是全能或多能的。

通过胚胎胚层的进一步分化、增殖和组织化，原肠胚经过本领域中已知的各个不同阶段发育成胎儿。对于本发明的范围来说，“胚胎”被定义为以囊胚开始，并包括所有随后的发育阶段包括例如原肠胚，直至胎儿形成的一系列发育结构中的任一种结构。因此，该术语仅仅指称那些在从囊胚阶段开始的(自然)发育中出现的结构，并包括直至胎儿阶段的较晚的结构。当所有器官已基本形成时，胚胎变成胎儿。

胎儿是处于胚胎阶段之后和分娩之前的发育阶段的哺乳动物，其具有充分分化当尚未充分生长的器官。因此，胎儿不被术语“胚胎”或“胚胎结构”所涵盖。

根据本发明，初始细胞聚集体是包含至少两个细胞的细胞聚集体，其中的一个是滋养细胞，另一个是多能或全能细胞。优选地，初始细胞聚集体由两种细胞类型构成，其中的一种是滋养细胞，另一种是多能和/或全能细胞。更优选地，初始细胞聚集体包含滋养细胞和多能细胞。最优选地，初始细胞聚集体包含滋养细胞和胚胎干细胞(ES细胞)，最优选为滋养干细胞(TS细胞)和胚胎干细胞(ES细胞)。

在优选实施方式中，在本发明的方法中使用的初始细胞聚集体从至少一个滋养干细胞和至少一个多能干细胞形成，其中至少一个滋养干细胞能够形成滋养外胚层，并且其中至少一个多能干细胞能够形成内部细胞团。

在另一种实施方式中，一种细胞类型除了它自身的分化能力之外，还可以具有也存在于另一种细胞类型中的分化能力，例如在全能细胞类型与滋养干细胞的组合中。

在另一种实施方式中，具有分化成滋养外胚层的能力的细胞类型不具有分化成内部细胞团的能力，并且具有分化成内部细胞团的能力的细胞类型不具有分化成滋养外胚层的能力。

在本发明的情形中，至少双层的细胞聚集体是包含至少两个径向放置的层的分层细胞聚集体。优选地，它是包含内部细胞层和外部细胞层的球形细胞聚集体，其中内部细胞层包含起源于所述至少一个多能和/或全能细胞并且能够形成胚胎的内部细胞，并且其中外部细胞层包含起源于所述至少一个滋养细胞并且能够至少形成滋养外胚层的外部细胞。

可以存在一个或多个不同细胞类型的其他细胞层，例如第三细胞层，但优选地至少双层的细胞聚集体由两个径向放置的、由内部细胞层和外部细胞层构成的细胞层构成，其中内部细胞层包含起源于所述至少一个多能和/或全能细胞并且能够形成胚胎的内部细胞，并且其中外部细胞层包含起源于所述至少一个滋养细胞并且能够至少形成滋养外胚层的外部细胞。这被称为双层细胞聚集体。

然而，对于双层和更多层的细胞聚集体来说，通常保持最终形成类胚体或胎儿的细胞存在于位于聚集体内侧上的单一簇中，而滋养细胞存在于外侧上。然而，优选地，(至少)双层的细胞聚集体是双层细胞聚集体。

(至少)双层的细胞聚集体的成腔导致形成被称为类胚体的人工囊胚，并且进一步培养导致随后的类胚体阶段。如果能够形成内部细胞团的一个或多个细胞基本上被具有形成滋养外胚层的能力的细胞包围，将是特别优选的。如果周围的能够形成滋养外胚层的细胞以单层存在，也将是特别优选的。

人工囊胚是一种胚胎细胞结构，其具有包围囊胚腔的滋养外胚层样组织和内部细胞团样组织。人工囊胚通过至少双层的细胞聚集体的成腔来形成。内部细胞团样组织可以包含原始内胚层。

类胚体是人工囊胚向胎儿的发育中的第一阶段，但是术语类胚体还覆盖人工类胚体的直至源自于人工类胚体的胎儿形成之前的其他发育阶段。因此，类胚体也可以被称为人工胚胎，并包括通过本发明的方法获得的人工囊胚的所有发育阶段，其中尤其是涵盖人工上胚层和人工原肠胚。一旦胎儿形成后，术语类胚体不再适用。

通过本发明的方法获得的人工囊胚中的滋养外胚层样组织，是行为基本上与天然形成的滋养外胚层相同的组织。滋养外胚层样组织优选地是体外产生的滋养外胚层，具有与天然滋养外胚层相同的至少发育成外胚盘锥体和胎盘的能力。滋养外胚层样组织可以是至少部分多能的。

通过本发明的方法获得的人工囊胚中的内部细胞团样组织，是行为基本上与天然形成的内部细胞团相同的组织。内部细胞团样(ICM样)组织优选地是体外产生的内部细胞团，具有与天然内部细胞团相同的至少发育成任何身体组织和某些胚胎外组织例如原始内胚层和卵黄囊的能力。ICM样组织可以是至少部分全能的。

因此，本发明还涉及一种用于在体外获得至少双层的细胞聚集体的方法，所述方法包括：

-通过将至少一个滋养细胞与至少一个多能和/或全能细胞合并来形成初始细胞聚集体；并且

-诱导所述细胞聚集体组织成至少双层的细胞聚集体；并且

-优选地，培养所述至少双层的细胞聚集体，以允许形成其中滋养外胚层样组织包围内部细胞团和囊胚腔的细胞结构。

哺乳动物是有胎盘的动物，其在子宫内在胎盘存在下从合子自然发育，直至分娩。对于本发明的范围来说，哺乳动物包括通过囊胚期生育的所有物种，包括人类。然而，尤其是由于一些国家不允许保护与人类胚胎相关的发明，因此优选地哺乳动物是指除了人类之外的任何哺乳动物。哺乳动物的优选物种是例如啮齿动物、其中尤其是小鼠或大鼠，以及马、奶牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、猴或人类。哺乳动物的另一种优选物种是例如啮齿动物，其中尤其是小鼠或大鼠，以及马、奶牛、猪、绵羊、山羊、狗或猫。甚至更优选的动物是小鼠或大鼠，最优选的动物是小鼠。在使用不同细胞系来形成细胞聚集体的优选实施方式中，所述细胞源自于同一物种。

在本发明中使用的细胞类型例如滋养细胞、多能或全能细胞，可以从如上所述的任何哺乳动物的天然胚胎结构分离。然而，优选地，在本发明中使用的至少一种细胞类型从细胞系获得，例如滋养细胞的细胞系、多能细胞的细胞系或全能细胞的细胞系。更优选地，在本发明中使用的所有细胞类型起源于细胞系。细胞系可以通过本领域中已知的任何手段获得。

使用细胞系来形成至少双层的细胞聚集体或来自于细胞系的类胚体的优点在于，细胞系可以被储存并无限繁殖，并且因此可以避免从活动物收获细胞。使用细胞系的另一个优点在于，细胞系可以被容易地修饰，例如通过遗传修饰，以获得相同细胞类型但具有特定遗传修饰以改变其性质的细胞。优选的遗传修饰是在从经历所述遗传修饰的细胞形成的动物中产生不同遗传概貌的修饰。使用细胞系的另一个优点在于，可以获得高数量的至少双层的细胞聚集体或类胚体。

优选地，在本发明的方法中，使用至少一种二倍体细胞类型来形成细胞聚集体。只合并二倍体细胞是高度优选的。这允许遗传修饰在源自于所使用的细胞类型的动物中充分并且可预测地表达，这在使用单倍体细胞时是不可能的。

然而，也可以将至少一种非整倍体细胞类型、优选为一种四倍体细胞类型与至少一种二倍体细胞类型合并，优选为源自于四倍体囊胚的至少一种四倍体滋养细胞与至少一种二倍体专能和/或全能细胞合并。也可以将至少一个滋养细胞与至少一个单倍体细胞合并。

在本发明的方法中使用的滋养细胞可以是滋养干细胞或行为基本上类似于滋养干细胞的细胞。优选地，使用滋养干细胞(TS细胞)。高度优选的是从细胞系获得的滋养细胞例如滋养干细胞。滋养细胞的特征尤其在于Eomes、GATA3、Tead4和Tfap2c基因的表达。滋养细胞的特征还在于它形成滋养外胚层的能力。

滋养细胞也可以是诱导的滋养细胞，其是从进一步分化的细胞获得的滋养细胞。优选地，诱导的滋养细胞也表达Eomes、GATA3、Tead4和Tfap2c基因。此外，优选地，滋养细胞不是诱导的多能细胞，例如已被遗传修饰以表达Cdx2的细胞，正如在EP2088191中已经描述的。滋养细胞也可以是全能细胞。

优选地，滋养细胞是滋养干细胞(TS细胞)。TS细胞被表征为具有形成胚胎外组织包括胎盘的潜力的细胞，因此不同于ES细胞。TS细胞可以通过收获合子、2至128个细胞阶段的胚胎、桑椹胚、囊胚或植入后的胚胎(例如“***后5.5至6.5天”的胚胎阶段)，和例如如下述文献中所述建立TS细胞系培养物来获得：ScienceVolume282,Issue5396,11December1998,Pages2072-2075“通过FGF4促进滋养干细胞增殖”(PromotiontotrophoblaststemcellproliferationbyFGF4)Tanaka,S.^a,Kunath,T.^b,Hadjantonakis,A.-K.^a,Nagy,A.^b,Rossant,J.或AndrasNagy,SamuelLunenfeldResearchInstitute；MarinaGertsenstein,SamuelLunenfeldResearchInstitute；KristinaVintersten,EuropeanMolecularBiologyLaboratory；RichardBehringer,UniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenter,《操作小鼠胚胎：实验室指南》(ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual)(第三版),Coldspringharbourlaboratorypress，所述文献的内容通过参考并入本文。

或者，TS细胞可以通过细胞重编程来获得，使得RNA或蛋白质表达水平从不同的细胞类型变化到具有基本上类似于TS细胞的分化潜力的细胞类型。通过细胞重编程获得的TS细胞描述在下述文献中：ChenY,WangK,GongYG,KhooSK,LeachR.“CDX2和EOMES在人类诱导的滋养祖细胞中的作用“(RolesofCDX2andEOMESinhumaninducedtrophoblastprogenitorcells)，BiochemBiophysResCommun.2013Feb8；431(2):197-202.doi:10.1016/j.bbrc.2012.12.135.Epub2013Jan8。

优选地，滋养细胞不从ES细胞的细胞重编程获得。使用至少一个滋养细胞与使用其他类型的多能细胞、例如具有遗传修饰以允许其通过Cdx2的表达形成滋养外胚层样结构的ES细胞作为滋养细胞相比的优点在于，源自于细胞系或通过重编程获得的滋养细胞如果被收获，不导致滋养细胞无意地参与胚胎形成，从而污染从其获得的生物体的遗传背景。

在本发明中使用的至少一个多能和/或全能细胞是具有形成内部细胞团样组织的能力的细胞。多能和/或全能细胞可以是从天然胚胎结构分离的细胞，但优选地从细胞系获得。此外，可以使用诱导的多能和/或全能细胞，只要它具有形成内部细胞团样组织的能力即可。

多能干细胞可以通过从活动物或从胚胎收获来获得。对于可以如何获得多能干细胞的进一步详细情况，参考ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmericaVolume78,Issue12II,1981,Pages7634-7638“从在用畸胎瘤干细胞调制的培养基中培养的早期小鼠胚胎分离多能细胞系“(Isolationofapluripotentcelllinefromearlymouseembryosculturedinmediumconditionedbyteratocarcinomastemcells),Martin,G.R.，其内容通过参考并入本文。

此外，可以通过细胞重编程，通过将RNA和/或蛋白质表达水平从进一步分化的细胞类型改变到多能或具有基本上类似于多能细胞的分化潜力的细胞类型，来获得多能干细胞。就此而言，参考CellVolume126,Issue4,25August2006,Pages663-676“通过确定的因子从小鼠的胚胎和成年成纤维细胞培养物诱导多能干细胞“(InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdultFibroblastCulturesbyDefinedFactors)，Takahashi,K.,Yamanaka,S.，其内容通过参考并入本文。通过细胞重编程获得的多能干细胞被称为诱导的多能干细胞(iPS细胞)，并且iPS细胞非常适合于形成本发明的细胞聚集体。

作为优选的实例，用于形成本发明的细胞聚集体的多能干细胞类型可以是胚胎干细胞(ES细胞)。ES细胞可以通过从活动物或胚胎收获来获得。然而，优选地，ES细胞从源自于收获的桑椹胚或囊胚的ES细胞系培养物来获得。或者，作为具有与ES细胞相似的能力的细胞的ES细胞样细胞，可以通过细胞重编程来获得，使得RNA、酶或蛋白质表达水平从进一步分化的细胞类型逆转到具有与ES细胞基本上相近的分化潜力的细胞类型。

大鼠胚胎干细胞的获得描述在下述文献中：Buehr,M.,Meek,S.,Blair,K.,Yang,J.,Ure,J.,Silva,J.,McLay,R.,Hall,J.,Ying,Q.-L.,Smith,A,CellVolume135,Issue7,26December2008,Pages1287-1298.“从大鼠囊胚捕获真正的胚胎干细胞”(CaptureofAuthenticEmbryonicStemCellsfromRatBlastocysts)，其内容通过参考并入本文。

猕猴胚胎干细胞的获得描述在下列文献中：ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.Volume92,Issue17,15August1995,Pages7844-7848.“灵长类胚胎干细胞系的分离”(Isolationofaprimateembryonicstemcellline)，Thomson,J.A.,Kalishman,J.,Golos,T.G.,Durning,M.,Harris,C.P.,Becker,R.A.,Hearn,J.P，其内容通过参考并入本文。

或者或此外，可用于形成本发明的细胞聚集体的多能干细胞可以是全能细胞。概括来说，全能细胞是具有与全能干细胞基本上相当的分化成任何胚胎和胚胎外组织的能力的细胞。因此，全能细胞是多能干细胞。因此，在本发明的情形中，全能细胞可以用作多能干细胞。因此，在一种实施方式中，细胞聚集体包含至少一个全能细胞。全能细胞可以从胚胎或哺乳动物、优选为非人类哺乳动物分离，例如全能干细胞，或者它可以从全能细胞的培养物获得，正如下列文献所述：MacfarlanTS,GiffordWD,DriscollS,LettieriK,RoweHM,BonanomiD,FirthA,SingerO,TronoD,PfaffSL,“胚胎干细胞潜能随着内源反转录病毒的活性波动”(Embryonicstemcellpotencyfluctuateswithendogenousretrovirusactivity)，Nature2012Jul5；487(7405):57-63；doi:10.1038/nature11244)或MorganiSM¹,CanhamMA,NicholsJ,SharovAA,MiguelesRP,KoMS,BrickmanJM.“全能胚胎干细胞在基态培养条件下出现”(Totipotentembryonicstemcellsariseinground-statecultureconditions)，CellRep.2013Jun27；3(6):1945-57.doi:10.1016/j.celrep.2013.04.034.Epub2013Jun6orbyObokataH,SasaiY,NiwaH,KadotaM,AndrabiM,TakataN,TokoroM,TerashitaY,YonemuraS,VacantiCA,WakayamaT.“具有获得性多能性的重编程细胞中的双向发育潜力”(Bidirectionaldevelopmentalpotentialinreprogrammedcellswithacquiredpluripotency)，Nature.2014Jan30；505(7485):676-80.doi:10.1038/nature12969。

优选地，将至少一个多能细胞用于本发明的方法。使用多能细胞类型与全能细胞类型相比的优势在于细胞分化可以被更容易地控制。更优选地，至少一个多能细胞是胚胎干细胞(ES细胞)，甚至更优选地是从细胞系获得的胚胎干细胞。

在非常优选的实施方式中，初始细胞聚集体通过将至少一个滋养细胞例如滋养干细胞(TS细胞)与至少一个胚胎干细胞(ES细胞)合并来形成。

更优选地，初始细胞聚集体通过将同一物种的细胞合并来形成。

在本发明中使用的滋养细胞或专能和/或全能细胞的至少一个细胞，可以例如从分离的胚胎直接分离，或者通过重编程来获得，但优选地，所述至少一个细胞从源自于自然桑椹胚、自然囊胚、从核转移产生的桑椹胚、从核转移产生的囊胚、从四倍体合子产生的桑椹胚或从四倍体合子产生的囊胚、从体外授精产生的桑椹胚、从体外授精产生的囊胚的细胞系获得。优选地，在本发明的方法中不使用自然合子。在甚至更优选的实施方式中，细胞聚集体不从合子形成。更优选地，在本发明的方法中使用的TS细胞不从ES细胞的遗传修饰获得。

这意味着本发明的方法与传统的体外授精不同；体外授精利用两个原始配子，其从动物分离并在体外合并。因此，体外授精利用生殖细胞的融合，而在本发明的方法中，只使用细胞系并且不使用从妊娠母体收获的原始自然载体例如配子。此外，在体外授精期间，不形成正如在本发明中形成的至少双层的聚集体，因为一般来说，在体外授精中成腔的细胞聚集体是仅包含单一(全能)细胞类型的细胞聚集体，其不能形成双层的聚集体。在体外授精中，初始细胞分化与囊胚的形成相一致，使得不形成至少双层的细胞聚集体。此外，体外授精不包括细胞聚集体的体外成腔以在体外形成囊胚。本发明的方法与体外授精相比是一种改进，这是因为可以使用细胞系，这对体外授精来说是不可能的。

这还意味着本发明的方法与使用四倍体互补技术获得囊胚的方法不同：四倍体互补利用从妊娠母体收获的2细胞阶段的胚胎获得的原始四倍体囊胚，其细胞在体外融合。在本发明的方法中，只使用细胞系，并且不使用从妊娠母体收获的原始自然载体例如四倍体囊胚。此外，本发明的方法优选地包含仅仅单倍体细胞的组合。

这也意味着在本发明的方法中，可以避免嵌合体形成。在嵌合体形成中，将遗传改变的细胞注射到收获的自然生长的具有不同遗传概貌的桑椹胚或囊胚中。因此，发育的胚胎从自然ICM和注入的细胞的组合产生，并且在遗传上不是均质的。在本发明的方法中，类胚体可以从遗传上均质或不均质的细胞的组装产生。

重要的是，在本发明的用于获得类胚体的方法中，不需要直接使用来自于妊娠动物的原始胚胎或胚胎组织。方法主要基于可以在体外扩增的细胞系。这些细胞系可以源自于原始胚胎或胚胎组织，通过核重编程或产生具有形成胎盘、内部细胞团或两者的潜力的细胞系的任何其他方法来获得。任选地，在本发明中使用的细胞系可以被遗传改造，以便得到的类胚体或胎儿显示出天然情况下不会出现的特征。

因此，所述方法提供了不需牺牲动物即可获得双层的细胞聚集体和/或人工囊胚和/或进一步发育的类胚体的方法。它还允许形成大量遗传上等同的胚胎或活动物或具有受控的遗传修饰的物种，而不需制造和繁育嵌合体。这也降低了与胚胎研究相关的空间、饲料、工作和法律要求的量。

本发明的方法作为第一步包括通过将至少一个滋养细胞与至少一个多能和/或全能细胞合并来形成初始细胞聚集体。培养这个初始细胞聚集体以获得至少双层的细胞聚集体，通过优选地在Rho/Rock抑制剂存在下接种精确数量的每种细胞类型来实现。

(至少)双层的聚集体通常不自发形成。例如，当ES细胞和TS细胞共培养时，它们倾向于自发形成非随机的细胞簇，其中TS细胞在内侧上并且ES细胞在外侧上。这样的聚集体倾向于通过形成TS和ES细胞的附连但分立的非包吞型聚集体来演化(参见图1c，左侧)。

相反，在本发明的方法中，(至少)双层的细胞聚集体从至少一个滋养细胞和至少一个多能和/或全能细胞形成，其中所述至少一个多能和/或全能细胞位于至少双层的细胞聚集体的内侧上，而滋养细胞位于外侧上。因此，至少一个多能和/或全能细胞被滋养细胞包吞，这通过优选地在Rho/Rock抑制剂存在下接种精确数量的每种细胞类型来实现。多能和/或全能细胞被滋养细胞包吞的一个优点在于滋养细胞限制了多能和/或全能细胞的生长。由外层滋养细胞产生的空间限制了多能和/或全能细胞的生长。

在使用ES细胞和TS细胞的情形中，ES细胞位于双层的细胞聚集体的内侧，而TS细胞位于外侧。在这种情形中，ES细胞被TS细胞包吞(参见图1c，右侧)，这通过优选地在Rho/Rock抑制剂存在下接种精确数量的每种细胞类型来实现。ES细胞被TS细胞包吞的一个优点在于TS细胞限制了ES细胞的生长。由TS细胞外层产生的空间限制了ES细胞生长。

获得包含至少一个滋养细胞和至少一个多能和/或全能细胞的一个初始细胞聚集体所需的细胞数量，随着所使用的细胞类型而变。所使用的细胞数量是形成至少双层的细胞聚集体的效率的重要贡献因素。一般来说，包含至少一个滋养细胞和至少一个多能和/或全能细胞的一个细胞聚集体包含约1-500个、优选地约10-50个多能和/或全能细胞以及至少一个、优选地1-250个、更优选地8-200个、甚至更优选地12-50个滋养细胞。

在将TS细胞与多能细胞例如ES细胞组合的情形中，使用1-250个、优选地8-200个、更优选地12-50个TS细胞来形成初始细胞聚集体，并且使用1-250个、优选地2-100个、更优选地3-50个多能细胞来形成初始细胞聚集体。

具体来说，在将ES细胞与TS细胞合并以形成初始细胞聚集体的情形中，每个微孔的ES细胞数量优选为1至25个，优选为3至12个，更优选为6至8个ES细胞。所使用的ES细胞的数量是形成至少双层的聚集体、在这种情况下是ES-TS细胞簇的效率的重要贡献因素。在这种情形中，每个微孔的TS细胞的数量约为3至70个，优选为8至45个，更优选为15至20个滋养细胞。

这可以例如通过将ES细胞以1000–100000个细胞/芯片、优选地约7000个细胞/芯片的密度，优选均匀地接种在10μl-10ml、优选地0.5-3ml的培养基例如ES培养基中来实现。

细胞类型的接种可以以对于该细胞类型来说适合或实用的任何顺序来进行。因此，所有细胞类型可以在添加培养基的同时或几乎同时、之前或之后添加。此外，可以首先添加适合的细胞培养基，然后以任何顺序添加至少一个多能和/或全能细胞和至少一个滋养细胞。此外，多能和/或全能细胞和/或滋养细胞可以作为在培养基中的悬液来添加，或者可以将它们悬浮在另一种介质中，然后用培养基替换所述介质。可以首先将多能细胞例如ES细胞与滋养细胞例如TS细胞合并，然后添补培养基，或者可以首先添加滋养细胞，然后以任何顺序添加培养基和多能细胞。

一般来说，如果合并的顺序使得形成外层具有形成滋养外胚层的能力并且核心具有形成内部细胞团的能力的细胞聚集体((至少)双层的细胞聚集体)，将是优选的。

如果接种顺序进行，也是优选的。顺序接种允许被接种的细胞类型的细胞首先沉降并聚集，同时在添加第二种细胞类型之前继续繁殖。因此，形成第一种被接种的细胞类型的聚集体，其在添加第二种细胞类型后可能变得被第二种接种的细胞类型的细胞包围。

因此，一般来说，在顺序接种中首先接种至少一个多能和/或全能细胞并允许这些细胞沉降，将是优选的。细胞沉降可能花费1分钟至3天，优选地6小时至2天，更优选地12小时至36小时，最优选地在18至30小时之间，例如约24小时。

在沉降后，可以添加至少一个滋养细胞，其在培养期间也继续繁殖，但同时聚集到第一种细胞类型以形成至少双层的细胞聚集体。对于本发明的类胚体的形成来说，至少双层的细胞聚集体是高度优选的。

在使用ES细胞作为专能和/或全能细胞并使用TS细胞作为滋养细胞以形成双层的细胞聚集体的情况下，这种添加顺序是特别优选的。

如果正如在下面进一步描述的将初始细胞聚集体在Rho/Rock抑制剂存在下进行培养，将是优选的。在Rho/Rock抑制剂存在下培养初始细胞聚集体促进了至少一个滋养细胞在至少一个多能和/或全能细胞的聚集体上的聚集和/或包吞，这导致至少双层的细胞聚集体的形成，这由在Rho/Rock抑制剂Y27632的较高浓度下包吞(内部细胞类型被外部细胞类型包围)的效率提高所证实，这可以在实施例中看到。

随后将(至少)双层的细胞聚集体培养1至100天、优选地0.25–6天、更优选地约3天(或约72小时)的时间段，引起成腔。至少双层的细胞聚集体的成腔形成内部细胞团样组织以及囊胚腔，它们一起被滋养外胚层样组织包围。

(至少)双层的细胞聚集体具有约10μm至200μm的直径，并包含约2-100个、优选地4-50个、更优选地5-40个细胞。

在通过合并至少一个TS细胞和至少一个ES细胞来形成初始细胞聚集体的优选情况下，双层的细胞聚集体被称为ES-TS细胞簇。ES-TS细胞簇可以通过具有形成滋养外胚层并随后形成胎盘的潜力的外部细胞层的存在与拟胚体区分开。这可以通过滋养外胚层特有的生物因子例如转录因子如尾型同源框转录因子CDX2的表达来评估。

ES和TS细胞可以具有不同的遗传起源，使得两种类型中的一种源自于与另一种类型在遗传上不同的细胞系。这种遗传差异可能由源自于不同物种的细胞造成，或者它可能由对ES和/或TS细胞的一种或多种遗传修饰造成。在遗传修饰的情形中，如果ES细胞携带目标修饰，将是优选的，然而，两种细胞类型可以携带相同或不同的遗传修饰。然而，优选地，ES和TS细胞源自于同一物种。

ES-TS细胞簇的培养可以进行1至100天、优选地0.25–6天、更优选地约3天(或约72小时)的时间段，引起成腔。ES-TS细胞簇的成腔形成基本上包含ES细胞的内部细胞团以及囊胚腔，它们一起被滋养外胚层包围。

在优选实施方式中包含ES和TS细胞的至少双层的聚集体被称为ES-TS细胞簇，对于形成人工囊胚来说是高度优选的。在(至少)双层的细胞聚集体中，至少双层的细胞聚集体的成腔、上皮形成和多能性的维持产生人工囊胚。进一步的培养导致随后的类胚体阶段。

正如下面进一步描述的，成腔、上皮形成和多能性的维持通过调节Wnt途径、PKA途径和PKC途径中的至少一种途径来实现。如下所述，优选地，将Wnt途径和PKA与PKC途径之一激活，并且最优选地，激活所有PKC、PKA和PKC途径。

这以高效率从至少双层的细胞结构例如ES-TS细胞簇形成类胚体。具体来说，从(至少)双层的细胞聚集体形成类胚体的效率高于10％，通常高于20％，并且常常高于30％。类胚体形成的高效率通过具有表达转录因子CDX2、Eomes和GATA3的外部细胞层和表达转录因子Oct4、Sox2和至少部分表达Nanog的核心细胞聚集体的双层的聚集体的高效形成来实现。

类胚体形成的效率作为具有(1)表达转录因子CDX2、Eomes和GATA3的外部细胞层和(2)表达转录因子Oct4和Sox2并至少部分表达Nanog的内部细胞聚集体的成腔结构的百分率来度量。

为了维持得到的类胚体的多能性，调节MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和Hippo途径中的至少一种途径也是优选的。正如下面描述的，优选地，这通过激活MAPK途径、STAT途径、Akt途径和Tgf途径中的至少一种途径和/或通过抑制Hippo途径来实现。

优选地，调节MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和Hippo途径中的至少两种途径。正如下面进一步描述的，更优选地，调节MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和/或Hippo途径中的至少三种途径，甚至更优选地，调节MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和/或Hippo途径中的至少四种途径，最优选地，调节所有MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和/或Hippo途径。

维持类胚体的多能性便于将类胚体进一步培养成后续的类胚体状态，直至胎儿形成。初始细胞聚集体、至少双层的细胞聚集体和最终类胚体的形成，可以利用本领域中已知的任何手段通过将至少一个滋养细胞与至少一个多能和/或全能细胞合并来实现。这样的合并可以在悬滴设置中、在适当尺寸的杯子例如烧杯、锥形瓶或eppendorf杯中实现。

优选地，形成本发明的细胞聚集体可以通过将如上所述适合的细胞类型的适合细胞在适合的容器中合并来进行。适合的容器优选地具有非粘附性表面。非粘附性表面是细胞被放置在其上并且对细胞具有很小或没有粘附倾向性的表面。因此，细胞基本上不粘附于该表面。不希望收到理论限制，非粘附性表面的使用为细胞不粘附于表面而是彼此粘附提供了驱动力，从而形成在本发明中使用的细胞聚集体。

非粘附性表面可以通过用非粘附性生物或人造材料涂布表面来形成，或者非粘附性表面可以通过对非粘附性材料进行适当塑形或通过本领域中已知的其他手段来获得。可以在其上或其中形成细胞聚集体的容器从此将被称为支架。

具有非粘附性表面的支架由例如下述材料制成或涂布有下述材料：环氧乙烷，环氧丙烷，聚乙二醇，PEG(共)聚合物(例如PLL-g-(PEG))，聚氧化乙烯(PEO)(共)聚合物，琼脂糖水凝胶，低于其低临界溶解温度(LCST)的温度响应性材料(例如聚(N-异丙基丙烯酰胺))，疏水性材料(例如烯烃聚合物)，排斥细胞的微米和纳米形貌。

因此，本发明的细胞聚集体的形成优选地在非粘附性支架中实现。非粘附性支架具有至少一个基本上不允许细胞粘附的表面。优选地，这是其上或其中放置有形成聚集体的细胞的侧面。非粘附性支架可以从非粘附性材料形成，或者可以从涂布有非粘附材料的另一种材料形成。例如，可以使用非粘附性皮氏培养皿或试管作为支架，但优选地，支架具有平板状形状，例如多少有些六边形、五边形、正方形、矩形、三角形、卵形或圆形。

更优选地，支架包含至少一个适合的空腔或通道。优选地，在支架上存在多个空腔或通道。如果这些空腔或通道比将要形成的细胞聚集体的尺寸略大，将是优选的。适合的空腔和通道小，例如直径为20-5000μm，更优选为100-1000μm，并且最优选的是直径为100–500μm、特别是接近200μm的空腔。适合的空腔或通道可以通过本领域中已知的任何手段来获得。直径被定义为空腔或通道的开口的圆周上任两个相对的点之间的最大可能直线距离。通道或空腔具有封闭的底部，并且至少空腔或通道内部的表面包含非粘附性材料。

优选地，空腔具有长度和宽度具有近似相同的数量级的形状。深度也具有近似相同的数量级。这样的空腔被称为微孔。对于本发明来说，如果非粘附性支架包含微孔，将是优选的。微孔优选为长度是其宽度的最多5倍、优选地3倍、更优选地近似相等，并且深度不超过其宽度10倍、优选地不超过5倍、更优选地最多3倍的空腔。

微孔的长度被定义为微孔开口的圆周上的任两个相对的点之间的可能的最长直线距离。因此，微孔的长度被当作它的直径，其优选为例如20-5000μm，更优选为100-1000μm，最优选为100–500μm，特别是接近200μm。微孔的宽度倍定义为微孔开口的圆周上与其长度垂直的任两个相对的点之间的最长直线距离。

微孔的各种不同横截面，尤其是垂直和平行于支架表面的横截面，可能具有任何形状、包括不规则形状，但优选地，微孔的可能的横截面独立地是正方形或近似正方形、矩形或近似矩形、三角形或近似三角形、卵形或近似卵形或圆形或近似圆形。然而，如果微孔是圆柱形，并且在支架表面中具有近似圆形的开口，将是优选的。适合的微孔出现在例如微孔板上，正如在本领域中常用的。

对于在本发明中使用来说，特别优选的是可能出现在琼脂糖芯片上的微孔，所述芯片可以例如***到2、4、6、8、12、18或24、48、96、384孔板(WP)中。生产和使用这样的琼脂糖微孔板的适合的方法以前已被描述，其描述在下列文献中：RivronNC,VrijEJ,RouwkemaJ,LeGacS,vandenBergA,TruckenmüllerRK,vanBlitterswijkCA，“组织变形在空间上调节VEGF信号传导和血管生成”(TissuedeformationspatiallymodulatesVEGFsignalingandangiogenesis)，ProcNatlAcadSciUSA.2012May1；109(18):6886-91，并通过参考并入本文。

优选地可以使用5–25mm、特别是11mm的具有100-10000个微孔、更优选地约1000个微孔的琼脂糖芯片，例如与12孔板联合使用。

在非粘附性支架包含微孔的情况下，使多个微孔排列在单一支架上是有利的。优选地，这些微孔排列成规则的图案。这允许大量类胚体的高通量制备。

为了在非粘附性支架上形成本发明的方法的细胞聚集体，使如上所述的一种或多种细胞类型出现在支架上是有利的。如果支架包含空腔例如微孔，则如果所述一种或多种细胞类型出现在微孔内部，将是优选的。任何微孔都可以含有在本发明的方法中使用的细胞类型。优选地，在一个微孔中存在接近形成至少一个细胞聚集体所需的细胞量，更优选地，微孔中存在的细胞量是获得包含至少一个滋养细胞和至少一个多能和/或全能细胞的一个细胞聚集体所需的量。

在Rho/ROCK途径中，Rho是Ras家族的小的GTP结合蛋白成员。Rho及其一种下游效应物ROCK在肌动蛋白细胞骨架的组织、粘着斑和肌动蛋白应力纤维的装配、FAK的激活、微管的动力学、基因的转录和细胞周期的进程中发挥中心作用。Rho蛋白在有活性的结合GTP的状态和无活性的结合GDP的状态之间循环。哺乳动物RhoGTPase家族目前由三个亚家族构成，即Rho(RhoA、RhoB和RhoC)、Rac(Rac1、Rac2和Rac3)和CDC42(细胞***周期-42)(CDC42Hs和G25K)。

Rho/ROCK的激活状态由调控蛋白例如GEF(鸟苷酸转换因子)控制。RhoA的靶蛋白包括PAK(p21激活的激酶)家族、Rho激酶/ROK/ROCK(结合Rho的含有卷曲螺旋的蛋白激酶)或MBS(肌球蛋白结合亚基)。途径的激活和抑制状态可以通过使用例如流式细胞术、免疫化学、聚合酶链反应或Western印迹测量F-肌动蛋白相对含量来评估。

在本发明中，优选地调节Rho/ROCK途径，其中调节优选为抑制。正如本文中所描述，Rho/ROCK抑制可以通过本领域中已知的任何手段来实现。Rho/ROCK抑制的一种优选方式通过添加大量化合物中的一种或多种来实现，所述化合物包括但不限于Fasudil盐酸盐、GSK269962、GSK429286、H1152二盐酸盐、甘氨酰-H1152二盐酸盐、HA1100盐酸盐、SB772077B二盐酸盐、SR3677二盐酸盐或Y-27632。这些化合物可以以1至1000uM之间的浓度使用。

优选地以例如1-400uM范围内、优选为20uM的浓度使用Y27632，优选为其二盐酸盐。在本发明中，Rho/ROCK途径的抑制具有增加从初始细胞聚集体形成至少双层的细胞聚集体的优点。

Wnt途径是调控细胞生长和分化的细胞信号传导途径。Wnt途径的激活自然情况下通过配体包括但不限于Wnt蛋白(例如Wnt3a)与膜受体包括但不限于Frizzled的结合来发生。所述结合引起以例如GSK-3β从APC/Axin的移位为特征的途径的激活，这引起β-连环蛋白的核易位以及随后召集LEF/TCFDNA结合因子作为转录的辅助激活剂。

Wnt途径的激活整合了来自于其他途径的信号，包括视黄酸、FGF、TGF-β和BMP，并调节细胞生长和分化。此外，Wnt配体的结合可以激活作用于例如Rho、Rac、PKC或CamK2信号传导途径的非标准途径。

Wnt途径的激活通过例如GSK3的磷酸化和/或β-连环蛋白的磷酸化和/或核易位和/或通过本领域中已知的转录靶基因(例如TCF、AP-1、snail、纤连蛋白)的表达来评估。Wnt激活可以通过Western印迹、免疫细胞化学或本领域中已知的另一种方法来评估。

在本发明中，优选地调节Wnt途径。更优选地，调节通过以本领域中已知的任何手段激活Wnt途径来进行。Wnt配体Wnt3a或GSK3抑制剂CHIR99021的添加是激活Wnt途径的优选方式，其浓度优选为1-10uM，更优选为约3uM。

或者，Wnt途径可以通过添加锂盐如LiCl或本领域中已知的化学分子来激活，所述化学分子包括但不限于2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧)苯甲基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、6-溴靛红-3'-肟和/或脱氧胆酸6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈。

在本发明中，Wnt途径的激活具有提高至少双层的细胞聚集体的成腔得率的优点。Wnt途径激活剂例如CHIR99021浓度的提高，提高了例如ES-TS细胞簇的成腔成功率。在20uM下，CHIR99021产生接近30％的类胚体得率，而在3uM下，类胚体得率为10％。

PKA途径受到G蛋白偶联受体控制，并用于细胞通讯。在PKA信号传导途径激活后，被激活的Gsα亚基结合并激活腺苷酸环化酶，其催化ATP转化成环腺苷单磷酸(cAMP)。cAMP浓度的增加引起例如环核苷酸门控的离子通道、被cAMP激活的交换蛋白(EPAC)、蛋白激酶A酶的激活。正如本领域中已知的，PKA激活可以例如通过western印迹或免疫荧光测量CREB磷酸化或其他PKA特异性蛋白来评估。

在本发明中，优选地调节PKA途径。更优选地，调节通过以本领域中已知的任何手段、例如使用PKA激活剂或通过遗传修饰激活PKA途径来进行。使用浓度为0.1-10mM、例如浓度为1mM的PKA激活剂例如8Br-cAMP激活PKA途径，提高了成腔得率。

蛋白激酶C也被称为PKC，是参与控制上皮形成、细胞-细胞连接和细胞的顶-底极化的蛋白激酶家族。PKC被信号例如二酰基甘油(DAG)或钙离子(Ca²⁺)浓度的增加激活。在激活后，蛋白激酶C通过RACK蛋白(用于活化的蛋白激酶C蛋白的膜结合的受体)易位到质膜。

PKC途径的激活可以通过免疫细胞化学，通过PKC蛋白或细胞-细胞连接或顶-底极性蛋白例如ZO-1的膜定位来评估。

在本发明中，优选地调节PKC途径。更优选地，这通过利用本领域中已知的任何手段激活PKC途径来进行。使用例如浓度为0.1-10uM、例如1uM的IndolactamV激活PKC途径，提高了成腔得率。

MAPK途径是调控生长和分化的细胞信号传导途径。MAPK途径受到广泛的各种受体包括受体酪氨酸激酶(RTK)、整合蛋白和离子通道调控。配体包括但不限于成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、干扰素γ、肿瘤坏死因子、白介素、转化生长因子、肝素结合性EGF样生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子和/或FAS配体(也称为CD95L)的结合，调节接头包括Shc、GRB2和Crk，所述接头将受体连接到鸟嘌呤核苷酸交换因子包括SOS和C3G，并将信号传导到小的GTP结合蛋白(例如Ras、Rap1)。这些小的GTP结合蛋白激活由MAPKKK(Raf)、MAPKK(MEK1/2)和MAPK(Erk)构成的级联的核心单元。激活的Erk二聚体可以调控胞质溶胶中的靶并且也易位到核，在那里它使调控基因表达的各种不同转录因子磷酸化。

MAPK途径的激活通过MEK、ERK和/或P38MAPK的磷酸化和/或通过转录靶例如ER、ETS、Elk1、TIF1A和本领域中已知的其他转录靶的激活来评估。这可以通过聚合酶链反应、Western印迹、免疫细胞化学或本领域中已知的任何其他方法来评估。

在本发明中，优选地调节MAPK途径。更优选地，这通过利用本领域中已知的任何手段激活MAPK途径来进行。MAPK途径可以通过激活/抑制信号传导级联的成员在细胞内激活，其包括但不限于(i)使用小的化学分子包括ML099(CID-888706)、ML098(CID-7345532)和ML097(CID-2160985)以及C6神经酰胺来激活/抑制RAS，(ii)使用小的化学分子包括佛波醇12-肉豆蔻酯13-乙酸酯或IndolactamV来激活/抑制RAF1，(iii)使用小的化学分子包括SB203580来激活/抑制p38，(iv)使用小的化学分子包括203695bpV(phen)、Okaidicacid、479775α-萘酸磷酸酯来激活/抑制磷酸酪氨酸磷酸酶。

MAPK途径的激活优选地使用配体成纤维细胞生长因子4(FGF4)或肝素结合性EGF样生长因子(HB-EGF)，更优选地通过向培养基添加1.5-500ng/mlFGF4和HB-EGF蛋白，甚至更优选地通过添加15ng/mlFGF4和50ng/mlHB-EG来实现。

在本发明中，MAPK途径的激活具有维持滋养外胚层的多能性的优点，正如通过转录因子Cdx2的表达所评估的。

STAT途径调控细胞的生长、存活和分化。细胞因子包括但不限于LIF、Il6和Il11结合并诱导受体二聚化例如GP130，由此激活相关的Jaks蛋白，所述蛋白使其自身和受体磷酸化。受体和Jaks上磷酸化的位点起到含有SH2的Stat例如Stat3和含有SH2的蛋白和将受体连接到MAP激酶、PI3K/Akt和其他细胞途径的接头的停靠位点的作用。磷酸化的Stat二聚化并易位到核中，以调控靶基因转录。

所述途径的激活可以例如通过STAT的磷酸化来评估，正如例如通过western印迹所观察的。

在本发明中，优选地调节STAT途径。更优选地，这通过以本领域中已知的任何方式激活STAT途径来进行。所述途径可以被各种不同的配体包括细胞因子、激素和生长因子激活，并且它们的受体刺激JAK/STAT途径。当配体结合诱导受体亚基的多聚化时，发生细胞内激活。对于某些配体例如Epo(红细胞生成素)和GH(生长激素)来说，受体亚基作为同二聚体结合，而对于其他配体例如Ifn(干扰素)和IL(白介素)来说，受体亚基是异源多聚体。Il11可以例如以1-100ng/ml范围内的浓度使用，优选为10ng/ml。Il6可以例如以30-3000ng/ml范围内的浓度使用，优选为300ng/ml。

在本发明中，STAT途径的激活具有维持正如通过ICM的尺寸和例如Oct4、Sox2和Nanog的表达所评估的ICM的多能性和存活力，以及通过Cdx2表达所评估的滋养外胚层的多能性的优点。

Akt途径也被称为蛋白激酶B(PKB)途径，是调控转录、翻译、增殖、蛋白质合成、葡萄糖/胰岛素代谢、生长和存活的细胞信号传导途径。配体包括但不限于***、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝素结合性EGF样生长因子、神经生长因子、脑源性神经营养因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子和胰岛素与膜结合的受体酪氨酸激酶(RTK)的结合，刺激PI3K同工型。PI3K在细胞膜处催化磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的产生。PIP3进而起到第二信使的作用，帮助激活Akt。

一旦有活性后，Akt通过使参与凋亡、蛋白质合成、代谢和细胞周期的底物磷酸化来控制关键细胞过程。Akt途径的激活通过Akt的磷酸化来评估。这可以通过Western印迹、免疫细胞化学或本领域中已知的任何其他方法来评估。

在本发明中，优选地调节Akt途径。更优选地，这通过利用本领域中已知的任何手段激活Akt途径来进行。整合蛋白、B和T细胞受体、细胞因子受体、G蛋白偶联受体(GPCR)和其他刺激物已知激活Akt途径。

Akt途径可以通过使用小分子在细胞内激活。例如，Akt途径可以通过使用小的化学分子例如PS48和VO-OHpic分别调节3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(也被称为PDK1)或抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)来直接激活。

Akt途径也可以利用渗透压休克、炎性细胞因子、脂多糖(LPS)和紫外光，通过p38MAPK途径来激活。Akt途径的激活优选地使用配体胰岛素或***2(IGF2)，更优选地通过向培养基添加1-100ng/mlIGF2，甚至更优选地添加10ng/mlIGF2来进行。

Akt途径的激活具有维持正如通过Cdx2的表达所评估的滋养外胚层的多能性和正如通过ICM的尺寸所评估的ICM的存活力的优点。转录因子CDX2、Eomes和GATA3的表达通过聚合酶链反应或通过免疫细胞化学来评估。与在本领域中已知的聚苯乙烯板上接种的胚胎成纤维细胞层的顶上培养的滋养干细胞相比，使用聚合酶链反应，转录因子的表达水平优选被上调或下调不超过5倍。

转录因子CDX2、Eomes和GATA3的表达也可以通过免疫组织化学来评估。特异性针对转录因子的荧光抗体的最大强度必须位于核内，并且与在本领域中已知的聚苯乙烯板上接种的胚胎成纤维细胞层的顶上培养的滋养干细胞相比，被上调或下调必须不超过5倍。

Akt途径的激活帮助在体外培养期间维持类胚体的多能性。

Tgf途径是调控细胞生长、分化和发育的细胞信号传导途径。配体包括但不限于转化生长因子、骨形态发生蛋白、激活素和/或Nodal的结合诱导丝氨酸/苏氨酸受体激酶的寡聚化以及对于TGF-β/激活素途径来说细胞质信号传导分子Smad2和Smad3或对于骨形态发生蛋白(BMP)途径来说Smad1/5/8的磷酸化。这些smad2、3、1/5/8的磷酸化诱导与共同信号传导介导物Smad4的蛋白复合物的形成以及它们向核的易位。

一旦激活后，Tgf途径激活引起细胞生长、分化和发育的靶基因，包括转录因子AP-1、bZIP、RUNX、Fox和bHLH。Tgf途径的激活通过Smad2、3、4、1、5、8的磷酸化并通过转录靶例如AP-1、bZIP、RUNX、Fox、bHLH和本领域中已知的其他转录靶的激活来评估。这可以通过聚合酶链反应、Western印迹、免疫细胞化学或本领域中已知的任何其他方法来评估。

在本发明中，优选地调节Tgf途径。更优选地，这通过利用本领域中已知的任何手段激活Tgf途径来进行。在本发明中，Tgf途径的激活具有维持滋养外胚层的多能性的优点，这可以通过Cdx2的表达和/或通过诱导聚集体的成腔来评估。

Tgf途径的激活优选地使用配体TGFb1，更优选地通过添加0.5-50ng/ml的配体Tgfb1，甚至更优选地通过添加5ng/mlTgfb1来进行。或者，Tgfb1途径的激活使用配体激活素，优选地通过添加0.1-100ng/ml激活素A，甚至更优选地约10ng/ml激活素A来进行。

Hippo途径是调控细胞生长、凋亡和干细胞更新的细胞信号传导途径。Hippo途径参与细胞接触抑制，并通过Mst1/2和LATS1/2、Merlin、KIBRA、RASSF和Ajuba、14-3-3、α-连环蛋白、AMOT和ZO-2来调控。Hippo活性通过YAP/TAZ在核与细胞质之间的穿梭来评估。调控Hippo信号传导的上游信号包括细胞-细胞连接和极化复合物、细胞骨架和GPCR配体。

在本发明中，优选地调节Hippo途径。更优选地，这通过利用本领域中是已知的的任何手段抑制Hippo途径来进行。对于至少双层的细胞聚集体和/或类胚体的形成来说，优选地存在调节Hippo信号传导的细胞外配体，更具体为GPCR配体，甚至更具体为GPR30配体，例如1-35ng/ml、优选为10ng/ml的***，1-35uM、优选为约10uM的他莫昔芬或0.1-10uM、优选为1uM的G-1(CAS881639-98-1)。

本文中所描述的Hippo途径的调节，具有诱导成腔、上皮形成和维持细胞聚集体的多能性的优点。

本发明公开了用于获得所描述的至少双层的细胞聚集体的方法，其中使用了上述途径之一的调节(激活或抑制)的任何组合。

本发明还公开了用于获得所描述的类胚体的方法，其中使用了上述途径之一的调节(激活或抑制)的任何组合。优选地，正如所指示的，使用对每种化合物所描述的优选调节(激活或抑制)方式。

本发明还提供了一种体外细胞培养物，其包含Rho/ROCK抑制剂、Wnt途径调节物、PKA途径调节物、PKC途径调节物、MAPK途径调节物、STAT途径调节物、Akt途径调节物、Tgf途径调节物、Hippo途径调节物中的一者或多者，并且还包含(至少)双层的细胞聚集体，或者这些调节物中的任一者或多者与双层的细胞聚集体的任何组合的细胞培养物。

此外，本发明还公开了一种体外细胞培养物，其包含Rho/ROCK抑制剂、Wnt途径调节物、PKA途径调节物、PKC途径调节物、MAPK途径调节物、STAT途径调节物、Akt途径调节物、Tgf途径调节物、Hippo途径调节物中的一者或多者，并且还包含类胚体，或者这些调节物中的任一者或多者与类胚体的任何组合的细胞培养物。

类胚体得率的提高，也使用优选地包含微孔的非粘附性支架通过适合的空间约束，通过适合地形成至少双层的聚集体，并通过添加特定化合物适合地调节参与成腔和上皮形成过程以及细胞聚集体的多能性维持的信号传导途径，来实现。

组织化的诱导通过上面定义的方法来实现，即使用优选地包含微孔的非粘附性支架通过适合的空间约束，通过诱导至少双层的聚集体的形成，和/或通过调节参与成腔和上皮形成过程以及多能性维持的信号传导途径。

从源自于人工囊胚的胚胎细胞结构发育成胎儿那一刻起，术语类胚体不再适用。相反，胎儿被称为“人工胎儿”，其可能在体外或体内发育。体内发育的人工胎儿是源自于哺乳动物子宫内的类胚体的进一步发育的胎儿。如果这种进一步发育发生在体外，它被称为体外发育的人工胎儿。

优选地，将双层的细胞聚集体或类胚体植入到***母体中。更优选地，本发明的细胞聚集体在成腔后(即作为类胚体)植入，甚至更优选地在接种滋养细胞后1-1000小时、优选地48-300小时、例如约110小时植入。更优选地，类胚体在原始内胚层形成后植入，所述原始内胚层形成可以通过本领域中已知的任何手段来评估。

用于形成本发明的细胞聚集体的细胞系，可以使用本领域中已知的遗传工程方法或使用生物或化学因子例如蛋白质、酶或化学品进行遗传或表观遗传修饰。这种修饰的细胞系可能具有对胚胎或胚胎外组织的形成有贡献的潜力，正如在例如下列文献中所描述的：MacfarlanTS,GiffordWD,DriscollS,LettieriK,RoweHM,BonanomiD,FirthA,SingerO,TronoD,PfaffSL,“胚胎干细胞潜能随着内源反转录病毒活性而波动”(Embryonicstemcellpotencyfluctuateswithendogenousretrovirusactivity)，Nature2012Jul5；487(7405):57-63；doi:10.1038/nature11244；MorganiSM,CanhamMA,NicholsJ,SharovAA,MiguelesRP,KoMS,BrickmanJM,“全能胚胎干细胞在基态培养条件下产生”(Totipotentembryonicstemcellsariseinground-statecultureconditions)，CellRep.2013Jun27；3(6):1945-57.doi:10.1016/j.celrep.2013.04.034.Epub2013Jun6.)；“具有获得性多能性的重编程细胞中的双向发育潜力”(Bidirectionaldevelopmentalpotentialinreprogrammedcellswithacquiredpluripotency)，ObokataH,SasaiY,NiwaH,KadotaM,AndrabiM,TakataN,TokoroM,TerashitaY,YonemuraS,VacantiCA,WakayamaT.Nature.2014Jan30；505(7485):676-80.doi:10.1038/nature12969，所述文献的内容通过参考并入本文。

用于形成细胞聚集体的细胞系可以在本发明的类胚体形成之前或期间进行遗传修饰。遗传修饰可以包括内源序列的修饰、其他序列的***、序列的部分或完全移除或这些手段的任何组合。

此外，在本发明的方法中使用的一种或多种细胞可以任选地通过已知方法进行修饰以产生标记的细胞。这样的标记物可以是荧光蛋白，例如表达受到调控并反映出目标基因的表达的荧光蛋白。

正如本领域中已知的，用于形成本发明的细胞聚集体的细胞系可以几乎无限地储存。储存细胞意味着将细胞与培养基一起***到容器中。培养基起到维持细胞存活、促进它们***并防止它们分化的作用。因此，培养物中的细胞数量增长，使得需要将一部分细胞重复传代。然后将这一部分与培养基相组合导入到容器中，而没有被选上的剩余细胞被丢弃、在不同容器中培养或冷冻保存。

细胞的存留是一个通用术语，涵盖了尤其是储存和扩增，其基本通用意义是保持细胞存活和增殖，并在同时仍不分化。这通常也需要适合的培养基。用于培养细胞以形成本发明的细胞聚集体的适合的培养基是适合于细胞的任何细胞培养基；适合于细胞的细胞培养基在本领域中是已知的。

一般来说，适合于细胞的细胞培养基包含例如维生素、氨基酸和无机盐。然而，细胞培养基的准确组成可能随着细胞类型而变，并且专业技术人员知道如何获得适合于在本发明中使用的每种细胞类型的细胞培养基。

例如，用于多能和/或全能细胞、尤其是ES细胞的基础培养基是例如Dulbecco改良的Eagle培养基，其包含胎牛血清(FBS)(10％v/v)、L-谷氨酰胺(2mM)、β-巯基乙醇(50mM)、青霉素/链霉素(50μg/ml)、非必需氨基酸(1％v/v)和白血病抑制因子(10μg/L)。作为第二个实例，用于TS细胞的基础培养基是RPMI1640，其使用碳酸氢盐缓冲***并改变了氨基酸和维生素(77％v/v)、FBS(20％v/v)、青霉素/链霉素(50μg/ml)、丙酮酸钠(100mM)、L-谷氨酰胺(2mM)、β-巯基乙醇50mM、FGF-4(25ng/ml)、肝素(1μg/ml)的量。

用于多能和/或全能细胞、尤其是ES细胞的储存、扩增和存留的另一种适合的培养基是包括B27和N2组分的无血清培养基，其在本领域中是已知的，并且可以例如通过将下列化合物以接近于所给出的量合并来制造。DMEM/F12培养基(48％v/v)，Neurobasal培养基(48％v/v)，L-谷氨酰胺(2mM)，N2增补剂(1％v/v)，B27增补剂(2％v/v)，丙酮酸钠(100mM)，非必需氨基酸(1％v/v)，β-巯基乙醇(0.1mM)，青霉素/链霉素(50μg/ml)，BSA(5mg/ml)。这样的培养基描述在下列文献中：YingQL,WrayJ,NicholsJ,Batlle-MoreraL,DobleB,WoodgettJ,CohenP,SmithA.“胚胎干细胞自我更新的基态”(Thegroundstateofembryonicstemcellself-renewal，Nature.2008May22；453(7194):519-23.doi:10.1038/nature06968。

用于多能和/或全能细胞、尤其是ES细胞的储存、扩增和存留的另一种适合的培养基，是在本领域中已知的作为E8培养基的无血清培养基，其描述在下述文献中：ChenG1,GulbransonDR,HouZ,BolinJM,RuottiV,ProbascoMD,Smuga-OttoK,HowdenSE,DiolNR,PropsonNE,WagnerR,LeeGO,Antosiewicz-BourgetJ,TengJM,ThomsonJA.Nat.Methods.2011，“人类iPSC衍生和培养的化学上确定的条件”(ChemicallydefinedconditionsforhumaniPSCderivationandculture)。

用于形成本发明的细胞聚集体的小鼠全能细胞，例如通过收获和/或作为细胞系培养获得的全能干细胞和通过例如多能干细胞或进一步分化的细胞类型的重编程获得的全能细胞，可以例如存留在如上所述或如下列文献中所描述的用于ES细胞的基础培养基中：MacfarlanTS,GiffordWD,DriscollS,LettieriK,RoweHM,BonanomiD,FirthA,SingerO,TronoD,PfaffSL，“胚胎干细胞的潜能随着内源反转录病毒的活性而波动”(Embyronicstemcellpotencyfluctuateswithendogenousretrovirusactivity)，Nature2012Jul5；487(7405):57-63；doi:10.1038/nature11244)或MorganiSM1,CanhamMA,NicholsJ,SharovAA,MiguelesRP,KoMS,BrickmanJM.，“全能胚胎干细胞在基态培养条件下产生”(Totipotentembyronicstemcellsariseinground-statecultureconditions)，CellRep.2013Jun27；3(6):1945-57.doi:10.1016/j.celrep.2013.04.034.Epub2013Jun6或“具有获得性多能性的重编程细胞中的双向发育潜力”(Bidirectionaldevelopmentalpotentialinreprogrammedcellswithacquiredpluripotency)，ObokataH,SasaiY,NiwaH,KadotaM,AndrabiM,TakataN,TokoroM,TerashitaY,YonemuraS,VacantiCA,WakayamaT.Nature.2014Jan30；505(7485):676-80.doi:10.1038/nature12969.，上述文献的内容通过参考并入本文。

适合于形成本发明的初始细胞聚集体的优选的多能细胞是胚胎干细胞(ES细胞)。例如，小鼠ES细胞可以在上述培养基之一中存留。具体来说，ES细胞可以通过将细胞接种在本领域中已知的胚胎成纤维细胞(“mEF”)的细胞层上来扩增。mEF细胞层通过将mEF细胞以1000至50000个细胞/cm²之间的细胞密度、优选地以10000至25000个细胞/cm²之间的密度接种在组织培养板中并随后扩增来获得。mEF细胞的附着可以在上面描述的培养基之一中进行。这可能花费几小时到几天，优选地约1天时间。这一程序产生EF层，ES细胞可以接种在其上。小鼠ES细胞以1至50000个细胞/cm²之间的细胞密度、优选地以10000至25000个细胞/cm²之间的密度，在适合的培养基中接种在EF细胞层上。接种在mEF细胞上的小鼠ES细胞优选地在存在信号转导和转录蛋白信号传导激活剂(STAT蛋白信号传导激活剂)例如可以以1至1000μg/L的浓度使用的白血病抑制因子的情况下扩增。或者，ES细胞可以在没有饲养细胞层的情况下在例如明胶涂层上或细胞外基质涂层上或本领域中已知的微珠上，例如使用mEF调制的培养基，例如使用化学化合物PD03259011μM、CHIR990213μM来培养，正如以前在下述文献中描述的：Nature.2008May22；453(7194):519-23.“胚胎干细胞自我更新的基态”(Thegroundstateofembryonicstemcellself-renewal)，YingQL,WrayJ,NicholsJ,Batlle-MoreraL,DobleB,WoodgettJ,CohenP,SmithA。

作为第二个实例，小鼠TS细胞可以如本领域中已知进行培养，例如在《小鼠胚胎的操作：实验指南》(ManipulatingthemouseEmbryo:ALaboratoryManual)(第三版).AndrasNagy,SamuelLunenfeldResearchInstitute；MarinaGertsenstein,SamuelLunenfeldResearchInstitute；KristinaVintersten,EuropeanMolecularBiologyLaboratory；RichardBehringer,UniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenter,Coldspringharbourlaboratorypress中所述，或者在无血清条件下例如在TX培养基中培养，例如在下列文献中所述：KubaczkaC,SennerC,Araúzo-BravoMJ,SharmaN,KuckenbergP,BeckerA,ZimmerA,BrüstleO,PeitzM,HembergerM,SchorleH.“鼠类滋养干细胞在限定条件下的衍生和维持”(DerivationandMaintenanceofMurineTrophoblastStemCellsunderDefinedConditions)，StemCellReports.2014Jan30；2(2):232-42.doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.013.eCollection2014Feb11。

例如，将TS细胞以1至50,000个细胞/cm²、优选地3,000至10,000个细胞/cm²的密度接种在如上所述的EF细胞层上，并在适合的培养基中培养(参见下文)。小鼠TS细胞优选地维持在EF细胞上，任选地在激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和/或细胞外调控的受体酪氨酸激酶的蛋白例如成纤维细胞生长因子4(25ng/ml)和/或转化生长因子超家族的蛋白质部分例如激活素(优选地约10ng/ml)和/或tgfb1(优选地1-10ng/ml)或功能相似的化合物存在下。

扩增的ES或TS细胞从mEF细胞层的解离方便地通过已知的酶法或非酶方法来进行，优选地通过胰蛋白酶处理，其中加入胰蛋白酶以松开细胞层或聚集体。随后，在使用饲养细胞层的情形中，通过在优选地由塑料例如聚苯乙烯制成的新鲜平板中温浴5至60分钟、优选地约20分钟来剥离mEF细胞，这导致mEF细胞粘附于新鲜平板。由于ES或TS细胞粘附得不如mEF细胞快，因此可以将ES或TS细胞与mEF细胞分离开。这一程序可以被有利地重复并允许将mEF细胞与ES或TS细胞分离开，产生悬浮在培养基中的纯的ES或TS细胞。细胞的酶和非酶解离方法包括胰蛋白酶处理方法在本领域中是公知的，参见例如《小鼠胚胎的操作：实验指南》(ManipulatingthemouseEmbryo:ALaboratoryManual)(第三版).AndrasNagy,SamuelLunenfeldResearchInstitute；MarinaGertsenstein,SamuelLunenfeldResearchInstitute；KristinaVintersten,EuropeanMolecularBiologyLaboratory；RichardBehringer,UniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenter,Coldspringharbourlaboratorypress，其内容通过参考并入本文。

因此，将TS细胞用胰蛋白酶处理，从EF上剥离并重悬浮在TS细胞培养基中。将该悬液接种到含有ES细胞簇的微孔中，以便每个微孔接种约3至70个、优选地8至45个、更优选地15至20个滋养干细胞。TS细胞在约15分钟至1小时内沉降，随后可以通过本领域中已知并且在下文中描述的常规技术在亮视野显微镜下对它们进行计数。这可以例如通过将TS细胞以1000–100000个细胞/芯片、优选地约17000个细胞/芯片的密度，优选均匀地接种在10μl-10ml、优选地0.5-3ml的培养基例如TS培养基中。

在本发明的方法中使用的细胞的旨在储存或存留的培养，优选地在温箱中、在所述物种最适的温度下进行，所述最适温度一般为10-60℃，优选为25-45℃，更优选为35-40℃。

用于形成本发明的方法的细胞聚集体例如初始细胞聚集体、(至少)双层的聚集体或人工囊胚的细胞的培养，优选地在温箱中、在所述物种最适的温度下进行，所述最适温度一般为10-60℃，优选为25-45℃，更优选为35-40℃。

本发明的初始细胞聚集体具有分化成滋养外胚层样组织和内部细胞团样组织的能力。内部细胞团具有分化成原始内胚层的能力，正如由例如Sox17和PDGFRa的表达所示。因此，在本发明中使用的初始细胞聚集体可以包含具有分化成滋养外胚层和内部细胞团的能力的单一细胞类型。在例如细胞聚集体包含一种或多种全能细胞的情形中，优选地在细胞聚集体基本上只包含全能细胞类型的情形中，情况正是如此。本发明的这种实施方式被本发明所涵盖，尽管它不太优选。

在ES细胞与TS细胞合并以形成初始细胞聚集体的优选实施方式中，对于ES细胞培养物来说，在添加TS细胞之前，数小时至数天、特别是接近1天的培养时间段是优选的，以允许初始ES细胞簇的形成。

优选地，在至少一个滋养干细胞和ES细胞被用作至少一个如上所定义的多能干细胞的情形中，在添加TS细胞之前允许ES细胞沉降并聚集。ES细胞的沉降允许形成初始细胞簇，其在添加TS细胞并添加细胞骨架的调节剂例如Rho/ROCK抑制剂，例如以1-100uM、优选地2-50uM、例如约20uM的浓度添加p160ROCK抑制剂Y27632后，可以被TS细胞包围，由此形成双层的聚集体，其在这种情形中被称为ES-TS细胞簇。

在计数之前、之后或期间，可以有利地添加培养基例如B27N2、TX或E8培养基，其可能增补有例如如上所述的细胞骨架张力抑制剂例如Rho/ROCK抑制剂，或Wnt调节剂、优选为Wnt激活剂，PKA调节剂、优选为PKA激活剂，PKA调节剂、优选为PKC激活剂，MAPK调节剂，优选MAPK激活剂，STAT调节剂，优选STAT激活剂，Akt调节剂，优选Akt激活剂，Tga调节剂，优选Tga激活剂和/或Hippo调节剂、优选为Hippo抑制剂。

E8培养基在本领域中是已知的，并且其组分已经描述在下列文献中：Nat.Methods.2011,“用于人类iPSC衍生和培养的化学上确定的条件”(ChemicallydefinedconditionsforhumaniPSCderivationandculture)，ChenG¹,GulbransonDR,HouZ,BolinJM,RuottiV,ProbascoMD,Smuga-OttoK,HowdenSE,DiolNR,PropsonNE,WagnerR,LeeGO,Antosiewicz-BourgetJ,TengJM,ThomsonJA。

此外，在这种情况下，正如在别处所描述的，细胞的接种优选均匀地进行。此外，优选地在添加培养基后允许TS细胞沉降。

作为粗略的指导，为了根据本发明从ES和TS细胞形成初始的(至少)双层的细胞聚集体和随后的类胚体，在优选情况下，一个有利地具有约200μm的直径的微孔优选地包含约9个ES细胞作为单一细胞簇，向其加入约17个TS细胞和20uMRho/ROCK抑制剂例如Y27632。这产生ES-TS细胞簇，其可以按照本发明进行培养以形成人工囊胚并在随后形成类胚体。

每个空腔的平均细胞数量可以通过本领域中已知的方法来计数。接种适合的细胞数量的一种适合的方法是使用血细胞计数器来评估单细胞悬液的细胞浓度，随后接种适合的细胞数量。由于在单一空腔中形成类胚体的成功部分取决于存在的细胞数量和类型，因此在所使用的各个空腔中尽可能均匀地接种细胞是实用的。

按照本发明，(至少)双层的细胞聚集体、优选为ES-TS细胞簇的培养，以优选地引起(至少)双层的细胞聚集体成腔的方式进行。成腔是从(至少)双层的细胞结构通过细胞的分化和增殖形成球状结构的过程。被称为囊胚腔的内部、充满流体的空腔，被以形成胎盘的潜力为特征的一层滋养外胚层细胞包围。滋养外胚层的特征还在于细胞表达转录因子CDX2、Eomes和GATA3。成腔过程还产生被滋养外胚层包围的内部细胞团和囊胚腔。

成腔可以通过选择适合的培养条件来实现，或者它可以自发发生。在后一种情形中，可以从所有培养的聚集体中选择成腔聚集体。在这种情况下，培养可以在本领域中已知和/或在上文中描述的任何适合的培养基中进行。

在一种实施方式中，成腔可以通过将细胞聚集体在任何培养基中培养并允许成腔发生来实现。然而，这种情况发生的成功率低，例如千分之五。因此，为了通过这种方法获得类胚体，必须从培养的细胞聚集体群体中选择适合成腔的细胞聚集体。选择可以通过在常规显微镜下观察囊胚腔的形成来进行。

然而，类胚体优选地可以按照本发明，通过将细胞聚集体在含有如上所述的成腔诱导组分的培养基中培养来获得。成腔诱导组分可以作为固体或在溶液中供应到细胞培养物，但优选地，将它们添加到已知的培养基例如B27N2、E8或TX，以获得用于培养形成细胞聚集体的细胞和/或用于培养细胞聚集体以获得人工囊胚的精心设计的培养基。

在一种优选实施方式中，细胞聚集体的成腔通过如下所述调节Wnt途径、PKC途径和/或PKA途径，并且优选地还包括MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和/或Hippo途径中的至少一者来实现。

在最优选的实施方式中，细胞聚集体的成腔通过调节Wnt途径、PKC途径和PKA途径来实现。Wnt、PKC和PKA途径对细胞聚集体的成腔的影响描述在图4中。

内部细胞团(ICM)的尺寸取决于接种的ES细胞的平均数量，并且如图4中所述随着每个微孔接种的ES细胞的数量而增加。由其投影面积所定义的尺寸一般在1000至5000um²之间，优选地在2000至4500um²之间。所述尺寸方便地通过使用光学显微术测定ICM的投影面积(以um²为单位)来表示。

内部细胞团(ICM)的尺寸还取决于培养基中包含的特定生物因子的浓度。例如，ICM的尺寸取决于PKA调节物的浓度，例如取决于cAMP的浓度。ICM的尺寸还取决于Akt调节物的浓度，例如取决于IGF2的浓度。ICM的尺寸还取决于STAT调节物的浓度，例如取决于Il6、LIF或Il11的浓度。

或者，正如本领域中已知的，Wnt途径、PKC途径、PKA、MAPK途径、Hippo途径、转化生长因子(Tgf)途径和Akt途径可以通过遗传激活来调节。

因此，在本发明的方法中，培养细胞聚集体以获得类胚体在细胞培养基中进行，所述培养基优选地包含Wnt途径、PKC途径、PKA途径、MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和Hippo途径调节物中的至少一种，优选地更多种。在优选实施方式中，向已知的细胞培养基例如B27N2、TX或E8培养基添加一种或多种这些组分。

为了获得ES-TS细胞簇，如果首先将ES细胞接种在微孔阵列上的包含白血病抑制因子的ES培养基中(最适为9个ES细胞/微孔)，将是高度优选的。将ES细胞培养24小时并形成聚集体。然后将TS细胞接种到同一微孔阵列上的B27N2培养基中(最适为17个TS细胞/微孔)。添加Rho/ROCK途径和细胞骨架张力的抑制剂，以便促进TS细胞在ES细胞聚集体上的聚集以及双层聚集体的形成，将是高度优选的。这可以是例如p160ROCK的抑制剂例如Y27632分子，浓度为约1-100μM，优选地20μM左右。

为了获得类胚体，细胞聚集体应该形成内部空腔。实现这一点的非常优选的方式是通过激活Wnt信号传导途径、PKC途径和PKA途径。

这优选地可以通过向培养基添加GSK3抑制剂和/或Wnt蛋白来实现。更优选地，这通过向培养基添加GSK3抑制剂CHIR99021来实现，其浓度优选为0.3-30μM，甚至更优选为3uM。此外，向培养基添加浓度优选为0.1-10mM、更优选为1mM的PKA激活剂8Br-cAMP，向培养基添加浓度优选为0.1-10uM、更优选为1uM的PKC调节物IndolactamV，也是优选的。

空腔的形成通过聚集体内不被细胞核占据的体积的形成来评估。空腔的形成优选地使用用核特异性染料(例如DAPI)染色的细胞聚集体的横截面来评估。空腔的形成更优选地通过细胞聚集体的横截面内不含细胞核并覆盖超过细胞聚集体总表面积的5％的表面的存在来评估。

为了获得类胚体，如果在成腔期间维持分层细胞聚集体的起源于至少一个多能干细胞并具有形成胚胎细胞的潜力的至少一部分内部细胞的全能或多能性，将是高度优选的。这可以通过调节MAPK、STAT、Akt、Tgf和/或Hippo途径，优选地通过激活MAPK、STAT、Akt、Tgf途径并通过抑制Hippo途径来实现。

更优选地，这通过优选地以1-150ng/ml、更优选地15ng/ml的浓度向培养基添加MAPK途径调节物FGF4配体，和/或通过优选地以5-500ng/ml、更优选地50ng/ml的浓度向培养基添加STAT途径调节物HB-EGF，和/或通过优选地以0.5-50ng/ml、更优选地5ng/ml的浓度向培养基添加Tgf途径调节物Tgfb配体，和/或通过优选地以1-100ng/ml、更优选地10ng/ml的浓度向培养基添加Akt途径调节物IGF2配体，和/或通过优选地以3-3000ng/ml、更优选地300ng/ml的浓度向培养基添加STAT途径调节物Il6配体，来实现。

ICM的多能性的维持通过转录因子、也被称为POU5F1(POU结构域，5类，转录因子1)的八聚体结合性转录因子4(Oct4)、性别决定区Y-box2(Sox2)和Nanog的表达来评估。这些转录因子的表达通过聚合酶链反应和/或免疫细胞化学来评估，正如本领域中已知的。

与在本领域中已知的聚苯乙烯板上培养的胚胎干细胞相比，转录因子的表达水平的上调或下调必须不超过5倍。这些转录因子的表达也可以通过免疫组织化学来评估。特异性针对转录因子的荧光抗体的最大强度必须位于核内，并且与在本领域中已知的聚苯乙烯板上接种的胚胎成纤维细胞层的顶上培养的滋养干细胞相比，被上调或下调必须不超过5倍。

优选地，Wnt调节物和MAPK调节物两者都存在于培养基中。两种类型的调节物的存在具有诱导成腔并同时维持细胞的生存力和多能性的有利效果。

更优选地，Wnt和MAPK调节物的这种组合被扩展到存在PKA和Tgfb调节物。添加这种调节物的效果是提高成腔和维持滋养外胚层和ICM的生存力和多能性。

甚至更优选地，将上述Wnt、MAPK、PKA和Tgfb调节物的组合扩展到存在Akt、STAT和PKC调节物。这具有提高细胞的多能性和生存力的有益效果。

在优选实施方式中，培养细胞聚集体以获得类胚体在包含Wnt途径激活剂、MAPK途径激活剂、PKA途径激活剂、PKC途径调节物、Tgf途径激活剂、Akt途径激活剂、STAT途径激活剂和Hippo抑制剂的培养基中进行。

在非常优选的实施方式中，获得类胚体的培养在另外包含Y27632、CHIR99021、FGF4、8Br-cAMP、TGFb1、IGF2、IndolactamV、Il6和***的B27N2培养基中进行。更优选地，在这种培养基中，Y27632以约1-100uM、优选地约20uM的浓度存在，CHIR99021以约1-25μM、优选地3μM的浓度存在，FGF4以约2-50ng/ml、优选地约15ng/ml的浓度存在，8Br-cAMP以0.1-10mM、优选地约1mM的浓度存在，TGFb1以约1-15ng/ml、优选地约5ng/ml的浓度存在，IGF2以1-15ng/ml、优选地约5ng/ml的浓度存在，IndolactamV以0.1-10uM、优选地约1uM的浓度存在，Il6以50-900ng/ml、优选地约300ng/ml的浓度存在，并且***以1-50ng/ml、优选地约10ng/ml的浓度存在。

已知某些化合物落于所提到的两类或更多类中；在这种情况下，使用具有两类或更多类中的功能的单一化合物，可以代替使用所述单一化合物可以被指派到的每个类中的分开的化合物。

除了上述化合物之外，在培养基中包含其他化合物例如血清如胎牛血清(FBS)、矿物质、维生素和有助于保持培养物中的细胞存活、增殖和分化的其他化合物，将是有利的。

当培养包含ES细胞和TS细胞的细胞聚集体时，用于形成细胞聚集体的优选培养基的实例，其在本文写作之时被称为实践本发明的最佳方式，包含如上定义的B27N2培养基，并增补有(作为近似的终浓度)：

·20uMY27632

·3uMCHIR99021

·10ng/mlIGF2

·1mM8Br-cAMP

·5ng/mlTGFb1

·15ng/mlFGF4

·1nM007-AM

·1uMIndolactamV

·300ng/mlIl6

·10％胎牛血清(FBS)

本发明还涉及可以通过遵照本发明的方法获得的类胚体。

本发明还涉及可以通过遵照本发明的方法获得的类胚体例如人工囊胚。

本发明还涉及可以通过遵照本发明的方法获得的至少双层的细胞聚集体，优选为双层的细胞聚集体，最优选为如上所述的ES-TS细胞簇。

使用本发明的诱导成腔、上皮形成和多能性维持的培养基的另一个优点在于可以使用大量不同种类的包含或不包含遗传修饰的ES和TS细胞系。

一般来说，在成腔后，已从细胞聚集体形成本发明的类胚体。可以分离初始人工囊胚或将其在体外或体内进一步生长。优选地，将类胚体培养直到至少成腔完成。成腔可以通过常规的光学显微术观察，其允许确定成腔的终点。

在获得人工囊胚后，可以将它在体外进一步培养到其他类胚体阶段。优选地，这通过将细胞培养物转移到本领域中已知的粘附性表面来实现(参见“小鼠胚胎的体外发育：植入前至肢芽阶段”(DevelopmentofMouseEmbryosinvitro:PreimplantationtotheLimbBudStage)，作者：L.T.Chen和Y.C.HsuReviewedwork(s):Source:Science,NewSeries,Vol.218,No.4567(Oct.1,1982),pp.66-68)，所述文献以其整体并入本文。

在类胚体的成腔完成后，可以将人工囊胚培养任何时间长度，只要细胞能够保持存活即可(参见图3)。

作为第二选项，可以通过将囊胚放置在infidibulum和/或哺乳动物的子宫中、优选地在囊胚细胞所源自的相同或相似物种的哺乳动物的子宫中，将人工囊胚或任何紧接之前的或进一步发育的类胚体阶段在体内进一步生长。这正如本领域中常规已知的来实现(参见：《小鼠胚胎的操作：实验指南》(ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual)(第三版).AndrasNagy,SamuelLunenfeldResearchInstitute；MarinaGertsenstein,SamuelLunenfeldResearchInstitute；KristinaVintersten,EuropeanMolecularBiologyLaboratory；RichardBehringer,UniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenter,Coldspringharbourlaboratorypress)。如果打算将类胚体生长成胎儿或活动物，这种方法是优选的(参见图3)。

然而，也可以转移在成腔之前的细胞聚集体、即作为(至少)双层的细胞聚集体，其可以在子宫内成腔。

然而，对于本发明的类胚体的体内生长来说，也可以只在一定的进一步体外发育后植入所述类胚体。因此，作为原肠胚、上胚层或胎儿植入到子宫中也是可能的，这意味着一般来说，在植入到子宫中之前，人工囊胚在体外的培养在形成后继续约1至30天，更优选地1-10天。在本发明的背景中，涉及将人工囊胚或进一步发育的体外生长的类胚体或从其获得的胎儿放置在子宫中以允许其进一步体内生长的任何选项，都被称为类胚体的体内生长。

通过在体内生长类胚体获得的活的哺乳动物可以具有遗传修饰。这可以通过如上所述对用于形成细胞聚集体的细胞进行遗传修饰而方便地实现。细胞的一个遗传修饰可以通过已知的这种细胞的扩增来增殖，以获得具有相同遗传概貌和相同遗传修饰的单一细胞系。

或者，活的嵌合体可以通过从具有不同遗传概貌的细胞系形成细胞聚集体来获得，例如源自于不同物种的细胞系的嵌合体，或来自于具有不同遗传修饰的细胞系的嵌合体。然而优选地，为了形成细胞聚集体，不同的遗传概貌源自于相同物种的细胞的一种或多种遗传变异、包括遗传修饰，以产生在同一物种中具有两种或更多遗传变异的活的嵌合体。

正如专业技术人员所理解的，从一个原始衍生细胞系创造具有不同遗传修饰的几种细胞系，产生了具有相同的“基本”遗传概貌但具有不同遗传修饰的遗传文库。在本发明的背景中，这样的细胞系可以产生类胚体、胎儿或活哺乳动物的遗传上一致或遗传上变化的文库。因此，本发明提供了对哺乳动物进行遗传修饰的方便的途径，不需要随后的嵌合体繁育和杂交。同时，可以在一种遗传概貌内获得高度遗传均质性或受控的遗传可变性。

再生医学旨在疾病或创伤后替换或再生组织或器官。晚些时候，在成年生命期间，组织再生可以通过胚胎程序的短暂重建来实现。因此，体外类胚体为理解机制或实现再生和获得所需的组织或具有正确分化能力的细胞提供了容易的手段。实现这一点不需使用活动物来收获胚胎。因此，通过培养类胚体直至具有正确分化能力的细胞形成，本发明的类胚体可用于获得在再生医学中使用的适当分化的组织。这样的细胞可以被提取并植入到活组织内，其目的是修复该组织。特别是在类胚体源自于与待修复组织具有相同遗传背景的细胞的情况下，通过例如使用从同一个体获得的诱导的多能干细胞，这种方法产生遗传上等同的细胞，其能够修复需要修复的组织。

通过将多能干细胞包封在类胚体中为它们重新产生微环境生境，可能诱导遗传和/或表观遗传变化，产生优于现有干细胞培养物的优选性质，例如提高的进行遗传编辑(例如同源重组)的能力。

在毒理学领域中，预测试验物质的胚胎毒性由欧洲动物试验替代方法验证中心(EuropeanCenterfortheValidationofAlternativeMethods)(ECVAM)使用胚胎干细胞试验(EST)来进行。这种测定法利用了小鼠胚胎干细胞在体外分化成心肌细胞。体外产生的人工囊胚或从其生长的组织、胚胎或胎儿，为这种毒性试验提供了有价值的互补的模型。

在药物开发领域中，临床前药物发现的效能和安全性受到缺乏相关的体外模型的阻碍。候选药物常规地在细胞单层上试验，其只是不良地反映出组织的生理背景。活组织的复杂的体外模型对于模拟疾病的病理生理学来说是非常重要的。因此，本发明的用于获得类胚体的方法为鉴定新的药物靶带来了很大希望，并提高了新药物临床成功的概率。

此外，临床药物试验常常需要“敲除”动物，其中某些基因已被失活或改变，以容易地获得患有所研究的疾病的动物。使用本发明，正如所述，可以生长大量用于这种研究的动物，它们在遗传上一致或具有受控的遗传修饰。这便于在动物模型上试验新药物，并允许更高的统计相关性。

在遗传病领域中，遗传改变的动物被用于鉴定潜在的治疗。正如上面解释的，这样的动物可以通过本发明的方法容易地获得，而不牺牲许多母体动物，并且不需要产生并进一步杂交和繁育嵌合体。

此外，未知起源的遗传缺陷现在可以通过收获单细胞，随后在体外扩增成适合于形成本发明的聚集体的细胞系来扩增。因此，可以获得大量具有所研究的遗传缺陷的动物，并且没有当遗传缺陷在生物学上产生时惯有的其他遗传变异。

本发明将利用下面的非限制性实施例进行进一步说明。

实施例

化合物和缩写：

·B27N2培养基＝本领域中已知的一种细胞培养基，其组成在上文中描述。

·E8培养基＝一种可商购的细胞培养基，其组成描述在下述文献中：Nat.Methods.2011，“用于人类iPSC衍生和培养的化学上确定的条件”(ChemicallydefinedconditionsforhumaniPSCderivationandculture)，ChenG¹,GulbransonDR,HouZ,BolinJM,RuottiV,ProbascoMD,Smuga-OttoK,HowdenSE,DiolNR,PropsonNE,WagnerR,LeeGO,Antosiewicz-BourgetJ,TengJM,ThomsonJA。

·TX培养基＝一种细胞培养基，其组成描述在下述文献中：KubaczkaC,SennerC,Araúzo-BravoMJ,SharmaN,KuckenbergP,BeckerA,ZimmerA,BrüstleO,PeitzM,HembergerM,SchorleH.，“鼠类滋养干细胞在确定条件下的衍生和维持”(DerivationandMaintenanceofMurineTrophoblastStemCellsunderDefinedConditions)，StemCellReports.2014Jan30；2(2):232-42.doi:10.1016/j.stemcr.2013.12.013.eCollection2014Feb11。

·ES培养基＝一种可商购的细胞培养基，其组分在上文中描述。

·CHIR99021＝一种抑制GSK3a和GSK3β的化合物，其化学名称为6-{2-[4-(2,4-二氯-苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-嘧啶-2-基氨基]-乙基氨基}-氰基吡啶(CAS252917-06-9).

·LIF：白血病抑制因子是本领域中已知的一种维持小鼠和大鼠胚胎干细胞的多能性的蛋白质和生长因子。

·Y27632＝(1R,4r)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己烷甲酰胺。本领域中已知的一种抑制Rho/ROCK途径的分子(CAS146986-50-7)。

·激活素＝本领域中已知的一种激活TGF信号传导途径的蛋白质和生长因子。

·转化生长因子β1(TGFb1)＝本领域中已知的一种激活TGF信号传导途径的蛋白质和生长因子

·IndolactamV＝本领域中已知的一种调节PKC途径的分子(90365-57-4)

·Il6＝本领域中已知的一种激活STAT信号传导途径的蛋白质和生长因子。

·成纤维细胞生长因子4(FGF4)＝本领域中已知的一种激活MAPK信号传导途径的蛋白质和生长因子

·肝素结合性EGF样生长因子(HB-EGF)＝本领域中已知的一种激活MAPK信号传导途径的蛋白质和生长因子

·***2(IGF2)＝本领域中已知的一种激活Akt途径的蛋白质和生长因子

·胰岛素＝本领域中已知的一种激活AKT信号传导途径的蛋白质和激素

·17β-***＝本领域中已知的一种通过***受体和GPR30调节Hippo途径的激素(CAS79037-37-9)

·他莫昔芬＝本领域中已知的一种通过***受体和GPR30调节Hippo途径的分子(CAS10540-29-1)

·G-1＝本领域中已知的一种通过GPR30调节Hippo途径的分子(CAS881639-98-1)

ES培养基含有：

·Pen/Strep50μg/ml(一种可以从Invitrogen获得的抗生素，目录号15070-063)

·L-谷氨酰胺1mM

·5ml非必需氨基酸(Invitrogen#11140-035，x100)

·β-巯基乙醇0.1mM

·75ml(＝15％)FBS

·DMEM，至500ml

·白血病抑制因子，500-1000单位/ml

使用的“2i”培养基包含上述的ES培养基，然后添加组分：

·1μMPD0325901CAS号391210-10-9。

·3μMCHIR99021CAS号252917-06-9。

TS培养基含有：

·250mlofRPMI培养基1640(Invitrogen61870或11875)

·65ml胎牛血清

·Pen/Strep，50μg/ml

·丙酮酸钠1mM

·L-谷氨酰胺，2mM

·β-巯基乙醇0.1mM

·FGF-4，25ng/ml

·肝素，1μg/ml

B27N2培养基

·234mlDMEM/F12(Invitrogen#11320-074，[-]L-谷氨酰胺)

·234mlNeurobasal(Invitrogen#21103-049，[+]L-谷氨酰胺)

·2.5ml(-1mM)L-谷氨酰胺(Invitrogen#25030，x100)

·5ml非必需氨基酸(Invitrogen#11140-035，x100)

·5mlPen/Strep(Invitrogen#15140)

·5mg/mlBSA(Sigma)

·5ml丙酮酸钠，终浓度为1mM(Invitrogen#11360-039，x100)

·2.3μl(＝0.1mM)β-巯基乙醇(Sigma)

·5mlN2增补剂(Invitrogen)

·10mlB27增补剂(Invitrogen)

用于类胚体形成的培养基的制备：

向培养基供应优选组分的储用溶液是：

·10％FBS(GreinerBioone)

·Y27632：20μM

·CHIR99021(AxonMedchem，axon1386).3uM

·8Br-cAMP(8Br-cAMP经济级，Biolog，B007-50E).1mM.

·007-AM(BiologC051).1nM.

·IGF2(R&Dsystem,292-G2-050)10ng/ml

·TGFb1(R&Dsystem338-AC-010)，10ng/ml

·FGF4(R&Dsystem235-F4-025)，15ng/ml

·HB-EGF(R&Dsystem259-HE-050)，50ng/ml

·17β***(491187Aldrich)，10ng/ml

·IndolactamV(3651Tocris)，1uM

实施例1：获得类胚体

第-4天

将小鼠胚胎成纤维(EF)细胞以15.000个细胞/cm²的密度接种在聚苯乙烯组织培养板中的ES培养基中。允许细胞在设定在37℃的培养箱中生长一天。

第-3天

将小鼠ES细胞以15.000个细胞/cm²的密度接种在含有LIF(500单位/ml)的“2i”培养基中的小鼠EF层上。将小鼠ES细胞在设定在37℃的培养箱中培养两天。

第-2天

将小鼠TS细胞以10000个细胞/cm²的密度接种在TS培养基中的小鼠EF细胞层上，置于设定在37℃的培养箱中。

第-1天

将小鼠ES细胞用胰蛋白酶处理，并通过在一个15cm平皿中使用4mlES培养基温浴2x20分钟，剥除小鼠EF细胞。

将小鼠ES细胞以7个细胞/微孔的密度接种在150μLES培养基中。允许ES细胞沉降20分钟，然后加入1mlES培养基，并将培养物在37℃培养箱中放置1天，以允许小鼠ES细胞簇集。

第0天

将如对第-2天所述获得的小鼠TS细胞培养物用胰蛋白酶处理，并通过在一个15cm平皿中使用4mlTS培养基温浴2x20分钟，剥除小鼠EF细胞。将获得的小鼠TS细胞重悬浮在B27N2培养基中。

将小鼠TS细胞以17个细胞/微孔的密度接种在150μLB27N2培养基中。在20分钟后，加入1mlB27N2培养基，其包含10％FBS，Y2763220μM，8Br-cAMP(1mM)，007-AM(1nM)和CHIR3μM，FGF415ng/ml，Tgfb15ng/ml，IGF2，10ng/ml，***10ng/ml。将细胞置于设定在38℃的培养箱中以形成ES-TS细胞簇。

在接下来的几天中，加入下列组分以获得注明的终浓度，假设初始浓度为零，尽管可能残存有这些化合物。

第3天(65小时)

将B27N2培养基更新成添加有

·FGF4(15ng/ml)

·TGFb1(5ng/ml)

在约110小时后将带有琼脂糖芯片的12孔板从培养箱取出。到目前为止，已通过ES-TS细胞簇的成腔形成人工囊胚。此时，可以用粘附性支架(例如聚苯乙烯组织培养板)代替非粘附性支架以在体外继续生长类胚体，或者可以将类胚体转移到假孕小鼠的子宫。

实施例2：可视化

双层形成：具有TS细胞外层和ES细胞内层的(至少)双层的细胞聚集体的形成使用转基因细胞系来评估。具体来说，将ES细胞用细胞肥大病毒启动子控制下的组蛋白2B和红色荧光蛋白转染并克隆衍生。因此H2B-RFPES细胞在它们的核内组成性表达红色荧光，这允许它们的追踪。

TS细胞源自于在所有细胞中组成性表达细胞肥大病毒启动子控制下的绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠。因此GFPTS细胞在它们的细胞质中表达绿色荧光，这允许它们的追踪。

因此，通过观察绿色的细胞外层和红色的细胞内层来评估双层聚集体的形成。包吞的效率被确定为在培养ES-TS细胞簇24小时后，与围绕红色投影区域(代表ES细胞的内部聚集体)人工画出的3像素宽的圆环交叠的绿色投影区域(代表TS细胞层)的百分率。在图4中描述的所述包吞的效率代表了从约200个ES-TS细胞簇获取的平均值。

成腔：空腔的形成通过聚集体内没有被细胞核占据的空间的形成来评估。空腔的形成优选地使用用核特异性染料(例如DAPI)染色的细胞聚集体的横截面来评估。空腔的形成更优选地通过不含细胞核并覆盖细胞聚集体的总表面积的20％以上的细胞聚集体的横截面内的表面的存在来评估。

CDX2、Oct4、Nanog表达：在包括表达GFP的TS细胞的ES-TS聚集体中转录因子CDX2的表达，通过常规的免疫细胞化学来评估。cdx2的表达被评估为每10μm显微镜切片中具有cdx2阳性核的GFP阳性细胞的数量。在包括表达H2B-RFP的ES细胞的ES-TS聚集体中转录因子Oct4和Nanog的表达，通过常规的免疫细胞化学来评估。Oct4和Nanog的表达被评估为每10μm显微镜切片中具有Oct4或Nanog阳性核的H2B-RFP阳性细胞的数量。

用于类胚体形成的程序的直观图概述：将自由悬浮的专能小鼠ES细胞***到位于放置在12孔板中的琼脂糖芯片中的200μm微孔中(图1a)，并允许其在ES培养基中簇集。向这些簇加入自由悬浮的小鼠TS细胞(图1b)以及培养基。在培养基中所描述的化合物包括Rho/ROCK抑制剂等的影响下，细胞形成滋养干细胞(图1c，绿色)和胚胎干细胞(图1c，红色)的双层聚集体，其随后在包括培养基中存在的Wnt途径调节物、PKA途径调节物和PKC途径调节物等的影响下成腔，并形成滋养外胚层(d，绿色)和明显的内部细胞团(图1d，红色)，以产生类胚体。

正如通过滋养干细胞中CDX2的表达(图2a)所观察到的，通过包含MAPK途径激活剂、STAT途径激活剂、Akt途径激活剂、Tgf途径激活剂和Hippo途径抑制剂，滋养外胚层维持多能性。正如通过H2B-RFP标记的胚胎干细胞中Oct4的表达(图2b)所观察到的，内部细胞团维持多能性。正如通过Nanog、Sox17和PDGFRa表达(图2c)所观察到的，内部细胞团分离成上胚层和原始内胚层。

在粘附于粘附性支架后，类胚体通过上胚层(Ep.)的延伸、脏壁内胚层(V.E.)的形成和外胚盘锥体(Ect.C.)的形成进一步发育，与天然形成的囊胚相似(图3a)。

在转移到子宫内(图3b)之后，类胚体诱导蜕膜的形成(图3c)，在蜕膜中它们进一步发育(图3d)成胎儿或活动物。

结论：

在将体外扩增的小鼠ES细胞和来自于细胞系的小鼠TS细胞在优选地包含选自Rho/ROCK信号传导调节物、Wnt信号传导调节物、PKA信号传导调节物、PKC信号传导调节物、MAPK信号传导调节物、STAT信号传导调节物、Akt信号传导调节物、Tgf信号传导调节物、Hippo信号传导调节物和EPAC1信号传导激活剂中的一者或多者的培养基中组合后，ES细胞和TS细胞合并成ES-TS细胞簇，其在约110小时后表现出成腔、上皮形成、多能性的维持和原始内胚层的分化。因此，类胚体形成。

人工囊胚可以被分离并任选地固定或植入到子宫中。此外，它也可以进一步在体外培养以产生进一步分化的类胚体。这也可以被分离并任选地固定，但是它也可以被植入到子宫内以进一步体内生长。

Claims (17)

1.一种制造至少双层的细胞聚集体或类胚体的体外方法，所述方法包括下列步骤：

-通过将至少一个滋养细胞与至少一个多能和/或全能细胞相组合来形成初始细胞聚集体；

-将所述初始细胞聚集体在培养基中培养，以获得包含内部细胞层和外部细胞层的至少双层的细胞聚集体，其中所述内部细胞层包含起源于所述至少一个多能和/或全能细胞并且能够形成胚胎的内部细胞，并且其中所述外部细胞层包含起源于所述至少一个滋养细胞并且能够至少形成滋养外胚层的外部细胞；以及

-优选地培养所述至少双层的细胞聚集体以获得类胚体。

2.权利要求1的方法，其中所述至少双层的细胞聚集体包含胚胎干细胞和滋养干细胞。

3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述至少双层的细胞聚集体在非粘附性支架中形成。

4.权利要求3的方法，其中所述非粘附性支架包含微孔。

5.权利要求1-4的方法，其中所述至少双层的细胞聚集体或类胚体通过添加Rho/ROCK抑制剂来获得。

6.权利要求1-5的方法，其中所述培养包括调节参与成腔、上皮形成和/或多能性的维持的信号传导途径。

7.权利要求6的方法，其中所述至少双层的细胞聚集体或类胚体的成腔、上皮形成和/或多能性的维持，通过调节Wnt途径、PKA途径、PKC途径、MAPK途径、STAT途径、Akt途径、Tgf途径和/或Hippo途径中的至少一者来实现。

8.权利要求7的方法，其中所述Wnt途径的调节通过激活Wnt途径来实现。

9.权利要求8的方法，其中所述Wnt途径的激活通过添加糖原合成酶激酶抑制剂(GSK3抑制剂)、通过添加Wnt激动剂或通过遗传修饰来实现。

10.权利要求7的方法，其中所述PKA途径的调节通过使用PKA激活剂激活PKA途径或通过遗传修饰来实现。

11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述培养基还包含血清。

12.一种类胚体，其可以通过前述权利要求任一项的方法获得。

13.一种至少双层的细胞聚集体，其可以通过前述权利要求任一项的方法获得。

14.一种用于生长胚胎的方法，所述方法包括在体外生长至少双层的细胞聚集体或类胚体。

15.一种用于生长胚胎的方法，所述方法包括在子宫内生长至少双层的细胞聚集体或类胚体。

16.一种细胞培养物，其包含Rho/ROCK抑制剂、Wnt途径调节物、PKA途径调节物、PKC途径调节物、MAPK途径调节物、STAT途径调节物、Akt途径调节物、Tgf途径调节物、Hippo途径调节物中的一种或多种，并且还包含至少双层的细胞聚集体。

17.一种细胞培养物，其包含Rho/ROCK抑制剂、Wnt途径调节物、PKA途径调节物、PKC途径调节物、MAPK途径调节物、STAT途径调节物、Akt途径调节物、Tgf途径调节物、Hippo途径调节物中的一种或多种，并且还包含类胚体。