CN105683362A - 用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能干细胞的悬浮和群集 - Google Patents

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S.内尔森
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Abstract

本发明提供了制备用于分化的聚集多能干细胞群集的方法。具体地，本发明公开了使用悬浮液群集将多能细胞分化成β细胞、心脏细胞以及神经元细胞谱系的方法。所述方法涉及制备所述聚集细胞群集，之后进行这些群集的分化。

Description

用于分化成胰腺内分泌细胞的人多能干细胞的悬浮和群集
相关申请的交叉引用
本申请为美国申请13/998,974(提交于2013年12月30日)的部分继续申请，其要求美国临时申请61/747,799(提交于2012年12月31日)和美国临时申请61/962,158(提交于2013年11月1日)的优先权，这两个申请均全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明属于细胞分化领域，包括制备胚胎干细胞和其他保持聚集的细胞群集的多能性以便分化成内胚层祖细胞、胰腺内分泌细胞、中胚层细胞或外胚层细胞的多能细胞。在一个方面，本发明公开了生成多能干细胞的群集以及将其保持在悬浮培养物中以便分化成胰腺内胚层、胰腺内分泌前体细胞、和单激素胰腺内分泌细胞的方法。
背景技术
用于Ⅰ型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得人们把注意力集中在开发适于移植的胰岛素分泌细胞(即β细胞)的来源上。一种方法是由多能干细胞诸如胚胎干细胞生成功能性β细胞。
在脊椎动物胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。组织(诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏)将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是定形内胚层的形成。
到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所述因子唯一地标记内胚层的前、中和后区。例如，HHEX和SOX2鉴定内胚层的前区，而CDX1、CDX2和CDX4鉴定内胚层的后区。
内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这有助于肠管的分区。这通过多种分泌因子诸如FGF、Wnt、TGF-β、视黄酸(RA)和BMP配体及其拮抗剂来完成。例如，据报道，FGF4和BMP促进假定后肠内胚层中的CDX2的表达并阻遏前基因HHEX和SOX2的表达(2000Development,127:1563–1567)。WNT信号转导也已显示与FGF信号转导平行工作，以促进后肠发育并抑制前肠命运(2007Development,134:2207–2217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调控前肠-后肠边界(2002CurrBiol,12:1215-1220)。
特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得分区成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。例如，肠管中分区的胰腺域显示PDX1的极高表达以及CDX2和SOX2的极低表达。PDX1、NKX6.1、PTF1A和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；而CDX2在肠组织中高度表达。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。背侧和腹侧胰腺域产生自前肠上皮。前肠也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管***。
胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在PDX1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，PDX1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。成熟的胰腺包括由胰腺内胚层的分化产生的外分泌组织和内分泌组织两者。
D’Amour等人描述了在高浓度活化素和低血清的存在下，人胚胎干细胞来源的定形内胚层的富集培养物的产生(NatureBiotechnol2005,23:1534-1541；美国专利号7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾包膜下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利7,704,738)。在添加FGF10和视黄酸后，人胚胎干细胞来源的定形内胚层细胞还可以分化成PDX1阳性细胞(美国专利申请公布2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的脂肪垫中的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利7,993,920和美国专利7,534,608)。
Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的***(美国专利7,033,831)。小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-β受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development2011,138:861-871；Diabetes2011,60:239-247)已用于显著增加胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(CurrOpinCellBiol2009,21:727-732；NatureChemBiol2009,5:258-265)。
在改善用于培养祖细胞(诸如多能干细胞)的方案中已取得巨大进展。PCT公布WO2007/026353(Amit等人)公开了在二维培养***中将人胚胎干细胞保持在未分化状态下。Ludwig等人在2006年(NatureBiotechnology,24:185-7)公开了用于在基质上培养人胚胎干细胞的TeSR1确定成分培养基。美国专利申请公布2007/0155013(Akaike等人)公开了使用贴壁到多能干细胞的载体在悬浮液中生长多能干细胞的方法，并且美国专利申请公布2009/0029462(Beardsley等人)公开了使用微载体或细胞封装在悬浮液中扩增多能干细胞的方法。PCT公布WO2008/015682(Amit等人)公开了在没有基底粘合性的培养条件下在悬浮培养物中扩增和保持人胚胎干细胞的方法。
美国专利申请公布2008/0159994(Mantalaris等人)公开了在三维培养***中培养包封在藻酸盐微球内的人胚胎干细胞的方法。
尽管有这些进展，但仍然需要在三维培养***中成功地培养可分化成功能性内分泌细胞的多能干细胞的方法。
附图说明
在结合附图阅读上述发明内容以及以下对本发明的详细说明时能够更好地进行理解。出于说明本发明的目的，附图展示了本发明的实施例。然而应当理解，本发明不局限于示出的精确布置方式、实例和工具。
图1a示出根据实施例1的紧接着在提升之后(左图)以及在非贴壁静态培养物中24小时之后(右图)的人胚胎干(“hES”)细胞系H1的经 处理的细胞的显微图。提升(左图)之后的细胞类似于平均片段直径为约20-30微米的单层片段，每个片段由细胞团块组成。在非贴壁静态培养物中24小时之后，将细胞假定成群集状构造。
图1b示出根据实施例1的在含有25mL培养基的125mL转瓶中培养4天后的人胚胎干细胞系H1的经处理的细胞的CD9、SSEA4、CXCR4、TRA-1-60和TRA-1-81的流式细胞术结果。对于多能性标志物(CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)，细胞表现出高表达，而对于分化标志物CXCR4，几乎没有表达。
图1c示出在第1阶段结束时在分化72小时和96小时之后的人胚胎干细胞系H1的经处理的细胞的显微图。在图1c中可以看到，在4倍放大率下的72小时后的松散的细胞聚集体(左图)，在4倍放大率下的96小时后的松散的细胞聚集体(中间图)，以及在10倍放大率下的96小时后的松散的细胞聚集体(右图)。
图1d示出在标记物CD9、CD184(CXCR4)和CD99的第1阶段分化结束时人胚胎干细胞系H1的经处理的细胞的流式细胞术结果(参见实施例1)。如图1d所示，多能性标志物CD9的表达几乎被消除，而定形内胚层的分化标志物CXCR4(CD184)和CD99的表达相当高。
图1e示出与未分化的H1(WA01)hES细胞相比，所选择的与多能性相关联的基因以及与在第1阶段结束时的人胚胎干细胞系H1的经处理的细胞的定形内胚层相关联的基因的表达的定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)的结果(参见实施例1)。与未分化的WA01hES细胞相比，第1阶段结束时的细胞显示出多能性基因(CD9、NANOG和POU5F1/OCT4)的表达显著减少，而与定形内胚层相关联的基因(CXCR4、CERBERUS(CER1)、GSC、FOXA2、GATA4、GATA6、MNX1和SOX17)的表达大量增加。
图1f示出随着细胞从定形内胚层进一步朝向胰腺内胚层分化，人胚胎干细胞系H1的经处理的细胞的显微图(参见实施例1)。细胞和细胞群集的清晰形态变化可被视为从第2阶段第1天(顶部左图)到第2阶段第3天(顶部右图)到第3阶段第4天(下部左图)以及第4阶段第1天(下部右图)的分化过程。
图2a示出在EDTA处理后在搅拌悬浮培养物中培养2天之后，以及在转移到与根据实例2的多能性和分化相关联的标志物的分化培养物之前的人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的流式细胞术数据。对于多能性标志物(CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)，数据显示出高表达，而对于分化标志物(CXCR4)，几乎没有表达。
图2b示出根据实例2的分化成在转瓶中生长的第1阶段第3天细胞以及在转瓶或锥形瓶中生长的第2阶段第2天，第4阶段第1天和第4阶段第3天细胞的人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的显微图。悬浮液分化的培养物在球形聚集体中形成基本上均匀和同质的细胞群。
图2c示出在多能性细胞表面标志物和内胚层分化细胞表面标志物的第1阶段结束时的人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的流式细胞术数据。在图2c中可以看到，多能性标志物CD9的表达几乎被消除，而定形内胚层的分化标志物CXCR4(CD184)的表达相当高。
图2d示出在第1阶段结束时与未分化的H1(WA01)hES细胞相比，所选择的与多能性相关联的基因以及与人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的定形内胚层相关联的基因的表达的qRT-PCR结果(参见实例2)。图2d示出多能性基因(CD9、Nanog和POU5F1/OCT4)的表达减少，而与定形内胚层相关联的基因(CXCR4、CERBERUS(“CER1”)、FOXA2、GATA4、GATA6、MNX1和SOX17)的表达大量增加。
图2e示出根据实例2的指示通过悬浮在转瓶或锥形瓶中从第1阶段分化成胰腺内胚层细胞的人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的分化的标志物(NKX6.1、CDX2、SOX2和嗜铬粒蛋白)的流式细胞术数据。该流式细胞术数据示出高水平的NKX6.1(功能性β细胞所需的转录因子)，以及高水平的内分泌胰腺标志物，诸如突触素(数据未示出)和具有两种悬浮形式的嗜铬粒蛋白。
图2f示出根据实例2的所选择的与通过悬浮在转瓶或锥形瓶中从第1阶段进一步分化成胰腺内胚层细胞的人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的分化相关联的基因的表达的qRT-PCR结果。将该数据与WA01hES细胞中的表达进行比较。RT-PCR结果示出胰腺前体基因的高水平表达。
图3a示出在用处理后已从静态培养物提升的人胚胎干细胞系H1的细胞的显微图。如图3a所示，细胞作为小聚集体从表面移除。
图3b示出在用处理后已从静态培养物提升，并且然后在悬浮培养物中扩增三天的人胚胎干细胞系H1的细胞的相差显微图。在图3b中可以看到基本上均匀的球形细胞群群集的形成。
图3c示出在用处理后已从静态培养物提升，然后在悬浮培养物中扩增三天，并且然后使用解离连续传代的人胚胎干细胞系H1的细胞群集的显微图。
图4a示出在分化的不同阶段使用定向分化方案悬浮培养的细胞系H1的人胚胎干细胞的显微图。在图4a中可以看到在每个分化阶段的细胞的显微图。
图4b示出在分化的不同阶段(开始分化后几小时)使用定向分化方案悬浮培养的细胞系H1的人胚胎干细胞的分化标志物(CXCR4、CD56和PDX1)的流式细胞术结果。在第4阶段的第4天的分化过程结束时，对于PDX1表达，高百分比的细胞是阳性的。
图4c示出移植了封装在TheraCyteTM装置中的分化细胞的SCID-Bg小鼠的非空腹血糖水平。
图5a示出在转移到与多能性和分化相关联的标志物的分化培养物之前，人胚胎干细胞系H1的经EDTA处理的细胞的流式细胞术数据。如图5a所示，观察到高表达的多能性标志物CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-80。
图5b示出在第1阶段期间对于三种不同进给设定，CXCR4/CD184和CD99(分化标志物)以及CD9(多能性标志物)的细胞相差图像以及流式细胞术数据。测试条件如下：(A)在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基；(B)在引发分化后24小时更换培养基并且在48小时处添加葡萄糖丸；以及(C)在整个第1阶段不用葡萄糖更换培养基并且在引发分化后24小时添加GDF8丸，然后在引发后48小时处添加葡萄糖丸。
图5c示出表现出胰腺内胚层形态的分化细胞的相差图像，所述分化细胞在形成定形内胚层期间使用以下进给设定分化：(A)在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基；(B)在引发分化后24小时更换培养基并且在48小时处添加葡萄糖丸；以及(C)在整个第1阶段不用葡萄糖更换培养基并且在引发分化后24小时添加GDF8丸，然后在引发后48小时处添加葡萄糖丸。
图5d示出在第4阶段结束时分化细胞的胰腺基因表达的选择标志物(NKX6.1和嗜铬粒蛋白)以及选择非胰腺基因(CDX2和SOX2)的流式细胞术结果，所述分化细胞在形成定形内胚层期间使用以下进给设定分化：(A)在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基；(B)在引发分化后24小时更换培养基并且在48小时处添加葡萄糖丸；以及(C)在整个第1阶段不用葡萄糖更换培养基并且在引发分化后24小时添加GDF8丸，然后在引发后48小时处添加葡萄糖丸。
图5e示出在第4阶段结束时分化细胞的选择胰腺和非胰腺基因表达的qRT-PCR结果，所述分化细胞在形成定形内胚层期间使用以下进给设定分化：(A)在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基；(B)在引发分化后24小时更换培养基并且在48小时处添加葡萄糖丸；以及(C)在整个第1阶段不用葡萄糖更换培养基并且在引发分化后24小时添加GDF8丸，然后在引发后48小时处添加葡萄糖丸。该数据显示为与未分化的H1(WA01)hES细胞相比的倍数表达差(基线表达为1)。
图5f示出C-肽在植入了根据条件A(在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基)分化的细胞的SCID-Bg小鼠中的表达。每个SCID-Bg小鼠均在肾包膜下植入了五百万个细胞。如图5f所示，植入后12周，可以检测到人c-肽水平高于1ng/mL，并且在16周时，c-肽水平为平均2.5ng/mL。
图5g示出在施用(例如，植入)根据条件A(在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基)分化的细胞之前和之后对所选择的SCID-Bg小鼠进行葡萄糖处理的效果。如图5g所示，葡萄糖处理诱导循环中人c-肽从空腹状态中的平均0.93ng/mL显著增加到进食状态中的2.39ng/mL。
图5h示出在已施用根据条件A(在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基)分化的细胞的SCID-Bg小鼠上施用链脲佐菌素(STZ)(即，链脲佐菌素诱导的糖尿病)的效果。从图5h中明显可见，具有功能性GSIS有效组织的移植物的动物(即，已施用了细胞的那些动物)保持正常血糖水平，不像发展为明显糖尿病的未处理对照。
图6a示出在分化之前在微载体珠上生长的人胚胎干细胞系H1的细胞的显微图。
图6b示出在分化的各个阶段处在微载体珠上生长的人胚胎干细胞系H1的细胞的显微图。
图6c示出细胞计数(细胞/cm2)作为在以下各项上生长和分化的人胚胎干细胞系H1的细胞的分化天数的函数：含有活化素A(AA)和WNT3A的培养基中的板(WTN3A/AA板)，含有活化素A和WNT3A的培养基中的微载体(WTN3A/AA微载体)，含有MCX和GDF8的培养基中的板(MCX/GDF8板)以及包含有MCX和GDF8的培养基中的微载体(MCX/GDF8微载体)。
图6d示出细胞计数(细胞/ml)作为在以下各项上生长和分化的人胚胎干细胞系H1的细胞的分化天数的函数：含有活化素A和WNT3A的培养基中的板(WTN3A/AA板)，含有活化素A和WNT3A的培养基中的微载体(WTN3A/AA微载体)，含有MCX和GDF8的培养基中的板(MCX/GDF8板)以及含有MCX和GDF8的培养基中的微载体(MCX/GDF8微载体)。
图6e示出在以下各项的存在下在微载体培养物或平面培养物上生长的细胞的第一分化阶段的流式细胞术结果：(a)WNT3A和AA，或(2)MCX和GDF8，作为CXCR4/CD184(Y轴)和CD9(X轴)的细胞表达的点阵图。
图6f示出在以下各项的存在下在微载体培养物或平面培养物上生长的细胞的第一分化阶段的流式细胞术结果：(a)WNT3A和AA，或(2)MCX和GDF8，作为每种标志物(CXCR4和CD9)的总表达。
图6g示出所选择的与人胚胎干细胞系H1的细胞的分化相关联的基因的表达的qRT-PCR结果，所述细胞在以下各项的存在下通过在平面培养物上或者在悬浮培养物中的微载体珠上生长来分化：(a)WNT3A和AA，或(2)MCX和GDF8。
图7示出对于根据实例7的方案分化的细胞，在生物反应器中从第1阶段第1天到第4阶段第3天分化的各个阶段处的细胞计数。细胞计数以百万个细胞/ml示出，如通过基于图像的细胞仪测定的。
图8示出在实施例7的分化方案期间日均生物反应器培养基pH水平作为时间(分化天数)的函数。pH水平通过NOVAFLEX(NovaBiomedicalCorporation,Waltham,MA)确定。
图9示出在实例7的分化方案期间日均生物反应器培养基乳酸盐水平作为时间(分化天数)的函数。乳酸盐水平通过NOVAFLEX(NovaBiomedicalCorporation,Waltham,MA)确定。
图10示出在实例7的分化方案期间日均生物反应器培养基葡萄糖水平作为时间(分化天数)的天数。葡萄糖水平通过NOVAFLEX(NovaBiomedicalCorporation,Waltham,MA)确定。
图11示出对于包含与多能性相关联的选择基因的多能性阵列，根据实例7的方案分化的第0阶段第1天(即，接种后二十四小时)细胞的未分化基因表达(如通过qRT-PCR确定)。
图12示出对于包含与定形内胚层相关联的选择基因的定形内胚层(“DE”)阵列，第0阶段第1天(即，接种后二十四小时)细胞的未分化基因表达(如通过qRT-PCR确定)(参见实例7)。
图13示出对于包含与多能性相关联的选择基因的多能性阵列，第0阶段第3天(即，接种后七十二小时)细胞的未分化基因表达(如通过qRT-PCR确定)(参见实例7)。
图14示出对于包含与DE相关联的选择基因的DE阵列，第0阶段第3天(即，接种后七十二小时)细胞的未分化基因表达(如通过qRT-PCR确定)(参见实例7)。
图15示出对未分化第0阶段第3天(即，接种后七十二小时)细胞的CD9、CD184/CXCR4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81进行荧光激活细胞分类(FACS)的结果(参见实施例7)。结果也示于表8中。
图16示出根据实例7的方案分化的第0阶段第1天(即，接种后二十四小时)和第0阶段第3天(即，接种后七十二小时)细胞的选择基因的未分化基因表达(如通过qRT-PCR确定)。具体地讲，图16示出在定向分化之前在第0阶段过程期间，GATA4、GSC、MIXL1和T的基因表达适度增加，而GATA2的表达增加≥100倍。
图17示出对于包含与DE相关联的选择基因的DE阵列，根据实例7的方案分化的第0阶段第1天(即，接种后二十四小时)和第0阶段第3天(即，接种后七十二小时)细胞的未分化基因表达(如通过qRT-PCR确定)。具体地讲，图17示出在定向分化之前在第0阶段过程期间，CER1、FGF17和FGF4的表达增加≥100倍。
图18和图19示出根据实例7的方案分化的第1阶段第1天细胞的基因表达。图18示出对于包含与多能性相关联的选择基因的多能性阵列，第1阶段第1天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图19示出对于包含与DE相关联的选择基因的DE阵列，第1阶段第1天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图18和图19示出基因表达模式的显著改变，诸如FOXA2的表达增加约700倍，而CER1、EOMES、FGF17、FGF4、GATA4、GATA6、GSC、MIXL1和T的表达增加1000倍。
图20和图21示出根据实例7的方案分化的第1阶段第3天细胞的基因表达。图20示出对于包含与多能性相关联的选择基因的多能性阵列，第1阶段第3天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图21示出对于包含与DE相关联的选择基因的DE阵列，第1阶段第3天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。
图22示出对根据实例7的方案分化的第1阶段第3天细胞的CD9、CD184(也称为CXCR4)和CD99进行FACS的结果。观察到从分化引发时的CD9表达/CXCR4阴性多能细胞群(图15)到第1阶段结束时的同质CXCR4表达细胞群(98.3％细胞为CXCR4阳性，±1.9SD)(图22)的近似完全转变。
图23示出对于包含与DE相关联的选择基因的DE阵列，根据实例7的方案分化的第1阶段第3天；第2阶段第1天；以及第2阶段第3天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图23示出在第2阶段第1天和第3天时HNF4α和GATA6表达水平增加，而在第1阶段的第3天以高水平表达的基因(CXCR4、EOMES、FGF17、FGF4、MNX1、PRDM1、SOX17和VWF)在第2阶段结束时显示出表达减少。
图24示出根据实例7的方案分化的第2阶段第1天细胞和第2阶段第3天细胞的前肠基因AFP、PDX1和PROX1的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。如图24所示，这些基因的表达增加。
图25示出对根据实例7的方案分化的在第3阶段培养基(表7)中生长的第3阶段第3天细胞的PDX1、FOXA2、嗜铬粒蛋白、NKX2.2和SOX2进行FACS的结果。如图25所示，细胞表达与如通过PDX1和FOXA2表达所测量的内胚层胰腺谱系一致的标志物(90.9％±11.9SDPDX1阳性和99.2％±0.6SDFOXA2阳性)。
图26示出对于包含与第4阶段相关联的选择基因的第4阶段阵列，根据实例7的方案分化的第3阶段第1天和第3阶段第3天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图26示出这些细胞表现出增加水平的通常在胰腺中表达的基因(ARX、GAST、GCG、INS、ISL1、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PAX6、PTF1A和SST)的宿主。
图27示出对根据实例7的方案分化的第4阶段第3天细胞的NKX6.1、嗜铬粒蛋白(CHGA)、CDX2、SOX2、NKX2.2、PDX1、FOXA2和NEUROD进行FACS的结果。如图27所示，在第4阶段第3天时，细胞保持高水平的PDX1和FOXA2表达并且进一步发展与胰腺内分泌细胞(28.1％±12.5SD嗜铬粒蛋白阳性)和胰腺祖细胞(58.3％±9.7SDNKX6.1阳性)的混合物一致的表达模式。
图28示出对于包含与第4阶段相关联的选择基因的第4阶段阵列，根据实例7的方案分化的第3阶段第3天；第4阶段第1天以及第4阶段第3天细胞的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图28示出通常在胰腺中表达的基因(ARX、GAST、GCG、IAPP、INS、ISL1、MAFB、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PAX6、PTF1A，和SST)的表达水平增加。
图29示出对根据实例7的方案分化的第4阶段第3天细胞的NKX6.1、嗜铬粒蛋白(CHGA)、CDX2、SOX2、NKX2.2、PDX1、FOXA2和NEUROD进行FACS的平均结果。具体地讲，图29示出以3L规模从不同批接种材料产生的胰腺前体的平均FACS表达模式。
图30示出对根据实例7的方案分化的第4阶段第3天细胞的NKX6.1、嗜铬粒蛋白(CHGA)、CDX2、SOX2、NKX2.2、PDX1、FOXA2和NEUROD进行FACS的平均结果。在第4阶段第3天细胞的分化之前，细胞扩增以形成ISM，然后在第0阶段处在定制的内部培养基“IH3”或Essential8TM中的任一者中生长，这两者均补充有0.5％BSA。在IH3培养基中生长的细胞为“IH3-P生长细胞”，而在Essential8TM中生长的细胞为“EZ8生长细胞”。在不同培养基中生长的细胞之间没有观察到表达模式的显著差异。
图31示出对之前以不同pH水平在第0阶段中生长的第4阶段第3天细胞的NKX6.1、嗜铬粒蛋白(CHGA)、CDX2、SOX2、NKX2.2、PDX1、FOXA2和NEUROD进行FACS的平均结果(参见实例7)。在第4阶段第3天细胞分布中没有观察到显著改变。
图32比较了对以下细胞的NKX6.1、嗜铬粒蛋白(CHGA)、CDX2、SOX2、NKX2.2、PDX1、FOXA2和NEUROD进行FACS的结果：未用消泡剂C处理的第4阶段第3天细胞，以及用消泡剂C乳液(94ppm)处理的第4阶段第3天细胞(参见实例7)。观察到消泡剂C乳液(Sigma目录号A8011)不会影响第4阶段第3天细胞的分布。
图33至图35示出根据实例8的方案分化的细胞的选择基因的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图33示出在分化开始之前二十四小时，细胞的选择基因的基因表达(如通过qRT-PCR确定)(参见实例8)。如图33所示，来自生物反应器的细胞保持基因多能性特征的表达(POU5F1、NANOG、SOX2和ZFP42)并且显示出对基因分化特征的最小诱导或没有诱导(AFP和FOXA2：表达增加<50倍；FOXD3、GATA2、GATA4、GSC、HAND2、MIXL1和T：表达增加<10倍)。图34示出在分化开始之后二十四小时，细胞的选择基因的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。图35示出在分化开始之后七十二小时，细胞的选择基因的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。
图36(a)至图36(e)示出根据实例8的方案从第2阶段到第3阶段和第4阶段分化的细胞的选择基因的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。具体地讲，这些图示出细胞在第2阶段第1天；第2阶段第2天；第2阶段第3天；第3阶段第3天以及第4阶段第1天的基因表达，具体取决于基因。图36(a)示出AFP、ATOH1和CDX2的基因表达。图36(b)示出GAST、HAND1、HHEX和HNF4a的基因表达。图36(c)示出NKX2.2、NKX6.1、OSR1和PDX1的基因表达。图36(d)示出PROX1、PFT1a、SOX17和SOX2的基因表达。图36(e)示出SOX9的基因表达。该数据显示为与未分化的H1(WA01)hES细胞相比的表达的差异(基线表达为1)。
图37示出根据实例8的方案分化的第4阶段第3天细胞的选择基因的基因表达(如通过qRT-PCR确定)。如图37所示，在第3阶段第3天的分化结束时，细胞已分化成胰腺祖细胞，与未分化的H1人胚胎干细胞相比，该胰腺祖细胞的特征在于：高表达水平的PDX1(>1×106倍诱导)和其他胰腺基因(>1000倍的ARX、GCG、GAST、INS、ISL、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PTF1a和SST的诱导)以及OCT4/POU5F1表达的接近总损耗。
图38示出根据实例8的方案分化期间的每日细胞计数。具体地讲，图38示出细胞密度作为处理天数的函数。图38示出在pH6.8和7.2下进行的两个反应器运行(PRD1205和PRD1207)的分化方案的细胞计数。作为比较，还示出细胞漂移的细胞计数。
图39(a)至图39(d)示出根据实例8的方案分化并且植入到SCID-Bg小鼠中的第4阶段第3天细胞的体内生物活性。细胞通过TheraCyteTM装置在肾包膜下皮下植入，或者在超低附着培养皿中温育之后植入。在移植物植入之后每四周监测小鼠的血糖水平和C-肽水平。图39(a)示出在TheraCyteTM装置中植入5×106个或10×106个第4阶段第3天细胞之后C-肽水平作为时间的函数。图39(b)示出在TheraCyteTM装置中植入5×106个或10×106个第4阶段第3天细胞之后动物的非空腹血糖水平。用STZ处理图39(b)中的小鼠以在植入之前消除宿主β-细胞功能。图39(c)示出在TheraCyteTM装置中植入之前冻存的第4阶段第3天细胞之后产生的C-肽水平作为时间(植入后数星期)的函数。图39(d)比较了由下述细胞的肾移植物处理的小鼠的C-肽水平：从未冻存/新鲜的第4阶段第3天细胞，或者在解冻之后立即(D0)植入或在解冻之后1天(D1)植入的冻存的第4阶段第3天细胞。
图40A至图40D示出根据实例9的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图，所述细胞在第1阶段第1天用以下各项进行处理：MCX化合物和GDF-8(图40A)；仅MCX(图40B)；WNT3A和活化素A(图40C)；以及仅WNT3A(图40D)。这些图指示，在悬浮培养物中，在不存在TGF-β家族成员的情况下在分化的第一天添加3μMMCX会生成相当于在第一天用3μMMCX加上100ng/mlGDF-8或20ng/mlWNT-3a加上100ng/ml活化素A处理细胞时所获得的水平的定形内胚层。
图41A至图41D示出根据实例10的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图，所述细胞在第1阶段第1天用各种量的MCX处理。具体地讲，在第1阶段第1天用以下各项处理细胞：4μMMCX(图41A)；3μMMCX(图41B)；2μMMCX(图41C)；以及1.5μMMCX(图41D)。
图42A和图42B示出根据实例11的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图。具体地讲，这些图示出了悬浮培养物中培养基更换频率的作用。图42A示出根据实例10的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图，其中在第1阶段进行培养基完全更换。图42B示出根据实例10的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图，其中在第3天不进行培养基更换。数据表明，在悬浮培养***中，在分化的第三天接受培养基更换的培养物(图42A)产生定型内胚层，其具有可与在第三天不接受培养基更换的培养物(图42B)相比的效率。
图43A和图43B示出根据实例12的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图。具体地，这些图示出了悬浮培养物中的GlutamaxTM的作用。在第1阶段在补充有1XGlutamaxTM(图43A)或不含GlutamaxTM或任何谷氨酰胺(0MGlutamaxTM)(图43B)的培养基中培养细胞。数据表明，在悬浮培养***中，添加GlutamaxTM似乎不影响产生定形内胚层的效率。
图44A至图44D示出各种量的碳酸氢钠对根据实例13的方案分化的细胞的影响。图44A和图44B示出根据实例13的方案分化三天的细胞的CXCR4、CD99和CD9的FACS图，其中在第1阶段添加3.64g/l(图44A)或2.49g/l(图44B)。图44C和图44D示出根据实例13的方案分化三天的细胞的相差显微图，其中在第1阶段添加3.64g/l(图44C)或2.49g/l(图44D)。
图45示出细胞密度的每日细胞计数作为根据实例14的方案分化的细胞的分化的函数。使用基于图像的细胞仪获得细胞计数。
图46示出在实施例14的分化方案期间日均生物反应器培养基pH水平作为时间(分化天数)的函数。pH水平通过NOVAFLEX(NovaBiomedicalCorporation,Waltham,MA)确定。
图47示出在实例14的分化方案期间日均生物反应器培养基葡萄糖水平作为时间(分化天数)的函数。葡萄糖水平通过NOVAFLEX(NovaBiomedicalCorporation,Waltham,MA)确定。
图48示出在实例14的分化方案期间日均生物反应器培养基乳酸盐水平作为时间(分化天数)的函数。乳酸盐水平通过NOVAFLEX(NovaBiomedicalCorporation,Waltham,MA)确定。
图49示出对于包含与多能性相关联的选择基因的多能性阵列，根据实例14的方案分化的第0阶段第1天至第3天以及第1阶段第1天至第3天细胞的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图50示出对于包含与DE相关联的选择基因的DE阵列，根据实例14的方案分化的第0阶段第1至第3天；第1阶段第1天至第3天以及第2阶段第1天至第3天细胞的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。
图51示出对根据实例14的方案分化之前的第0阶段细胞的与多能性相关联的标志物(CD184/CXCR4、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)进行FACS的结果。具体地讲，图51示出与多能性相关联的标志物的高表达。
图52示出根据实例14的方案在第1阶段结束时分化的细胞的定形内胚层标志物CXCR4、CD99和CD9的FACS图。
图53示出根据实例14的方案分化的第2阶段第1天；第2阶段第2天以及第2阶段第3天细胞的GAPDH、AFP、HHEX、HNF4α、PDX1和PROX1的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图53示出前肠基因(AFP、HHEX、PDX1和PROX1)的表达增加。
图54示出根据实例14的方案分化的第2阶段，第1天至第3天以及第3阶段，第1天至第3天细胞的GAPDH、AFP、CDX2、GAST、HNF4A、NKX2-2、OSR1,PDX1和PFT1A的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。如图54所示，PDX1的表达从第2阶段第3天结束时超过对照12,000倍到第3阶段第3天结束时超过对照739,000倍增加了60倍。
图55示出根据实例14的方案分化的第3阶段第1天至第3天以及第4阶段第1天至第3天细胞的某些基因的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。具体地讲，图55的顶部图示出GAPDH、AFP、ALB、ARX、CDX2、CHGA、GAST、GCG、IAAP、INS、ISL1和MAFB的基因表达。图55的底部图示出MAFB、MUCS、NEUROD1、NEUROG3、NKX2-2、NKX6-1、PAX4、PDX1、POUSF1、PTF1A、SST和ZlC1的基因表达。
图56示出了根据实例14的方案分化的细胞的最终阶段显微图。在图56中可以看到，在第0阶段以及第1阶段至第4阶段的分化结束时的细胞群集的代表性显微图(4X)。
图57至图80示出在以下基因分化0小时、6小时、24小时、30小时、48小时和72小时后根据实例15的方案的各种实施例分化的细胞的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)：AFP(图57)、CD99(图58)、CD9(图59)、CDH1(图60)、CDH2(图61)、CDX2(图62)、CER1(图63)、CXCR4(图64)、FGF17(图65)、FGF4(图66)、FOXA(图67)、GADPH(图68)、GATA4(图69)、GATA6(图70)、GSC(图71)、KIT(图72)、MIXL1(图73)、MNX1(图74)、NANOG(图75)、OTX2(图76)、POUF5F1(图77)、SOX17(图78)、SOX7(图79)和T(图80)。
图81示出根据实施例15的方案的各种实施方案分化6小时、24小时、30小时、48小时和72小时之后的细胞的G0/G1细胞周期中的细胞百分比。具体地讲，图81示出在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理的群集的结果：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。
图82示出EDU处理对根据实例15的方案分化的细胞群集的作用。图82的左图示出根据实施例15的方案的各种实施方案分化0小时、6小时、24小时、30小时、48小时和72小时之后的细胞的G2/M细胞周期中的细胞百分比。具体地讲，左图示出在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理的群集的结果：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。在一组数据中，这些群集还用EDU处理。图82的右图示出根据实例15的方案的各种实施例分化0小时、6小时、24小时、30小时、48小时和72小时呈EDU阳性的细胞百分比。
图83示出在实例15的方案中使用的一般工作参数。
图84示出根据实例15的方案的各种实施例分化6小时、24小时、30小时、48小时和72小时之后的细胞的EDU结合的量。具体地讲，图84示出在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理的EDU温育细胞群集的结果：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。
图85示出根据实施例15的方案的各种实施方案分化6小时、24小时、30小时、48小时和72小时之后的细胞的G0/G1细胞周期中的细胞百分比。具体地讲，图85示出在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理的群集的结果：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。
图86示出根据实施例15的方案的各种实施方案分化6小时、24小时、30小时、48小时和72小时之后的细胞的S相细胞周期中的细胞百分比。具体地讲，图86示出在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理的群集的结果：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。
图87示出根据实施例15的方案的各种实施方案分化数小时、6小时、24小时、30小时、48小时和72小时之后的细胞的S相细胞周期中的细胞百分比。具体地讲，图87示出在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理的群集的结果：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。
图88A至图88E示出在分化0小时、6小时、24小时、30小时、48小时和72小时后根据实例15的方案的各种实施例分化的细胞的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88A示出CD99、CD9、CDH1和CDH2的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88A示出CXD2、CER1、CXCR4以及FGF17的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88C示出FGF4、FOXA、GATA4和GATA6的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88D示出GSC、KIT、MIXL1和MNX1的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88E示出NANOG、OTX2、POUF5F1和SOX17的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88F示出SOX7和T的基因表达(由qRT-PCR确定为与未分化细胞相比的倍数表达)。图88A至图88F的基本数据示于图58至图67以及图69至图80中。
图89示出根据实例16的方案在外胚层分化培养基中培养的多能细胞的基因表达模式(如通过qRT-PCR确定)。如图89所示，细胞朝向神经细胞谱系分化。具体地讲，图89的左图示出由脐带组织细胞(UTC)产生的诱导多能干细胞系的基因表达模式。图89的右图示出H1hES细胞系的WB0106亚克隆的基因表达模式。
图90示出根据实例16的方案在中胚层分化培养基中培养的多能细胞的基因表达模式(如通过qRT-PCR确定)。如图90所示，细胞朝向心脏细胞谱系分化。具体地讲，图90的左图示出由脐带组织细胞(UTC)产生的诱导多能干细胞系的基因表达模式。图90的右图示出H1hES细胞系的WB0106亚克隆的基因表达模式。
图91示出根据实例16的方案在外胚层分化培养基中培养的多能细胞的基因表达模式(如通过qRT-PCR确定)。如图91所示，细胞朝向神经细胞谱系分化。具体地讲，图91的左图示出由脐带组织细胞(UTC)产生的诱导多能干细胞系的基因表达模式。图91的右图示出H1hES细胞系的WB0106亚克隆的基因表达模式。
图92示出根据实例16的方案在外胚层分化培养基中培养三天的多能细胞的PAX6、SOX2和POU5F1/OCT4的基因表达模式(如通过FACS确定)。具体地讲，图92的左图示出由脐带组织细胞(UTC)产生的诱导多能干细胞系的PAX6、SOX2和POU5F1/OCT4的表达模式。图92的右图示出H1hES细胞系的WB0106亚克隆的PAX6、SOX2和POU5F1/OCT4的蛋白质表达模式。
图93示出根据实例16的方案在中胚层分化培养基中培养的多能细胞的基因表达模式(如通过qRT-PCR确定)。如图93所示，细胞朝向心脏细胞谱系分化。具体地讲，图93的左图示出由脐带组织细胞(UTC)产生的诱导多能干细胞系的基因表达模式。图93的右图示出H1hES细胞系的WB0106亚克隆的基因表达模式。
图94示出根据实例16的方案在中胚层分化培养基中分化的细胞的显微图。如图94所示，细胞朝向心脏细胞谱系分化。具体地讲，图94的左图示出在分化的第3天、第5天和第10天的H1hES细胞系的WB0106亚克隆的细胞的显微图。图94的右图示出在分化10天之后，由脐带组织细胞(UTCiPSC)产生的诱导多能干细胞系的显微图。
图95示出根据实例16的方案在外胚层分化培养基中分化的细胞的显微图。如图95所示，细胞朝向神经细胞谱系分化。具体地讲，图95的左图示出在分化的第3天、第5天和第10天的H1hES细胞系的WB0106亚克隆的细胞的显微图。图95的右图示出在分化10天之后，由脐带组织细胞(UTCiPCS)产生的诱导多能干细胞系的显微图。
具体实施方式
本申请涉及制备胚胎干细胞和其他多能细胞，该多能细胞保持聚集细胞群集的多能性以便分化成内胚层祖细胞、胰腺内分泌细胞、中胚层细胞或外胚层细胞。为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于其在体外分化成来自多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基本上至大部分(如果不是所有的话)组织。
干细胞是根据其发育潜能分类的。“细胞培养”或“培养”一般是指从活生物体取得并且在受控的条件下生长(“培养”或“被培养”)的细胞。原代细胞培养是在第一传代培养之前培养从生物体直接取得的细胞、组织或器官。当在有利于细胞生长和/或***的一者或两者条件下，将细胞放置在生长培养基中时，它们在培养中扩增产生更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，有时通过细胞数目翻倍所需的时间量(称为倍增时间)来测量细胞增殖率。
如本文所用，“扩增”是通过培养增加多能干细胞的数目的过程，诸如增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、75％、90％、100％、200％、500％、1000％或更多，以及这些百分比内的水平。应当理解，可从单个多能干细胞获得的多能干细胞的数目取决于多能干细胞的增殖能力。多能干细胞的增殖能力可以通过细胞的倍增时间(即，细胞在培养中经历有丝***所需的时间)，以及多能干细胞可保持在未分化状态中的周期(其等于传代数目乘以每次传代之间的天数)来计算。
分化是这样一个过程，通过该过程，非特化的(“非定向的”)或少特化的细胞可获得特化细胞(诸如神经细胞或肌细胞)的特征。分化的细胞或分化诱导的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用于分化过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型亚群，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。“去分化”指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。本文所用的“细胞谱系”限定细胞的遗传，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传方案内。谱系特异性标志物指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，并且可用来评估未定向细胞向所关注谱系的分化。
本文所用的“标志物”是在所关注的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在该语境中，差异表达意指与未分化细胞相比阳性标志物的水平升高并且阴性标志物的水平下降。与其他细胞相比，标志物核酸或多肽在所关注细胞中的可检测水平充分地较高或较低，使得可使用本领域已知的多种方法中的任何一种将所关注细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，当在细胞中检测到特定标志物时，细胞“对于特定标志物是阳性的”或是“阳性的”。相似地，当在细胞中未充分检测到特定标志物时，细胞“对于特定标志物是阴性的”或是“阴性的”。具体地讲，用FACS检测到的阳性通常大于2％，而用FACS检测到的阴性阈值通常小于1％。用PCR检测到的阳性通常小于34个循环(Cts)；而用PCR检测到的阴性通常大于34.5个循环。
如本文所用，“细胞密度”和“接种密度”在本文可互换使用，并且是指每单位面积的固体或半固体平坦或弯曲培养基所接种的细胞的数量。
如本文所用，“悬浮培养物”是指悬浮在培养基中而不是贴壁到表面上的细胞、单个细胞或群集的培养物。
如本文所用，“无血清”是指不含人或动物血清。因此，无血清培养基不包含血清或血清的部分。
在复制将多能干细胞分化到细胞培养物中的功能性胰腺内分泌细胞中的尝试中，分化过程通常被视为通过多个连续阶段进行。如本文所用，各个阶段由培养时间，以及本文所包含的实例中列出的试剂限定。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下述标志物中的至少一种：FOXA2(也称为肝细胞核因子3-β(HNF3β))、GATA4、GATA6、MNX1、SOX17、CXCR4、Cerberus、OTX2、brachyury、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。定形内胚层细胞的特征性标志物包括CXCR4、FOXA2和SOX17。因此，定形内胚层细胞可通过其对CXCR4、FOXA2和SOX17的表达来表征。此外，取决于允许细胞保持在第1阶段的时长，可观察到HNF4α的增长。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽。除了这些激素以外，胰腺内分泌细胞特征性标志物还包括以下一种或多种标志物：NGN3、NeuroD1、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2和PAX6。表达β细胞的特征性标志物的胰腺内分泌细胞可通过其对胰岛素以及至少一种下列转录因子的表达来表征：PDX1、NKX2.2、NKX6.1、NeuroD1、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。
在本文中可互换使用的是“d1”、“d1”和“第1天”；“d2”、“d2”和“第2天”；“d3”、“d3”和“第3天”等。这些数字字母组合是指在本专利申请的逐步分化方案过程中的不同阶段中温育的具体天数。
“葡萄糖”和“D-葡萄糖”在本文中可互换使用，并且指右旋糖，在自然界中通常发现的糖。
在本文中可互换使用的是“NeuroD”和“NeuroD1”，其鉴定在胰腺内分泌祖细胞中表达的蛋白质及其编码基因。
“LDN”和“LDN-193189”是指((6-(4-(2-(哌啶-1-基)乙氧基)苯基)-3-(吡啶-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶，盐酸盐；DM-3189))，一种可以商标STEMOLECULETM购自Stemgent,Inc.,Cambridge,MA,USA的BMP受体抑制剂。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞可表达一种或多种指定的TRA-1-60和TRA-1-81抗体(Thomson等人，1998，Science282:1145-1147)。多能干细胞在体外的分化导致TRA-1-60和TRA-1-81表达的丧失。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，这种活性可以通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用Red作为底物显色来检测，如制造商(VectorLaboratories,Inc.,Burlingame,CA)描述的那样。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT，这通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一理想表型是分化成所有三个胚层即内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞的潜能。可以例如通过如下方式来确认干细胞的多能性：将细胞注射入重症联合免疫缺陷(“SCID”)小鼠中，使用4％的多聚甲醛固定形成的畸胎瘤，然后对其进行组织学检测，找出来自该三个胚层的细胞类型的证据。作为另一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体中与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
增殖的多能干细胞系可用标准G显带技术进行核型分析并与公开的相应灵长类物种的核型相比较。希望获得具有“正常核型”(其意指细胞是整倍体的)的细胞，其中所有人染色体都存在并且无明显的改变。多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂布的容器容易地扩增。另选地，可使用与成分确定的培养基例如培养基(StemCellTechnologies,Vancouver,Canada)组合的化学成分确定的表面来执行常规细胞扩增。
根据本发明的一些实施例的方法在悬浮培养物中培养通过以允许细胞存活和增殖，但限制分化的细胞密度在培养容器中接种多能干细胞而实现。通常，使用维持细胞未分化的接种密度。应当理解，虽然可接种干细胞的单细胞悬液，但小的细胞群集可能是有利的。
为了在悬浮培养时提供足够且持续供给营养物质和生长因子的多能干细胞，可每天或在预定的时间表，诸如每1-5天替换或补充培养基。大的多能干细胞群集可导致细胞分化，因此可采取措施以避免大的多能干细胞聚集体。根据本发明的一些实施方案，所形成的多能干细胞群集例如每2天至7天被解离，并且单个细胞或小细胞团块被分到另外的培养容器中(即，传代)，或者保持在相同的培养容器中并且用置换培养基或另外的培养基处理。
包括由离心产生的多能干细胞粒料的大多能干细胞团块可经受酶消化和/或机械解离中的一者或两者。多能干细胞团块的酶消化可通过使团块经受酶，诸如IV型胶原酶、分散酶或的处理来进行。大的多能干细胞团块的机械解离可使用设计成使团块破裂成预定尺寸的装置来进行。除此之外或作为另一种选择，机械解离可使用针或移液管手动进行。
用于在悬浮液中根据本发明的一些实施例的方法培养多能干细胞的培养容器可为任何组织培养容器(例如，具有适于培养多能干细胞的纯度级)，该培养容器具有被设计成使得在其中培养的多能干细胞不能贴壁或附接到此表面上的内表面(例如，未用组织培养物处理的容器，用于防止附接或贴壁到表面)。优选地，为了获得可扩展培养物，使用控制培养***(优选地为计算机控制的培养***)来实现根据本发明的一些实施例的培养，在控制培养***中使用合适的装置自动监测和控制培养参数，诸如温度、搅动、pH和氧气。一旦确定所需的培养参数，***可被设置为根据需要自动调整培养参数以增强多能干细胞扩增和分化。
可在动态条件下(即，在多能干细胞在悬浮培养时经受持续运动的条件下，例如搅拌悬浮培养***)或在非动态条件(即，静态培养)下培养多能干细胞，同时保留其增殖能力、多能性能力以及在多次传代中的染色体核型稳定性。
对于多能干细胞的非动态培养，多能干细胞可以在以下项中培养：培养皿、T-烧瓶、(CorningIncorporated,Corning,NY)、(CorningIncorporated,Corning,NY)或涂覆或未涂覆的细胞工厂(NUNCTMCellFactoryTMSystemsThermoFisherScientific,Inc.,Pittsburgh,PA)。对于多能干细胞的动态培养，可在合适的容器(诸如转瓶或锥形瓶、不锈钢、玻璃或单次使用塑料振动器或搅拌罐容器)中培养多能干细胞。培养容器可连接到控制单元，从而呈现控制培养***。可连续或间歇地搅动培养容器(例如，转瓶或锥形瓶)。优选地，充分搅动培养容器以保持多能干细胞悬浮。
多能干细胞可在提供足够营养物质和环境刺激以促进生长和扩增的任何培养基中培养。合适的培养基包括E8TM、IH3和或可定期更换培养基以更新营养物质供应并移除细胞副产物。根据本发明的一些实施例，培养基每天更换。
多能干细胞的来源
任何多能干细胞均可用于本发明的方法中。可使用的多能干细胞的示例性类型包括来源于妊娠后形成的组织的建立的多能细胞系，包括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常但不一定是在约10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干细胞(hESC)系或人胚胎干细胞，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCellResearchInstitute,Madison,WI,USA)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群的细胞。
另外合适的是诱导多能细胞(IPS)或重新编程的多能细胞，其可使用多种多能相关的转录因子的被迫表达而来源于成人体细胞，所述转录因子诸如OCT4、NANOG、Sox2、KLF4和ZFP42(AnnuRevGenomicsHumGenet2011,12:165-185)。在本发明的方法中使用的人胚胎干细胞也可如由Thomson等人描述的进行制备(美国专利5,843,780；Science,1998,282:1145-1147；CurrTopDevBiol1998,38:133-165；ProcNatlAcadSciU.S.A.1995,92:7844-7848)。同样合适的是突变的人胚胎干细胞系，诸如例如BG01v(BresaGen,Athens,Ga.)，或源于成人体细胞的细胞，诸如例如在Takahashi等人，Cell131:1-12(2007)中公开的细胞。适用于本发明的多能干细胞可以根据在以下文献中描述的方法来获得：Li等人(CellStemCell4:16-19,2009)；Maherali等人(CellStemCell1:55-70,2007)；Stadtfeld等人(CellStemCell2:230-240)；Nakagawa等人(NatureBiotechnology26:101-106,2008)；Takahashi等人(Cell131:861-872,2007)；以及美国专利申请公布2011-0104805。多能干细胞的其他来源包括诱导的多能细胞(IPS,Cell,126(4):663-676)。适于在本发明的方法中使用的细胞的其他来源包括人脐带组织来源细胞、人羊水来源细胞、人胎盘来源细胞，以及人孤雌生殖体。在一个实施方案中，脐带组织来源的细胞可以使用美国专利7,510,873的方法来获得，由于该专利涉及细胞的分离和表征，其公开内容全文以引用方式并入本文。在另一个实施例中，胎盘组织来源细胞可使用美国专利申请公布2005/0058631的方法来获得，由于该专利涉及细胞的分离和表征，其公开内容全文以引用方式并入本文。在另一个实施方案中，羊水来源的细胞可使用美国专利申请公布号2007/0122903的方法来获得，由于该专利涉及细胞的分离和表征，其公开内容全文以引用方式并入本文。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且多能干细胞的其他特征有待继续鉴定。多能干细胞标志物包括例如一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14种或全部)下列标志物的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81。在一个实施方案中，适于在本发明的方法中使用的多能干细胞表达CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的一种或多种(例如，1、2、3种或全部)，但缺少如通过流式细胞术检测到的分化CXCR4(也称为CD184)的标记物的表达。在另一个实施例中，适于在本发明的方法中使用的多能干细胞表达由RT-PCR检测到的CD9、NANOG和POU5F1/OCT4中的一种或多种(例如，1、2种或全部)。
示例性的多能干细胞包括人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)，以及人胚胎干细胞系SA002(Cellartis,Sweden)。在一个实施例中，多能干细胞是人胚胎干细胞，例如H1hES细胞。在另选实施例中，使用非胚胎来源的多能干细胞。
由多能干细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞
多能干细胞的扩增
在下述实施例的一些中，本发明涉及分离和培养干细胞，具体地讲，涉及培养干细胞群集，其保持动态悬浮培养***的多能性。多能细胞群集可被分化以产生功能性β细胞。
用于本发明的方法中的多能干细胞在朝向所需终点分化之前优选地在动态悬浮培养物中扩增。有利的是，已经发现多能干细胞可作为悬浮液中的细胞群集在合适的培养基中培养和扩增，而不损失多能性。这种培养可在动态悬浮培养***中进行，其中细胞或细胞群集保持充分地移动以防止多能性损失。可用的动态悬浮培养***包括配备有用于搅动培养内容物的装置的***，诸如通过搅拌、摇动、再循环或使气体鼓泡通过培养基来进行搅动。只要保持足够的细胞群集运动以促进扩增并防止过早分化，这种搅动便可为间歇的或连续的。优选地，搅动包括诸如通过以特定速率旋转的叶轮来进行连续搅拌。叶轮可具有圆形底部或平坦底部。叶轮的搅拌速率应使得群集保持在悬浮液中并使沉降最小化。另外，叶轮叶片的角度可被调整成有助于细胞和群集的向上运动以避免沉降。此外，叶轮类型、角度和旋转速率可全部被协调成使得细胞和群集位于呈现为均匀胶态悬浮液的物质中。
可通过将静态培养的干细胞转移到适当的动态培养***(诸如一次性塑料、可重复使用塑料、不锈钢或玻璃容器，例如转瓶或锥形瓶)来实现多能干细胞群集的悬浮培养和扩增。例如，在贴壁静态环境(即，板或培养皿表面)中培养的干细胞可首选通过用螯合剂或酶处理来从表面移除。合适的酶包括但不限于，I型胶原酶、(SigmaAldrichLLC,St.Louis,MO)或以商品名(SigmaAldrichLLC,St.Louis,MO)销售的可商购的市售配方。
是包含胶原蛋白酶和蛋白水解酶的细胞分离溶液(从甲壳类动物中分离)，并且不包含哺乳动物衍生产物或细菌衍生产物。因此，在一个实施方案中，酶为胶原蛋白酶和/或蛋白水解酶，或者包含胶原蛋白酶和蛋白水解酶的细胞分离溶液。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施例中，用酶或螯合剂温育多能干细胞培养物，优选地直到菌落边缘开始卷曲和提升，但在菌落从培养物表面完全分离之前。在一个实施例中，在室温下温育细胞培养物。在一个实施例中，在高于20℃、高于25℃、高于30℃或高于35℃的温度下，例如在约20℃和约40℃之间、约25℃和约40℃之间、约30℃和约40℃之间的温度下，例如在约37℃下温育细胞。在一个实施例中，将细胞温育至少约1分钟、至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟，例如介于约1分钟和约30分钟之间、约5分钟和约30分钟之间、约10分钟和约25分钟之间、约15分钟和约25分钟之间，例如约20分钟。在一个实施例中，该方法涉及在处理后从细胞培养物中移除酶或螯合剂的步骤。在一个实施例中，在移除酶或螯合剂之后，将细胞培养物洗涤一次或两次或更多次。在一个实施例中，用适当的培养基，诸如(StemCellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)洗涤细胞培养物。在一个实施例中，提供了Rho-激酶抑制剂(例如，Y-27632，Axxora目录号ALX-270-333，SanDiego,CA)。Rho-激酶抑制剂的浓度可为约1至约100μM、约1至90μM、约1至约80μM、约1至约70μM、约1至约60μM、约1至约50μM、约1至约40μM、约1至约30μM、约1至约20μM、约1至约15μM、约1至约10μM、或约10μM。在一个实施例中，添加至少1μM、至少5μM或至少10μM的Rho-激酶抑制剂。可用刮刀或橡胶淀帚从静态培养***的表面提升细胞。可使用玻璃移液管或其他合适的装置将培养基和细胞转移到动态培养***。在优选的实施例中，每日更换动态培养***中的培养基。
在一个实施例中，本发明提供了在三维悬浮培养物中培养和扩增多能干细胞的方法。具体地讲，该方法提供了通过形成这些多能干细胞的聚集细胞群集来培养和扩增多能干细胞。细胞群集可通过在培养细胞之前用酶(例如，中性蛋白酶，例如分散酶)或螯合剂处理多能干细胞群集而形成。可优选地在搅拌或摇动悬浮培养***中培养细胞。在一个实施例中，本发明还提供由多能干细胞的此类群集形成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
优选地，细胞群集为聚集的多能干细胞。聚集的干细胞表达一个或多个多能性标记物，例如标记物CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81中的一个或多个(例如，1个、2个、3个或全部)，但缺少对一个或多个分化标记物的表达，例如缺少对CXCR4的表达。
在一个实施方案中，聚集的干细胞表达多能性标记物CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，但缺少对分化标记物CXCR4的表达。
一个实施例为在悬浮培养物中将多能干细胞培养为细胞群集的方法。细胞群集为在动态搅拌或摇动悬浮培养***中培养的聚集多能干细胞。可将酶(诸如中性蛋白酶，例如分散酶)用作细胞提升剂将细胞群集从平面贴壁培养物转移到搅拌或摇动悬浮培养***。示例性合适的酶包括但不限于IV型胶原酶、分散酶或细胞在搅拌或摇动悬浮培养***(具体地讲，搅拌悬浮培养***)中保持多能性。
本发明的另一个实施方案为在悬浮培养物中将多能干细胞培养为细胞群集的方法，其中细胞群集为使用螯合剂(例如EDTA)从平面贴壁培养物中转移并在搅拌或摇动悬浮培养***中培养的聚集多能干细胞。细胞群集在搅拌或摇动悬浮培养***(具体地讲，搅拌(动态搅动)悬浮培养***)中保持多能性。
本发明的另一个实施方案为在悬浮培养物中将多能干细胞培养为细胞群集的方法，其中细胞群集为使用酶从平面贴壁培养物中转移并在搅拌或摇动悬浮培养***中培养的聚集多能干细胞。细胞群集在动态搅动悬浮培养***中保持多能性。
本发明的细胞群集可分化成中胚层细胞诸如心脏细胞，外胚层细胞诸如神经细胞、单激素阳性细胞或胰腺内胚层细胞。该方法还可包括分化，例如将胰腺内胚层细胞分化成胰腺前体细胞和胰腺激素表达细胞。在另一个实施例中，胰腺前体细胞通过表达β细胞转录因子PDX1和NKX6.1来表征。
在一个实施例中，分化步骤在悬浮培养***中至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少144小时、至少168小时、至少196小时或更多个小时之后，优选地在约48小时至72约小时之后进行。可使用培养基组分的逐步发展诸如实例中所描述的来进行分化(例如，参见表A以及表1a和表1c)。
在优选的实施方案中，三维细胞群集通过以下步骤产生：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；将多能干细胞扩增成聚集细胞群集；并使用酶或螯合剂将多能干细胞群集从平面贴壁培养物转移到动态悬浮培养物。
另外优选的实施方案为通过以下步骤在动态搅动悬浮培养***中扩增并分化多能干细胞的方法：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；将多能干细胞扩增成聚集细胞群集；并使用酶或螯合剂将多能干细胞群集从平面贴壁培养物转移到动态悬浮培养物；并且在动态搅动悬浮培养***中分化多能细胞群集以产生胰腺前体细胞群。
另一个实施例为包含由扩增多能干细胞群集的悬浮液制备的分化干细胞的可移植干细胞来源的细胞产物，所述扩增多能干细胞群集分化成胰腺前体细胞。更具体地，可移植干细胞来源的产物通过以下步骤而产生：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；将多能干细胞扩增成聚集细胞群集；并且使用酶或螯合剂将多能干细胞群集从平面贴壁培养物转移到动态悬浮培养物；并且在动态搅动悬浮培养***中分化多能细胞群集。可移植干细胞来源的细胞产物优选地用于治疗糖尿病。
在另一个实施例中，该方法包括移植到糖尿病动物体内，以在体内进一步成熟为功能性胰腺内分泌细胞。
另一个实施方案为在悬浮培养***中扩增和分化多能干细胞的方法，该方法包括以下步骤：使多能干细胞在平面贴壁培养物中生长；使用酶从平面贴壁培养物移除多能干细胞；将多能干细胞贴壁到静态培养物中的微载体上；在动态搅动悬浮培养***中扩增多能细胞；并且在动态搅动悬浮培养***中分化多能细胞以产生胰腺前体细胞群。
微载体可为本领域中已知的用于贴壁细胞的任何形式，具体地讲，微载体可为微珠。微载体可由天然来源的材料或合成来源的材料构成。微载体的例子包括基于胶原蛋白的微载体、基于葡聚糖的微载体或基于纤维素的微载体。例如，微载体珠可为具有附接到表面以向微载体提供正电荷表面的阳离子三甲基铵的改性聚苯乙烯珠。微珠直径可在约90μm至约200μm、或者约100μm至约190μm、或者约110μm至约180μm、或者约125μm至175μm的直径范围内。微载体珠还可为化学地耦合到交联葡聚糖基质的变性胶原蛋白的薄层。微载体珠可为玻璃、陶瓷、聚合物(诸如聚苯乙烯)、或金属。另外，微载体可为未涂布的，或者诸如用硅或诸如胶原蛋白的蛋白质涂布的。在又一个方面，微载体可由增强细胞与微载体的结合并增强细胞从微载体脱离的化合物组成或涂有所述化合物，所述化合物包括但不限于透明质酸钠、聚(单硬脂酰甘油酯共-丁二酸)、聚-D,L-丙交酯-共-乙交酯、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、赖氨酸、n-异丙基丙烯酰胺、玻连蛋白以及胶原蛋白。例子还包括具有微电流的微载体，诸如具有产生低水平生物相关电力的锌和铜颗粒电偶的微载体；或顺磁性的微载体，诸如顺磁性藻酸钙微载体。
在一些实施例中，胰腺内胚层细胞群通过多能细胞群集的逐步分化获得。在一些实施例中，多能细胞是人胚胎多能干细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。
在一些实施例中，本发明涉及逐步分化多能细胞的方法，该方法包括在动态悬浮培养物中培养第3-5阶段细胞。在一些实施例中，将所产生的胰腺内胚层群移植到糖尿病动物体内，以在体内进一步成熟为功能性胰腺内分泌细胞。本发明还提供了用于在本发明的方法中使用的***或试剂盒。
本发明还提供通过本发明的方法可获得的细胞或细胞群。本发明还提供已通过本发明的方法获得的细胞或细胞群。
本发明提供治疗方法。具体地讲，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。
本发明还提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗方法的细胞或细胞群。具体地讲，本发明提供可通过本发明的方法获得或已通过本发明的方法获得以用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法的细胞或细胞群。糖尿病可为1型糖尿病或2型糖尿病。
在一个实施例中，治疗方法包括将已通过本发明的方法获得或可通过本发明的方法获得的细胞植入患者体内。
在一个实施例中，治疗方法包括使多能干细胞在体外分化成第1阶段第2阶段第3阶段第4阶段或第5阶段细胞，例如如本文所述，以及将分化的细胞植入到患者体内。
在一个实施例中，该方法还包括在使多能干细胞分化的步骤之前，例如如本文所述的培养多能干细胞的步骤。
在一个实施例中，该方法还包括植入步骤之后的在体内分化细胞的步骤。
在一个实施例中，患者是哺乳动物，优选地是人类。
在一个实施例中，可将这些细胞作为分散的细胞植入，或可使这些细胞形成群集，可将这些细胞群集输注到肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞植入到受体中的适当位置内。植入位点包括例如肝脏、天然的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞在体内的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与之同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源施用的生长因子和外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞分化。
移植中所用的细胞量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个实施例中，治疗方法还包括在移植前将所述细胞结合到三维支持物中。在移植到患者体内之前，可将该细胞体外保持在该支持物上。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接植入到患者体内而无需进行另外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
在本发明的某些实施例中，以下所述各项中的一者或多者可用于本发明的方法中。
表A
该文档中通篇引用的出版物在此全文以引用方式并入本文。本发明通过下述实例进一步举例说明，但并不受其限制。
实例
通过下列非限制性实例可以对本发明进行进一步说明。
实例1
用分散酶/中性蛋白酶进行的细胞系H1的人胚胎干细胞的悬浮和群集将第41代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)用PBS(目录号14190，Invitrogen)洗涤一次，并用1mg/mL的(中性蛋白酶，SigmaAldrichCoLLC，目录号D4818，St.Louis,MO)在DMEM/F12(Invitrogen目录号11330，GrandIsland,NY)中的溶液来处理。将细胞在37℃下温育15-25分钟，直到菌落边缘开始卷曲和提升，但是在菌落从培养物表面完全脱离之前。然后移除并且用含有10μMY-27632(Axxora目录号ALX-270-333，SanDiego,CA)的(StemCellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)培养基将培养皿洗涤两次。然后将含有10μMY-27632的培养基以5mL/60cm2添加到培养皿，并用刮刀或橡胶淀帚从表面提起细胞。然后使用玻璃移液管将培养基和细胞转移到50mL圆锥管，并以90g(rcf)将群集离心3分钟。
在离心之后，吸出培养基，将细胞轻轻地重新悬浮于12mL培养基中并在其中进行简单地研磨，所述培养基含有10μMY-27632每225-240cm2总平面培养物(相当于一个T225烧瓶或四个10cm培养皿，大约9000万个细胞)。然后将细胞悬浮液转移(1mL/孔)到含有2mL/孔新鲜的具有10μMY-27632的培养基的超低结合6孔培养皿(UltraLowBindingCulture6welldishes)(CorningIncorporated，目录号3471，Corning,NY)中。细胞以类似于单层片段的方式提升，其中提升片段的平均直径为约20-30微米(图1a)，所述提升片段各自由细胞团块组成。将这些单层片段在悬浮液中温育2小时(温育时间可在0.5-4小时的范围内)，此时观察到片段的聚集体。然后用10ml玻璃移液管对该聚集体进行简单地研磨，并在低结合板中温育过夜(聚集体还可在未处理的细胞培养塑料和标准组织培养物处理的塑料中温育)(聚集体可直接进入到悬浮液中)。
温育过夜(18小时至24小时)之后，将细胞和培养基直接转移到包含25mL培养基的以50rpm(可在30-80+rpm的范围内)搅拌的125mL转瓶(Corning，目录号4500-125，CorningNY)中，使得最终体积为大约75mL。4天中每天更换培养基。4天后在培养物中测定多能性，并且对于多能性标志物(CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)，流式细胞术结果显示出高表达，而对于分化标志物(CXCR4)，几乎没有表达。参见图1b。这些数据表明，H1hES细胞可作为细胞群集利用作为细胞提升剂的从平面贴壁培养物形式成功转移到悬浮培养物，并且保持搅拌(动态)悬浮培养***中的多能性。该实例还可在具有板和锥形瓶的摇动悬浮***中进行，而不是在搅拌悬浮***中进行，具有可比较结果。
在悬浮培养物中4天之后(分化还可在形成聚集体之后24-120小时开始，优选地在开始分化之前培养2-3天)，多能细胞聚集体在培养基组分的逐步发展下进行分化以诱导细胞形成胰腺命运。旋转器搅动上翻以用于以65rpm的速度分化聚集体。培养基和组分示于表1a中。
第1阶段结束时，对样品进行流式细胞术和PCR。第1阶段结束时，悬浮分化的培养物在松散聚集体中形成均匀且同质的细胞群(图1c)，其中多能性标志物(CD9)的表达几乎消除，而定形内胚层分化标志物相当高，对于CXCR4(CD184)来说为97.2％阳性，而对于CD99来说为97.3％阳性(图1d)。
这些结果与qRT-PCR结果相关，其表明与未分化的WA01hES细胞相比，多能基因(CD9、NANOG和POU5F1/OCT4)的表达显著减少，而与定形内胚层相关联的基因(CXCR4、CERBERUS、GSC、FOXA2、GATA4、GATA6、MNX1和SOX17)的表达大量增加(图1e)。
定形内胚层群集然后通过移除TGF-β家族成员GDF8，并且将FGF7添加到培养基来进一步朝向原前肠分化。在用FGF7培养三天之后，群集通过将全反式视黄酸添加到以下培养基中的任一者而分化成胰腺PDX1表达命运：包含高葡萄糖(25mM)和低浓度的富含脂质的牛血清白蛋白(Albumax(LifeTechnologiesCorporation,Carlsbad,CA))的培养基，或包含相对较低葡萄糖浓度(8mM)和2％不含脂肪酸的牛血清白蛋白的培养基。添加到这些培养基中的详细组分列在表1a中。在分化结束时，分析样品以表达胰腺前体细胞的标志物。观察到群集在下列条件中的任一者下进行分化：低葡萄糖+2％FAF-BSA(A)或高葡萄糖+0.1％(B)，如表达高水平的NKX6.1、功能性β细胞所需的转录因子、以及高水平的内分泌胰腺标记物诸如突触素和嗜铬粒蛋白的流式细胞术所测量的(表1b)。这些结果与RT-PCR结果一致，其显示出在样品中由条件A和B两者表达的高水平的多个胰腺前体基因(数据未示出)。
随着细胞群集通过从定形内胚层(DE)(图1c)分化成原前肠而进行到胰腺内胚层(图1f)上，其典型形态显示出到细胞和细胞群集的可见形态变化。通常，多能群集通过相差显微术而显得密集且昏暗的，然后随着细胞发展到第2阶段中的原前肠而使外观变得松散。在全反式视黄酸处理之后，该形态反转，并且群集利用光滑的群集边界而再次变得更密集且均匀的。
根据条件B分化通过第4阶段的细胞在包含ALK5抑制剂的第5阶段培养基中另外保持5天(参见表1c)。这种额外的成熟培养导致下列内分泌标志物表达的显著增加：INS、GCG、SST、PPY和PCSK1。然后根据IACUC批准的研究方案将细胞群集植入到SCID-Bg小鼠的肾包膜中，随后对该小鼠进行为期20周的每2-4周测量禁食/进食c-肽。植入4周之后，在禁食20小时且随后葡萄糖刺激之后，未检测到c-肽。到第6周时，5只小鼠中的2只显示出对人c-肽呈一定的阳性(0.087&0.137ng/mL)，而到第10周时，5只小鼠中的5只对c-肽呈阳性(0.085-0.291ng/mL)。在第16周时，在禁食20小时且葡萄糖刺激之后，所有4只(4/4)小鼠对c-肽表达均呈阳性(0.377–3.627ng/mL)。
这些结果表明，可形成多能细胞聚集体，然后在悬浮培养物中分化以产生通过β细胞转录因子(比如PDX1和NKX6.1)的表达来表征的胰腺前体细胞群。此外，植入的并且允许在体内成熟的分化细胞群集响应于生理学上适当水平的葡萄糖负荷而表达胰岛素。
表1a：分化方案
如在本实施例和整个说明书中使用，TppB(也称为TpB)为PKC激活剂，其具有化学名：(2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2，4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺和CAS号：497259-23-1。
表1b：所选择的分化标志物的流式细胞术结果
表1c：分化方案
实例2
用EDTA进行的细胞系H1的人胚胎干细胞的悬浮和群集
将第41代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)用PBS(目录号14190，Invitrogen)洗涤一次，并用非酶细胞提升/传代剂EDTA(Lonza，目录号17-7-11E)处理。将细胞在室温下温育8分钟。然后移除EDTA，再过1分钟或2分钟之后(EDTA暴露总共9分钟至10分钟)，用包含10μMY-27632的培养基(Axxora目录号ALX-270-333，SanDiego,CA)冲洗板，并使用玻璃移液管将移出的细胞收集在50ml圆锥管中。用包含10μMY-27632的培养基再一次冲洗板，并且合并移出的细胞。应当注意，在室温下暴露于EDTA9-10分钟之后，一些细胞仍留在板上，并且提升的细胞不完全解聚成单细胞悬浮液。相反，细胞作为小聚集体从表面移除。然后使用玻璃移液管将培养基和细胞转移到50ml圆锥管中，并且进行细胞计数(-ChemoMetecA/S，目录号YC-T100,Denmark)。根据需要添加额外的包含10μMY-27632的培养基以使细胞浓度为1.0百万细胞/ml至1.5百万细胞/ml。
如果离心成粒料并通过移液管重新悬浮，则群集是松散聚集的并将解离成单细胞，所以不对细胞进行离心。相反，使管中的培养基和细胞轻轻旋动直到形成均匀悬浮液。如果需要，还可以延长EDTA处理周期，并使细胞靠近单细胞悬浮液。然后用玻璃移液管将细胞悬浮液在37℃湿度5％的CO2培养箱中以3ml/孔转移到两个未用组织培养物处理的6孔培养皿(BectonDickinson，目录号Falcon351146，FranklinLakes,NJ)中。在悬浮液中将细胞温育2小时，此时观察到聚集体。然后通过用玻璃移液管轻轻移液来研磨聚集体以破坏大聚集体并形成同质、均匀的群集悬浮液，然后静置温育过夜。
然后在18-24小时之后，使细胞和培养基以90g(rcf)在50mL圆锥管中旋转沉降3分钟。丢弃用过的培养基上清液，将细胞聚集体悬浮在新鲜的中，并将悬浮液在37℃湿度5％的CO2培养箱中转移到以55rpm搅拌的转瓶(CorningIncorporated，目录号4500-125，CorningNY)中。2天中每天更换培养基持续。在转变成分化培养物之前，在搅拌悬浮培养物中2天之后确定多能性。CD9、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81和CXCR4的流式细胞术结果在图2a中以散点图形式示出。对于多能性标志物(CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)，这些数据显示出高表达，而对于分化标志物(CXCR4)，显示出低表达或没有表达。这些结果表明，H1hES细胞可使用非酶提升方法从平面贴壁培养物形式转移到悬浮培养物，并且保持动态搅动悬浮培养***中的多能性。
在悬浮培养物中2天之后，多能细胞聚集体在培养基组分的逐步发展下进行分化，从而诱导细胞形成胰腺命运。将旋转器搅动保持在55rpm的速度下。培养基和组分示于表2a中。
第1阶段结束时，对样品进行流式细胞术和PCR。第1阶段结束时，悬浮分化的培养物在松散聚集体中形成均匀且同质的细胞群(图2b)，其中多能性标志物(CD9)的表达几乎消除，而定形内胚层分化标志物CXCR4(CD184)相当高，在三个转瓶上为95.9％±1.8sd(图2c)。这些结果与qRT-PCR结果相关，其表明与未分化的WA01hES细胞相比，多能基因(CD9、NANOG和POU5F1/OCT4)的表达显著减少，而与定形内胚层相关联的基因(CXCR4、CERBERUS、GSC、FOXA2、GATA4、GATA6、MNX1和SOX17)的表达大量增加(图2d)。
然后将来自转瓶的定形内胚层群集合并，并分布到另一个转瓶或锥形瓶(摇动搅动***)中的任一者，并且定向以通过移除GDF8，以及将FGF7添加到培养基来朝向原前肠进一步分化。在用FGF7培养三天之后，群集通过将全反式视黄酸添加到包含相对较低葡萄糖浓度(8mM)和2％不含脂肪酸的牛血清白蛋白的培养基而分化成胰腺PDX1表达命运。添加到这些培养基中的详细组分列在表2a中。在分化结束时，分析样品以表达胰腺前体细胞的标志物。使用流式细胞术，以两种悬浮液形式观察到高水平的NKX6.1(功能性β细胞所需的转录因子)，以及高水平的内分泌胰腺标志物，诸如突触素和嗜铬粒蛋白(表2b和图2e)。这些结果与RT-PCR结果一致，其示出在以转瓶形式或锥形瓶形式产生的样品中表达的非常相似的高水平的多个胰腺前体基因(图2f)。
这些结果表明，可形成多能细胞聚集体，然后在悬浮培养物中以多种悬浮培养物形式(包括搅拌***或摇动悬浮***)分化以产生通过β细胞转录因子(比如PDX1和NKX6.1)的表达来表征的胰腺前体细胞群。
表2a：培养基组分和分化方案
表2b：所选择的分化标志物的流式细胞术结果
实例3
细胞系H1的人胚胎干细胞的悬浮群集和连续悬浮传代
将在涂布有(CorningIncorporated,CorningNY)的组织培养物处理的聚苯乙烯上生长的第40代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)用PBS(目录号14190，Invitrogen)洗涤两次并用的半强度溶液(一部分PBS到一部分Sigma-Aldrich，目录号A-6964，St.Louis,MO)处理。将细胞在室温下温育31/2分钟。是包含胶原蛋白酶和蛋白水解酶的细胞分离溶液(从甲壳类动物中分离)，并且不含有哺乳动物衍生产物或细菌衍生产物。然后移除再过3分钟(暴露总共61/2分钟)之后，用包含10μMY-27632的培养基冲洗板，并使用玻璃移液管将移出的细胞收集在50ml圆锥管中。用包含10μMY-27632的培养基再一次冲洗板，并且合并移出的细胞。暴露于之后，一些细胞仍留在板上，并且提升的细胞不完全解聚成单细胞悬浮液。相反，细胞作为小聚集体从表面移除(图3a)。然后使用玻璃移液管将培养基和细胞转移到50ml圆锥管中，并且进行细胞计数。根据需要添加额外的包含10μMY-27632的培养基以使细胞浓度为1.0百万细胞/ml至1.5百万细胞/ml。
如果离心成粒料并通过移液管重新悬浮，则群集是松散聚集的并将解离成单细胞，所以不对细胞进行离心。相反，使管中的培养基和细胞轻轻旋动直到形成均匀悬浮液。然后用玻璃移液管将细胞悬浮液在37℃湿度5％的CO2培养箱中以3ml/孔转移到两个超低结合6孔培养皿中。在悬浮液中将细胞温育90分钟，此时观察到聚集体。然后对聚集体进行简单地研磨，并将其直接转移到包含25ml培养基的以55rpm搅拌的125ml转瓶(总的最终体积为大约75mL)中。3天中每天更换培养基持续，并在第3天确定培养物中多能性。群集的相差显微图像示出在静态悬浮培养物中90分钟之后形成的且在培养物中扩增超过三天的群集的均匀球形群(图3b)。在悬浮培养物中三天结束时，通过标志物CD9、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81和CXCR4的流式细胞术结果测定细胞的多能性。对于多能性标志物(CD9、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81)，细胞保持高表达，而对于分化标志物CXCR4，几乎没有表达(表3)。这些数据显示，H1hES细胞可使用酶提升方法(诸如)从平面贴壁培养物形式转移到悬浮培养物，并且将保持动态搅动悬浮培养***中的多能性。
然后使用解离额外的20代来使多能群集连续传代。在每一代，将5000万个细胞重力沉降在50ml圆锥管中2分钟，用PBS洗涤两次，并在添加之后两分钟和四分钟时在管的轻轻旋动下在37℃水浴中用的半强度溶液处理。在温育六分钟之后，将从管中吸出而不干扰细胞成粒。然后再将细胞温育3分钟(暴露总共9分钟)。然后用包含10μMY-27632的培养基冲洗管，使用玻璃移液管研磨两次，并使悬浮细胞穿过70微米细胞滤网(BDFalcon，目录号352350，FranklinLakes,NJ)。用包含10μMY-27632的培养基对管进行两次额外的冲洗，并穿过细胞滤网。
使管中的培养基和细胞轻轻旋动直到形成均匀悬浮液。然后用玻璃移液管将细胞悬浮液在37℃湿度5％的CO2培养箱中以3ml/孔转移到超低结合6孔培养皿中，并在悬浮液中温育2小时(测试0-28小时)，此时将聚集体转移到培养基的最终体积为80ml的玻璃转瓶中。作为另一种选择，细胞悬浮液可直接放置在以55rpm搅动的转瓶或以40rpm摇动的锥形瓶中，并且群集在搅拌悬浮液中形成(图3c)，培养基的最终体积为80ml。
使用这种连续的传代方法，细胞传代20次，其中每次传代的大约分流比为1:3。在每一代通过流式细胞术测量多能性，并且对于染色体12和17，使用荧光原位杂交(FISH)测定法确定核型，两个染色体被鉴定为在hES细胞中为潜在不稳定的。CD9、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81和CXCR4表达的流式细胞术结果以散点图形式示出，并且对于多能性标志物显示高表达，而对于分化标志物(CXCR4)显示低表达或没有表达，同时染色体12和17的FISH测定显示出正常的拷贝数。这些数据表明，H1hES细胞可使用(非哺乳动物酶细胞解离方法)在常规连续传代下保持在悬浮培养物中，并将保持动态搅动悬浮培养***中的多能性和稳定核型，从而在20次传代的过程中产生1×109个细胞/原始输入细胞。EDTA也可用于该连续悬浮，并持续6代。
表3：基于标志物CD9、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81和CD184(CXCR4)的结果的细胞多 能性的流式细胞术作为时间的函数
实例4
细胞系H1的悬浮培养的人胚胎干细胞的定向分化
使用将第40代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)从平面贴壁培养物提升，并且转移到悬浮培养物形式。使用实例3中描述的方法将细胞保持在动态搅动悬浮培养***中持续30代。
通过如表3中所示的前20代来确认多能性，其中稳定的高水平的多能性标志物保持在整个培养物中，如流式细胞术所测量的。为了确认多能性并展示其提供用于治疗糖尿病的细胞源的能力，细胞通过包含旨在概括正常胰腺发展的形态发生素或生长因子的不同培养基的逐步进展而在动态搅动悬浮培养***中分化成胰腺前体。该过程产生了通过高的PDX1和NKX6.1共表达来表征的胰腺前体细胞群。当这些细胞被移植时，它们进一步成熟成功能性葡萄糖刺激胰岛素分泌组织，该组织能够响应于葡萄糖而分泌胰岛素并且保持链脲佐菌素诱导的糖尿病模型中的正常血糖。参见图4c和表4c。
为了产生这些胰腺前体细胞，使用实例3中描述的方法对已扩增并保持在动态搅动悬浮培养***中16代的H1人胚胎干细胞进行分化。概括的说，使细胞扩增30代，测量这些传代中前20代的多能性，细胞在第16代时分化。群集形式的多能细胞在4℃下经过3小时从培养基转移到FBC溶液(表4a)。细胞群集然后移动到由SartoriusStedim生物抑制剂B-DCU(Goettingen,Germany)控制单元调控的3升玻璃悬浮生物反应器中，并且根据表4b以0.55百万个细胞/mL悬浮在分化培养基中。将细胞在针对温度、pH和溶解氧(DO)进行调控的封闭无菌悬浮生物反应器(pH电极225mm，型号F-635，以及溶解氧12mm传感器，型号D-145，来自BroadleyJamesCorporatio,IrvineCA)中保持14天。
在整个运行中，通过调控≤1.6升的总培养基体积中的CO2流来使培养基碳酸氢盐水平保持在3.64g/L，并使pH保持在7.4。在Sartorious控制***的控制下，用CO2、空气和O2连续灌注生物反应器顶部空间，其中随着150cc/分钟的恒定气流向前，第1阶段为20％溶解氧设定点并且第2阶段为30％溶解氧设定点。响应于溶解氧含量来调控氧流量，响应于pH来调控CO2流量。在整个运行中通过电加热套将温度保持在37℃。在运行开始时并且对于每次培养基更换(每次更换移除93％的培养基)，停止叶轮(在70rpm下操作的3”不锈钢节距叶片叶轮)，并且移除培养基，或者通过穿过使用TerumoTM管焊机连接到配管的生物反应器中的汲取管的蠕动泵添加培养基以维持封闭***。在分化的每个阶段结束时获得细胞/群集的图像，收集流式细胞术样品，并针对第1阶段第3天和第2阶段结束3天之后的CXCR4表达对样品进行测定(图4a)。观察到，从分化引发时的CXCR4阴性多能细胞群(表3，第16代)到表达细胞的CXCR4群(98.5％的细胞为CXCR4阳性，图4b)的接近总群转变。第2阶段结束3天之后，这些细胞转变成几乎CXCR4阴性状态(7.0％的细胞为CXCR4阳性)，并且到第3阶段结束时，细胞已几乎完全转变成CD56阳性状态。在第4阶段的第4天的分化过程结束时，细胞对于PDX1表达为88.5％阳性(图4b)并且显示出与胰腺内分泌细胞(33.5％嗜铬粒蛋白阳性)和胰腺祖细胞(65.7％NKX6.1阳性)的混合物一致的表达模式。该阶段特异性标志物表达模式指示从多能群体有效逐步分化成胰腺细胞。在分化过程结束时，产生2.77百万个细胞/mL(1.5升中41亿细胞)，这表明每次输入hES细胞5个分化细胞的总质量扩增。
在运行结束时，移除500mL以用于离心和洗涤，并且在移植、成熟和功能性动物模型中进行测试。将剩余的1000mL细胞悬浮液在400***(KBI生物***，DurhamNC)中处理以在完全闭环***中洗涤、过滤和浓缩细胞产物。将细胞产物以41百万个细胞/mL的最终浓度从1升的起始体积浓缩成50mL的浓缩细胞。然后使用自动小瓶填充机械(Fill-It,TAP,HertfordshireUK)以1.2ml填充体积将这些浓缩细胞分散到24个小瓶中，并且通过将其放置到液氮冷冻器中来进行冷冻。
将通过标准离心洗涤和浓缩的500mL分化细胞以每个SCID-Bg小鼠5百万个细胞的剂量移植，将其放置在肾包膜的正下方，或者放置在皮下植入(每个条件下6种动物)的免疫保护性大型封装装置(TheracyteTM,IrvineCA)内。在植入后12周时，植入细胞响应于禁食和随后的进食而表达如ELISA(人c-肽定制ELISAMercodia目录号10-1141-01)所检测到的显著水平的循环人C-肽(>0.1ng/mL)，而在第16-20周，动物具有超过1ng/mL的循环c-肽(表4c)。
在植入后27周(190天)时，将带有封装免疫保护性移植物的装置的两种动物各自用单次大剂量的链脲佐菌素(STZ)处理以选择性地杀死所有内源性小鼠β胰岛细胞并且诱导糖尿病(250mg/Kg)。在足以在对照动物中诱导明显的糖尿病的STZ处理之后的接下来两周，移植动物的血糖水平保持在正常范围内(<150mg/dL)。在植入后29周以及STZ施用之后两周，测试两种动物的葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)，并且响应于葡萄糖施用而显示出循环人c-肽的显著增加。此外，当移植物中的每个在植入后第209天(29.5周)移除时，动物的血糖水平急剧增加至>500mg/dL。
这些结果表明，用于治疗糖尿病的人胚胎干细胞来源的细胞产物可由扩增和分化的干细胞的悬浮液制备。该产物可在可伸缩的搅拌闭环生物反应器***中产生，并且可根据商业cGMP制造需要用闭环洗涤和浓缩来处理细胞产物。该人胚胎干细胞来源的细胞产物可治疗广泛使用的如GSIS能力、调控血糖的能力，以及在移除细胞疗法时返回到糖尿病状态所示的糖尿病动物模型中的糖尿病。
表4aFBC溶液的成分
aUSP＝美国药典
bNF＝国家处方集
cFCC＝食品化学法典
dNA＝不适用
eACS＝美国化学学会
表4b：培养基组分和分化方案
(术语：时间0＝新阶段的第一次进给；时间24、48或96小时＝新阶段培养基之后的时间)
表4c：C-肽表达(ng/mL)
C-肽(ng/mL) 4周 8周 12周 16周 20周 24周 29周
肾包膜植入物(N＝6) 0.00 0.03 0.19 0.95 2.56
标准偏差 0.00 0.03 0.17 0.71 1.33
Theracyte装置植入物(N＝6) 0.00 0.02 0.35 0.58 1.45 2.49 2.85
标准偏差 0.01 0.01 0.54 0.51 1.02 0.75 0.21
实例5
细胞系H1的悬浮形式的贴壁培养人胚胎干细胞中的定向分化
使用EDTA将第41代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)从平面贴壁培养物中提升，并且使用实例2中描述的方法将其转移到悬浮培养物形式。
通过如图5a中所示的流式细胞术来测量细胞聚集体的多能性，并且观察到多能性标志物CD9、SSEA4、TRA-1-61和TRA-1-80的高表达，这表明细胞是高度多能的。这些多能细胞然后通过包含旨在概括正常胰腺发展的形态发生素驱动器的小分子和生长因子的不同培养基的逐步进展而在动态搅动悬浮培养***中分化成胰腺前体。该过程产生通过胰腺细胞转录因子PDX1和NKX6.1的共表达来表征的胰腺前体细胞群。当这些细胞被移植时，它们进一步成熟成功能性葡萄糖刺激胰岛素分泌组织，该组织可校正链脲佐菌素诱导的糖尿病模型中的高血糖。
为了产生胰腺前体细胞群，保持在培养基中的群集形式的多能细胞转移到具有经控制器调控的温度、pH和溶解氧的0.2升玻璃搅拌悬浮生物反应器(Dasgip，目录号DS0200TBSC，Shrewsbury,MA)。将多能细胞群集在生物反应器中培养两天。此时(第1阶段第0天)，在细胞聚集体根据表5a以大约0.7百万个细胞/mL悬浮于分化培养基中时，更换培养基并且引发分化。然后将细胞在该封闭无菌悬浮生物反应器中保持14天。在整个分化中，通过调控0.3升总体积中的CO2流来使培养基碳酸氢盐水平保持在3.64g/L，并使pH保持在7.4。在5升/小时的恒定气流下具有30％溶解氧设定点的Dasgip控制***的控制下，向生物反应器顶部空间充入CO2和空气。响应于溶解氧含量来调控空气流量，响应于pH来调控CO2流量。
表5a：培养基组分和分化方案
如在本实施例和整个说明书中使用，SCIO为Alk5激活剂，其具有化学名：4-{[2-(5-氯-2-氟苯基)-5-(1-甲醚)嘧啶-4-yl]氨基}-N-(2-羟丙基)吡啶-3-酰胺和CAS号：674794-97-9。SCIO的化学结构在以下显示：
在整个运行中温度保持在37℃。在运行开始时并且对于每次培养基更换(每次更换移除95％的培养基)，叶轮停止，并移除培养基，然后通过穿过使用TerumoTM管焊机连接到配管的生物反应器汲取管的蠕动泵添加培养基以维持封闭***。
在第1阶段期间测试若干不同进给设置：(a)在引发分化后24小时更换培养基，而在48小时处不更换培养基；(b)在引发分化后24小时更换培养基并且在48小时处添加葡萄糖丸；以及(c)在整个第1阶段不用葡萄糖更换培养基并且在引发分化后24小时添加GDF8丸，然后在引发后48小时处添加葡萄糖丸。
对于如表5b中列出的每个反应器，在过程开始、中间和结束时进行细胞计数。在第1阶段结束时，通过流式细胞术对蛋白质表达模式进行取样。在条件A(在开始分化成定形内胚层后24小时更换培养基，而在接下来的48小时不更换培养基)下分化的细胞显示出通过诱导分化标志物(CD99和CXCR4)以及减少多能性标志物(CD9)表达(图5b)所测量的最佳结果。在定形内胚层形成结束时与CD9的较低表达结合的CXCR4和CD99的较高表达与胰腺基因的较高表达和指示分化之后的替换器官命运的基因的较低表达相关(图5d和图5e)。具体地，在分化的整个第一阶段不更换培养基或在第1阶段不将葡萄糖以大量进给形式添加到培养基中的一者或两者导致第1阶段结束时较低的CXCR4水平，这与四个阶段分化结束时非常不同的聚集体形态相关(图5c)。具体地讲，在第4阶段结束时，条件B和C具有较低的胰腺基因表达(NKX6.1和CHGA)以及较高的非胰腺基因表达(CDX2和SOX2)，如通过流式细胞术所测量的(图5d和表5b)。这些发现由qRT-PCR证实(图5e)，这是因为条件A显示出比条件C显著更高的胰腺基因表达，条件B介于A和C之间。此外，条件C表达显著更高水平的指示替代非胰腺命运，例如CDX2、AFP和白蛋白(图5e)的基因。这些数据表明，在DE形成的最后48小时不更换培养基而产生的同质高CXCR4表达定形内胚层(DE)稍后能够转变成纯胰腺内胚层群。
在四个阶段分化结束时，将根据条件A分化的细胞从生物反应器移除，用包含0.1％FAF-BSA的MCDB131培养基洗涤，并且植入SCID-Bg小鼠中。每个小鼠均在肾包膜正下方移植了五百万个细胞。植入之后每4周，进行抽血，并且测量血糖和c-肽。到植入后12周，通过ELISA检测到人c-肽水平高于1ng/mL，并且在16周时，c-肽水平平均为2.5ng/mL(图5f)。在植入后20周，以禁食状态，然后以进食状态测量动物的c-肽。葡萄糖处理诱导循环人c-肽从禁食状态中的0.93ng/mL显著增加到进食状态中的2.39ng/mL(图5g)，这表明移植细胞已成熟为功能性GSIS有效组织。此外，当对动物施用链脲佐菌素(STZ)(与人β细胞相比，小鼠β细胞对STZ更敏感并且优先被STZ破坏)以诱导糖尿病状态时，具有功能性GSIS有效组织的移植物的动物保持正常的血糖水平，不像发展成明显的糖尿病的未处理对照(图5h)。这些结果表明，通过功能性胰腺组织移植物保护具有hES分化细胞移植物的动物免患STZ诱导的糖尿病。
表5b：细胞计数和流式细胞术数据
实例6
细胞系H1的悬浮形式的微载体贴壁培养人胚胎干细胞的定向分化
制备微载体珠(C3)(Sigma-AldrichCoLLC,St.Louis,MO，目录号C3275)，通过将400mg珠浸泡在包含15mlDulbecco的PBS(DPBS)的20ml体积硅涂布的玻璃闪烁小瓶中4小时至24小时来进行培养。由化学地联接到交联葡聚糖基质的变性胶原蛋白薄层组成。上的变性胶原蛋白层易受各种蛋白酶(包括胰蛋白酶和胶原蛋白酶)消化的影响，并提供在维持最大细胞活性、功能性和完整性的同时将细胞从微载体移除的能力。
在浸泡之后，对珠进行高压灭菌并用无菌DPBS冲洗，并使其重新悬浮在补充有10μMY-27632的小鼠胚胎成纤维条件培养基(MEF-CM)中。然后以100mg珠/***密度将珠转移到125ml玻璃转瓶(CorningIncorporated,Corning,NY)中。将含有珠和具有Y-27632的MEF-CM的旋转器在37℃下在湿度5％的CO2培养箱中平衡至少60分钟。
使用TrypLETM(LifeTechnologiesCorporation,GrandIsland,NY)(在37℃下温育8分钟以形成单细胞悬浮液)将第44代人胚胎干细胞系H1的细胞(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)从平面贴壁培养物提升。然后洗涤细胞并将其悬浮在具有Y-27632的MEF-CM中，并且在静态(静止)温育周期中允许1100万hES细胞贴壁到珠上持续6小时。然后将具有Y-27632的MEF-CM添加到转瓶以使最终培养基体积为75mL，在玻璃转瓶中以50rpm的叶轮速度搅动细胞和珠。细胞以这种方式生长5天，培养基每天更换50mLMEF-CM。在培养物中5天之后，烧瓶包含53×106个细胞(±12×10SD)。作为对照，将一百万H1hES细胞接种到涂布有1:30稀释的MatrigelTM并保持培养基每天更换MEF-CM的6孔组织培养聚苯乙烯培养皿上。
在多能培养物中5天之后，然后通过含有旨在概括正常胰腺发展形态发生素的小分子和生长因子中的一者或两者的不同培养基的逐步进展而使这些细胞在动态搅动悬浮培养***中分化成胰腺前体。作为用于概括正常胰腺发展的方法，测试两种培养基配方；一种使用活化素A和Wnt3A来形成DE，而另一种使用MCX化合物与GDF8来形成DE(分别在表6a和表6b中)。每天更换培养基，并且通过确定细胞特性的RT-PCR和流式细胞术来表征样品。获取细胞在微载体上的相差图，并且在细胞分化引发之前作为多能培养物的细胞形态的时间过程示于图6a中。示出培养物分化的时间过程示于图6b中。还在多个时间点处通过实验获取细胞计数，并且对于平面培养物或悬浮微载体培养物中的培养基配方，结果示出为表面积(在图6c中为细胞/cm2)或培养基体积(在图6d中为细胞/mL)的函数。
在整个过程的多个点处，通过流式细胞术和RT-PCR来表征细胞。分化的第一阶段以及形成定形内胚层的流式细胞术结果在图6e中示为CXCR4(Y轴)和CD9(X轴)的细胞表达的点阵图，并且该结果在图6f中还表达为每种标志物的总表达。结果表明，在所有条件下，基本大多数细胞形成定形内胚层，如CXCR4表达的增加和多能性表面标志物CD9的减少所限定的。此外，定形内胚层的更有效形成以下列处理等级顺序发生：MCX/GDF8微载体>MCX/GDF8平面>WNT3A/AA微载体>WNT3A/AA平面。确实显示出对细胞具有培养基特异性效果，这是因为用MCX/GDF8处理的细胞显示出CERBERUS(Cer1)、GOOSECOID和FGF17的较低表达(图6g)。然而，所有处理条件均显示出定形内胚层基因CD99、CXCR4、FOXA2、KIT和SOX17的相似表达水平(图6g和表6c)。这些过程产生通过胰腺细胞转录因子PDX1和NKX6.1的共表达表征的胰腺前体细胞群。当这些细胞被移植时，它们进一步成熟为功能性葡萄糖刺激胰岛素分泌组织，该组织可校正链脲佐菌素诱导的糖尿病模型中的高血糖。
如在以下表6a中使用，B27为补充剂(LifeTechnologiesCorporation,Carlsbad,CA)。
如该实例中所用，MCX化合物为14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6-～.1～8,12.～]二十七烷-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮，其具有下式(式1)：
其他环状苯胺-吡啶三嗪也可代替上述MCX化合物使用。此类化合物包括但不限于14-甲基-3,5,7,14,18,24,28-七氮杂四环[20.3.1.1～2,6～.-1～8,12～]二十八烷-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-壬烷-17-酮、和5-氯-1,8,10,12,16,22,26,32-八氮杂五环[24.2.2.1～3,7～-1～9,13～.1～14,18～]三十-3(33),4,6,9(32),10-,12,14(31),15,17-壬烷-23-酮。这些化合物在下文中示出(式2和式3)：
示例性的合适的化合物在美国专利申请公布2010/0015711中公开，由于该专利涉及MCX化合物、相关环状苯胺-吡啶三嗪，以及它们的合成物，其公开内容全文并入。
在该实施例中第4阶段使用的Cyp26抑制剂为N-{4-[2-乙基-1-(1H-1,2,4-***-1-基)丁基]苯基}-1,3-苯并***-2-胺，其CAS号为201410-53-9并具有以下结构：
该Cyp26抑制剂也称为“Cypi”。该Cyp26抑制剂的结构和合成公开在美国专利号7,378,433，由于其涉及Cyp26抑制剂和其合成，该专利的公开内容全文并入本文中。
表6a：培养基配方和分化方案
表6b：培养基配方和分化方案
表6c
实例7
将H1(WA01)hES细胞系的亚克隆WB0106用于该实例。WB0106在WiCellResearchInstitute(Madison,WI)来源于称为DDL-13的H1系接种材料。H1系的WB0106亚克隆来源于在第23代解冻到MatrigelTM基底上的mTESR1TM培养基中的DDL-13小瓶，并且随后使用EDTA传代。WB0106在第28代冷冻，并且基于正常染色体组型(FISH和G-band)、分化成胰腺祖细胞的能力，以及形成群集并在悬浮培养物中扩增的能力，对这些研究进行选择。
然后将WB0106WCB小瓶解冻到T225烧瓶(CorningIncorporated,Corning,NY)中的MatrigelTM基底上的培养基中，并且在第一次传代时，细胞扩增到多个T225烧瓶中。在第二次传代时，结合来自多个T225***细胞，并将其用于接种单个2层CellStackTM(CS2)。一旦CS2为70％汇合，配管组件盖与相邻泵配管附接到培养基端口以关闭***。用 配管关闭***之后，通过Terumo焊机将袋或瓶焊接上，并且使用蠕动泵转移液体体积(培养基PBS-/-、或悬浮细胞)。
为从CS2提升细胞，将细胞用PBS-/-洗涤一次，然后用的半强度溶液处理，用PBS-/-稀释，并且温育4分钟至5分钟。然后移除并且在应用酶溶液之后3分钟，轻按CS2以促进细胞提升。将补充有0.5％BSA并且包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的一瓶培养基泵入到CS2中以冲洗和灭活残余然后收集冲洗液。添加和收集第二冲洗液体积，并且与第一冲洗液合并。然后将200mL中2.0×108-2.5×108个细胞转移到1层中并在湿度5％的CO2培养箱中在37℃下温育2小时。使用附接在两个培养基端口之间的C-FlexTM配管与泵配管的闭环，通过蠕动泵将细胞悬浮液在75rpm下研磨5分钟以使聚集体均匀化。将闭环配管替换为无菌0.2微米过滤器以允许气体交换，并且将在37℃下在湿度5％的CO2培养箱中温育过夜。温育过夜后(12小时至22小时，18小时最佳)，中的细胞形成多能细胞的圆形球状聚集体(群集)。
将含有悬浮细胞群集的补充有0.5％BSA的培养基连同补充有0.5％BSA并且保持在55-65rpm的0.4升新鲜培养基从转移到1升一次性转瓶(Corning；Corning,NY)中。转移二十四小时之后，将1升一次性转瓶从湿度5％的CO2培养箱移除，并允许群集沉降5-10分钟。然后将培养基吸出，直到200mL保留在容器中，然后将400mL额外的新鲜培养基添加到转瓶。在第2天结束时(转移后48小时)，重复该过程。
在第3天结束时(从CS2转移到转瓶后72小时)，用处理分离细胞群集以传代和进一步扩增。通过从湿度5％的CO2培养箱中移除1升一次性转瓶来引发传代过程。将烧瓶放置在生物安全柜内的旋转器板上以保持细胞的均匀悬浮液。将细胞悬浮液通过100mL移液管从转瓶移除，并均匀分布在四个175mL锥形聚碳酸酯管(ThermoFisher-Nalgene；Buffalo,NY)之间，并且以80-200rcf离心5分钟。吸出用过的培养基而不干扰细胞造粒。然后将25mL没有钙或镁的DPBS(DPBS-/-)添加到每个管，并且将细胞结合到一个圆锥管中并在80-200rcf下离心5分钟。将DPBS-/-从圆锥管中吸出，并添加30mL的50％/50％DPBS-/-溶液到管。将细胞群集抽吸1-3次，然后间歇旋动4分钟，然后在80-200rcf下离心5分钟。然后尽可能完全地吸出而不干扰细胞造粒，并且连续且温和地轻按圆锥管3分钟至5分钟，直到细胞悬浮液呈现出均匀的乳白色。将包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的补充有0.5％BSA的10mL培养基添加到细胞悬浮液并且研磨2至4次以使残余的失活。将包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的补充有0.5％BSA的90mL培养基添加到穿过40微米细胞滤网(BDFalcon；FranklinLakes,NJ)的细胞和悬浮液。
用NC-100(ChemoMetecA/S,Allerod,Denmark)确定100mL体积的过滤细胞悬浮液中的细胞密度，并且添加额外的培养基以在包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的补充有0.5％BSA的培养基中得到1×106个细胞/mL的最终细胞浓度。然后将225mL(225百万个细胞)的细胞悬浮液转移到1升一次性转瓶并且温育1小时，而不在湿度5％的CO2培养箱中搅动。然后将烧瓶从培养箱移除，并且在生物安全柜中的旋转器板上以100rpm搅动1-3分钟。在混合细胞悬浮液时，将包含10微摩尔Rho激酶抑制Y-27632的补充有0.5％BSA的额外225mL培养基添加到细胞悬浮液。然后将转瓶返回到湿度5％的CO2培养箱中持续30分钟。然后将烧瓶从培养箱移除，并且在生物安全柜中的旋转器板上以100rpm搅动1-3分钟。在混合细胞悬浮液时，将包含10微摩尔Rho激酶抑制Y-27632的补充有0.5％BSA的额外150mL培养基添加到细胞悬浮液以使最终体积为600mL，并且将烧瓶返回到培养箱中的搅拌悬浮液。在解离后24小时和48小时处，允许细胞群集在5分钟至10分钟内沉降到烧瓶底部。确保使任何群集损失最小化，通过搅动将400mL用过的培养基从烧瓶移除并且替换为新鲜培养基。使用该过程，H1细胞从基底上的贴壁培养物转变成悬浮培养物作为细胞群集。
初始处理后72小时，重复细胞群集解离和转瓶接种(传代)的过程以保持细胞在悬浮液中用于多次传代(测试范围：1代至10代)。遵循上述过程，不同的是，在第一个24小时之后不移除培养基，并且添加200mL新鲜培养基。在解离之后48小时处，允许群集在5分钟至10分钟内沉降到烧瓶底部，吸出600mL，并且将400mL新鲜培养基添加到烧瓶。
这些悬浮传代和培养的细胞然后可冻存并储存以供将来使用。为了制备用于冻存的悬浮扩增细胞，将细胞群集如上所述用解离以用于悬浮液传代，不同的是细胞不穿过40微米细胞滤网。确定由每个1升一次性烧瓶产生的100mL细胞悬浮液的细胞计数。然后结合细胞悬浮液并在80-200rcf下离心5分钟。然后尽可能完全地移除来自离心管的培养基而不干扰细胞造粒。然后以逐滴方式添加冷(<4℃)(StemCellTechnologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)以实现150百万个细胞/mL的最终浓度，并且在转移到1.8mL冷冻小瓶(CorningIncorporated,Corning,NY)或15mLMiltenyi冷冻袋(MiltenyiBiotecInc.Auburn,CA)的过程中将细胞溶液保持在冰浴中。
然后如下所述在可控速率冷冻器中将悬浮扩增细胞以高密度冷冻在小瓶中。将室预冷至4℃并且保持该温度直到样品小瓶温度达到6℃。然后将室温度以2℃/分钟降低直到样品达到-7℃。一旦样品小瓶达到-7℃，将室以20℃/分钟冷却直到室达到-45℃。然后允许室温度以10℃/分钟短暂上升直到室温度达到-25℃，然后将室进一步以0.8℃/分钟冷却直到样品小瓶达到-45℃。然后以35℃/分钟冷却室温度直到室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，此后，将小瓶转移到气相液氮储存装置。
为了接种搅拌罐生物反应器，将高密度冻存细胞从液氮储存装置中移除，解冻并且用于接种封闭的3升玻璃生物反应器(DASGIP；Julich,Germany)。将四个或五个小瓶从气相液氮储存装置移除，并且直接放置在37℃水浴中105秒。然后通过2ml玻璃移液管将解冻小瓶内容物转移到50ml圆锥管。然后将含有0.5％BSA并且补充有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的9ml培养基(IH3或Essential8TM培养基(“E8TM”))以逐滴方式添加到管中。然后使细胞在80-200rcf下离心5分钟。从管吸出上清液，添加含有0.5％BSA并且补充有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的10ml新鲜培养基(IH3或E8TM)，并且将含有细胞的体积移取到培养基转移瓶(SaniSure,Moorpark,CA)中。然后通过由蠕动泵焊接的无菌C-flex配管将瓶内容物直接泵送到生物反应器中。在制备多能干细胞接种中，生物反应器用1.5L培养基(补充有0.5％BSA并且包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的IH3或E8TM)制备，预热至37℃，以70rpm搅拌，通过CO2调控至6.8-7.1pH，其中溶解氧设定点为30％(CO2、空气、O2和N2调控)。紧接着在接种之后，对生物反应器进行取样以用于细胞计数，根据需要调整培养基体积以得到0.225×106个细胞/mL的最终细胞浓度。
接种到搅拌罐生物反应器中的细胞在连续搅拌罐中形成细胞群集，并且保持在反应器中的多能性培养基(补充有0.5％BSA的IH3或E8TM)中总共三天。每天更换培养基，其中随着1-1.3升用过的培养基被移除并且1.5升新鲜培养基被添加，在接种后24小时进行部分培养基更换。接种后四十八小时，移除1.5-1.8升用过的培养基并且添加1.5升新鲜培养基。在接种后72小时处，通过移除>90％用过的培养基并且添加分化培养基来引发多能细胞分化(表7)。
一旦开始分段分化过程，细胞在温度(37℃)、pH(对于分化为7.4)和溶解氧(对于第1阶段为10％DO设定点，而所有其它时间为30％DO设定点，CO2、O2、N2和空气调控)经调控的封闭无菌悬浮生物反应器中保持12天或更多天。在整个分化过程中，在每次培养基更换时，叶轮停止5分钟至20分钟，然后通过汲取管移除培养基以允许群集沉降。通过穿过使用TerumoTM管焊机连接到C-FlexTM配管的汲取管的蠕动泵将生物反应器中的培养基从封闭的瓶或袋移除或添加到其中以保持封闭***。一旦足够的培养基被添加到容器以完全浸没叶轮，便对叶轮和加热器重新通电。
为了监测生物反应器过程，每天抽吸包含细胞群集的培养基样品以确定细胞数量和活性如图7所示。在该过程期间观察到细胞的一般扩增，因为在第4阶段第3天，0.225×106个活细胞/mL的接种体扩增以产生平均0.92×106个活细胞/mL。在生物反应器接种和多能细胞群集以及培养的过程中，通过将细胞保持在酸性设定点(pH7.0-6.8)下，第4阶段第3天的平均细胞输出增加至平均1.3×106个细胞/mL(图7)。
除了每天计数之外，通过NOVAFLEX(NovaBiomedical,Corporation，Waltham,MA)对生物反应器培养基样品进行分析。可以观察到，根据反应器设定点，第0阶段中的培养基的pH相对于大多数培养基共有的稳态标准pH7.4为酸性的，并且反应器培养基pH由于细胞代谢而下降通过第0阶段(图8)。这些结果与乳酸浓度增加以及葡萄糖水平下降通过分化第6天结束时的趋势相关(图9和图10)。总之，这些数据指示反应器中的细胞通过第0阶段和分化的前两个阶段(第1-6天)生长最迅速并且为葡萄糖消耗性的。然而，从第3阶段向前，反应器中的细胞代谢(降低的乳酸盐水平以及增加的葡萄糖水平)下降，这与第3阶段细胞数量的峰值、随后第4阶段过程中细胞密度的下降相关。
为了确定pH和代谢的阶段特异性变化是否匹配mRNA表达模式的变化。使用指定多能性、定形内胚层(DE)、肠管(GT)或第4阶段(S4)的四个应用生物低密度阵列(LifeTechnologiesCorporation,Carlsbad,CA)进行生物反应器细胞样品的测试，将结果与作为对照的过去未分化H1(WB0106)hES细胞样品进行比较以使所有运行和阵列上的表达标准化。
使用这些阵列，针对分化的每个阶段确定基因表达。还观察到，解冻到生物反应器中的接种材料细胞在第0阶段第1天和第0阶段第3天(生物反应器接种之后24小时和72小时：图11、图12、图13和图14)显示出未分化基因表达模式。这些结果与流式细胞术结果密切相关，其显示出高表达水平的CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，但不存在CXCR4/CD184(图15和表8)。虽然基因表达的流式细胞术和qRT-PCR测定法显示出用于多能性基因(CD9、NANOG、POU5F1、SOX2、TDGF和ZFP42)的与稳定多能状态一致的有效且稳定的表达模式，但还应当注意，在定向分化之前的第0阶段过程期间，GATA4、GSC、MIXL1和T的基因表达的适度但可变的增加，以及一些样品中的CER1、FGF17、FGF4和GATA2表达增加≥100倍(图16和图17)。
在完成第0阶段时(反应器接种后72小时)，将细胞移动到包含MCX和GDF8的分化培养基中(表7)。该培养基更换后二十四小时，注意到基因表达模式的显著改变(图18和图19)，诸如FOXA2表达的约700倍增加，以及CER1、EOMES、FGF17、FGF4、GATA4、GATA6、GSC、MIXL1和T表达的1000倍增加。这些增加的表达水平指示细胞转变通过中内胚层命运。还应当注意，CDX2水平与未分化细胞相比在第1阶段第1天有所提高(与对照相比表达增加470倍)，然而，这是表达的瞬时增加，并且CDX2水平从第1阶段第1天到第1阶段第3天下降94％，返回到与诱导分化之前观察到的那些相当的水平(图14、图19和图21)。
在暴露于DE分化培养基之后72小时处，细胞表达与定形内胚层的规格一致的分布，这是因为CXCR4水平达到峰值并且FOXA2和SOX17以超过历史对照>1000倍来表达。与定形内胚层一致，还应当注意，基因CER1、EOMES、FGF17、FGF4、GATA4、GATA6、GSC、MIXL1和T从第1阶段第1天观察到的升高水平下降(图20和图21)。
通过qRT-PCR观察到的基因表达的改变与通过流式细胞术观察到的结果相关。还观察到从分化引发时的CD9表达/CXCR4阴性多能细胞群(图15)到第1阶段结束时的同质CXCR4表达细胞群(98.3％细胞为CXCR4阳性，±1.9SD)(图22)的接近完全转变。
在完成定形内胚层形成(第1阶段)之后，将培养基更换为含有FGF7(用于诱导原前肠形成的形态发生素)的培养基(第2阶段)。与原前肠的形成一致，HNF4α和GATA6表达水平在第2阶段第1天和第3天增加，而在第1阶段的第3天以高水平表达的基因(CXCR4、EOMES、FGF17、FGF4、MNX1、PRDM1、SOX17和VWF)在第2阶段结束时显示出减少的表达(图23)。前肠基因(AFP、PDX1和PROX1)的表达增加(图24)。
细胞已在第2阶段培养基中培养72小时之后，将培养物转换到第3阶段培养基(表7)。一旦在该培养基中，细胞表达与如图25中所示的PDX1和FOXA2表达所测量的内胚层胰腺谱系一致的标志物(90.9％±11.9SDPDX1阳性和99.2％±0.6SDFOXA2阳性)。这些结果通过用于基因表达的qRT-PCR分析的样品的数据确认。PDX1的基因表达在24小时中从第2阶段第3天结束(与H1相比38,000倍)到第3阶段第1天结束(与H1相比200,000倍)增加5倍，并且在第3阶段第3天之后48小时再次加倍(与H1相比435,000倍)。这些数据显示出细胞被指定为胰腺命运(图26)。通过增加水平的通常在胰腺中表达的基因(ARX、GAST、GCG、INS、ISL1、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PAX6、PTF1A和SST)的宿主进一步支持该观察结果，如图26所示。此外，还观察到非常低的或没有OCT4/POU5F1表达(对照的2-10％或由qRT-PCR确定的32-37个样品Cts)以及对于其他内胚层谱系标志物AFP、ALB和CDX2-的高表达水平，进一步表明细胞群在生物反应器中的规格以及其从相对塑料肠管命运到胰腺命运的转变。
如图27所示，在第4阶段第3天的分化过程结束时，细胞保持高水平的PDX1和FOXA2表达并且进一步发展与胰腺内分泌细胞(28.1％±12.5SD嗜铬粒蛋白阳性)和胰腺祖细胞(58.3％±9.7SDNKX6.1阳性)的混合物一致的表达模式。该阶段特异性标志物表达模式指示从多能群体有效逐步分化成胰腺前体细胞。用来自qRT-PCR的数据进一步确认用流式细胞术观察到的结果。通常在胰腺中表达的基因(ARX、GAST、GCG、IAPP、INS、ISL1、MAFB、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PAX6、PTF1A，和SST)的宿主全部显示出增加的表达水平。(图28)。
在对多个过程变量诸如不同接种材料、第0阶段培养基、第0阶段培养基的pH以及消泡剂的使用进行测试时，图27中观察到的表达模式在多次运行中保持一致。对接种材料的多种来源进行测试，并且每种有效地产生具有>90％FOXA2、>75％PDX1和>50％NKX6.1的胰腺内胚层命运(图29)。此外，应当注意，当细胞在第0阶段在以下培养基中生长时，生物反应器产物的表达模式中没有显著差异：补充有0.5％BSA的称为“IH3”的定制内部培养基，或补充有2％BSA的可商购获得的培养基：Essential8TM，补充有0.5％BSA(图30)。当检测pH在第0阶段培养中的作用时，应当注意，在第0阶段中以相对较低的pH(6.8)生长的细胞相对于平均运行在生物反应器中具有增加的扩增(图7)，但是在第4阶段第3天细胞分布中没有显著改变(图31)。另外，观察到以94ppm使用消泡剂C乳液(Sigma目录号A8011)以减少由鼓泡产生的气泡，但是看起来不影响从第0阶段结束至第4阶段第3天细胞的细胞分布(表9和图32)。
在每个生物反应器分化结束时，将产物细胞冻存。将细胞在具有3.63g/L碳酸氢钠的MCDB131中或者在具有3.63g/L碳酸氢钠、葡萄糖(最终8mM)和1xGlutamax的MCDB131中洗涤，然后转移到由具有2.43g/L碳酸氢钠的57.5％MCDB131、30％无异源KSR、10％DMSO和2.5％HEPES组成的冷(<4℃)冻存培养基(最终浓度为25mM)。然后使用冷却分布将细胞冷冻在可控速率冷冻器(CRF)中，该冷却分布将细胞群集在环境温度下保持在冻存培养基中持续最多15分钟，降低至4℃的温度持续45分钟，进一步以2.00℃/分钟降低至-7.0℃(样品)。样品然后快速冷却，将室温度以25.0℃/分钟的速率降低至-45.0℃。然后通过将室温度以10.0℃/分钟增加至-25.0℃来提供补偿增加(室)。然后以0.2℃/分钟冷却样品直到温度达到-40.0℃。然后以35.0℃/分钟的速率将室冷却至-160℃，并且在该温度下保持15分钟。在CRF运行终止时，将样品移动到气相液氮储存容器。
可通过从气相液氮储存装置移除并且将小瓶转移到37℃水浴来使细胞解冻。将小瓶在水浴中轻轻旋动小于2分钟，直到小冰晶留在小瓶中。然后将小瓶内容物转移到50ml圆锥并且使用具有2.43g/L碳酸氢钠和2％BSA的MCDB131培养基在两分钟内逐滴稀释至最终体积总共为20ml。然后通过确定总的细胞数量，并且细胞悬浮液转移至超低附着培养皿持续1小时。然后将细胞从50ml圆锥中的培养基分离，移除上清液并且将细胞重悬在第4阶段培养基中以用于分析或体内研究。
另选地，在解冻之后，将装入小瓶的细胞转移到空的125mL玻璃转瓶(Corning,Incorporated，Corning,NY)，并且将含有2.43g/L碳酸氢钠和2％BSA的10mLMCDB131培养基以逐滴方式添加到烧瓶。将最终体积调整为80mL的相同培养基。通过确定总细胞数量，并且将细胞悬浮液以40rpm至65rpm搅拌过夜(12小时至28小时)。然后对细胞进行表征或者将其用于体内研究。
IH3的组成在以下示出以及美国公布申请2013/0236973中显示的方法来获得，由于该专利涉及细胞合适的细胞培养基，其公开内容全文以引用方式并入本文。IH3培养基中BSA的量可改变。
表7
表8
表9
材料：
·人胚胎干(hES)细胞系H1，(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)
·PBS(目录号14190，Invitrogen)
·Y-27632(Axxora目录号ALX-270-333，SanDiego,CA)
·EDTA，(Lonza，目录号17-7-11E)
·-(ChemoMetecA/S，目录号YC-T100,Allerod,Denmark)
·未用组织培养物处理的6孔培养皿(BectonDickinson，目录号Falcon351146，FranklinLakes,NJ)
·(Sigma，目录号12604-013，St.Louis,MO)
·pH和溶解氧(DO)生物反应器探针(pH电极225mm，型号F-635，以及DO12mm传感器，型号D-145，来自Broadley-James,IrvineCA)
·免疫保护性大型封装装置(TheracyteTM,IrvineCA)
·Mm人C-肽ELISA(MERCODIA目录号10-1141-01)
·GlutamaxTM、MCDB131和ITS-XInvitrogen
·FAF-BSA(Proliant)
·视黄酸，葡萄糖45％(2.5M)，SANT(Shh抑制剂)(Sigma)
·GDF8(Peprotech)
·MCX
·FGF7(R&DSystems)
·LDN-193189(BMP受体拮抗剂)(Stemgent)
·TPPB(PKC活化剂)(ChemPartner)
·MCDB131定制培养基
实例8
冻存生物反应器产生的胰祖群集的成熟和功能化
为了产生足够的细胞以用于每个生物反应器研究，将H1hES(WB0106)细胞的一个第31代主细胞库小瓶解冻。使用EDTA传代将细胞在贴壁条件下在培养基中扩增以便在MatrigelTM上若干次传代，直到产生充足的细胞以接种五个MatrigelTM涂布的2层(CS2)。一旦CS2中生长的贴壁细胞70％汇合，配管组件盖与相邻泵配管附接到培养基端口以关闭***。在关闭***之后，利用C-FlexTM通过Terumo焊机将袋或瓶焊接上，并且使用蠕动泵转移液体体积(培养基PBS-/-、或悬浮细胞)。
为从CS2提升细胞，将细胞用不含钙或镁的杜氏磷酸盐缓冲盐水(PBS-/-)洗涤一次，然后用的半强度溶液处理，用相等份的PBS-/-稀释，并且温育4分钟至5分钟。然后移除溶液，并且在应用酶溶液之后3分钟，轻按CS2以促进细胞提升。将含有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的一瓶泵入到CS2中以冲洗和灭活残余然后收集冲洗液。添加和收集第二冲洗液体积，并且与第一冲洗液合并。在2升的最终体积中将1.6-2.0×109个细胞从CS2移除。将每层2.0108至2.5×1088个细胞转移到四个CS2或八个1层CellStackTM中，并且以每层200mL的体积在湿度5％的CO2培养箱中在37℃下温育2小时。
使用附接在培养基端口之间的配管与相邻泵配管的闭环，通过蠕动泵将细胞悬浮液在75rpm下研磨5分钟以使聚集体均匀化。然后将在湿度5％的CO2培养箱中在37℃下温育过夜持续18小时。然后将来自CellStacks的2升细胞和培养基连同每个生物反应器1.5升新鲜培养基合并并转移到两个3升DASGIP生物反应器中，每次1升。在引发分化之前，用培养基将细胞保持另外两天，在生物反应器接种后24小时进行完全培养基更换。然后引发分化并且如表10中所述定向。将细胞在针对温度(37℃)、pH(漂移、或者对于多能细胞通过CO2调控为6.8或7.2，并且对于分化细胞调控为7.4)和溶解氧(30％DO设定点，CO2空气调控)调控的封闭无菌悬浮生物反应器中保持总共14天或15天(2天mTeSR2+12天或13天分段分化)。在每次培养基更换之前将叶轮停止5-20分钟以允许群集沉降。通过穿过使用TerumoTM管焊机连接到C-FlexTM配管(Cole-ParmerNorthAmerica,VernonHills,IL)的汲取管的蠕动泵移除或添加培养基以保持封闭***。一旦添加足够的培养基以浸没叶轮，便对叶轮和加热套重新通电。
使用这些方法在3升反应器中引发生产运行。在第一反应器运行中，在多能培养基的前两天测试两个不同的pH设定点。用5％的固定CO2气体输注速率将反应器1设置为pH7.2，所以随着反应器环境由于细胞的代谢活性而随时间推移酸化，pH将“漂移”较低。将反应器2设置为通过CO2气体水平调控的7.2的pH。在第二反应器运行中，对于反应器1将pH设定为6.8，而对于反应器2设定为7.2，两者均通过CO2气体水平调控。
为了监测生物反应器过程，在分化的每个阶段结束时获取细胞群集并且通过流式细胞术进行测定(表11，表12)。观察到从分化引发时的CD9表达/CXCR4阴性多能细胞群到定形内胚层形成完成时的同质CXCR4表达细胞群(96.9-98.1％细胞为CXCR4阳性)的接近完全转变。
通过流式细胞术观察到的结果与来自通过rt-PCR分析的成对样品的结果相关。在从多能性到胰腺命运的分段分化的基因表达特征的整个过程中对样品进行测试。在引发定向分化之前，对于与多能性或早期分化命运相关联的基因组合，由低密度阵列上的生物反应器细胞群集来测试mRNA。
可观察到，与未分化的H1对照组相比，来自生物反应器的细胞保持对于基因多能性特征的表达(POU5F1、NANOG、SOX2和ZFP42)并且显示出对基因分化特征的最小诱导或没有诱导(AFP和FOXA2：表达增加<50倍；FOXD3、GATA2、GATA4、GSC、HAND2、MIXL1和T：表达增加<10倍)(图33)。然而，一旦细胞与第1阶段第1天分化培养基接触，则基因表达模式随CDX2、CER1、FGF17、FGF4、FOXA2、GATA4、GATA6、GSC、MIXL1、MNX1和Brachyury(T)表达水平增加到大于未分化H1hES细胞100至1000倍而显著改变(图34)。到第1阶段第3天结束(定形内胚层形成)时，CD9、CDX2、FGF4、MIXL1、NANOG、POU5F1和Brachyury(T)相对于第1阶段第1天具有减少的表达，而特征性定形内胚层基因(诸如CD99、CER1、CXCR4、FGF17、GATA4、GATA6、KIT、OTX或SOX17)的表达达到峰值(图35)。
在第1阶段结束时，将细胞培养基从含有GDF8的培养基更换为含有FGF7的培养基。注意到若干不同的基因表达模式：在第2阶段的过程中某些基因表达增加(AFP、ATOH1、HHEX、OSR1、PDX1、PROX1、SOX2和SOX9)，表达减少(HAND1和SOX17)，始终稳定的高表达(HNF4α)，或低表达/没有表达(CDX2、GAST、NKX2.2、NKX6.1和PTF1a)(图36a-e)。这些模式指示，对于减少的中胚层标志物(HAND1和SOX17)，反应器中的细胞正在变成前肠(AFP、ATOH1、HHEX、HNF4α、OSR1、PDX1、PROX1、SOX2和SOX9)表达。然而，到第2阶段结束时，细胞尚未被指定为更成熟的肠或胰腺命运(CDX2、GAST、NKX2.2、NKX6.1和PTF1a)。
到第3阶段结束时，细胞已指定如PDX1表达所测量的胰腺谱系，该PDX1表达由与未分化对照相比，mRNA增加>100,000倍(图36)和通过流式细胞术测定的表达PDX1的76-98％细胞示出(表11)。还观察到对胰腺的其他基因(GAST、NKX2.2、NKX6.1、PROX1、PTF1a和SOX9)和肠的其他基因(诸如AFP和CDX2)的诱导，这表明细胞已开始指定更成熟的命运。
到第4阶段的第3天或第4天的分化过程结束时，细胞显示出与胰腺内分泌细胞(47-54％嗜铬粒蛋白阳性)和胰腺祖细胞(33-52％NKX6.1阳性)的混合物一致的表达模式。该阶段特异性标志物表达模式指示从多能群体到胰腺祖细胞的有效逐步分化，该胰腺祖细胞的特征在于与未分化的H1人胚胎干细胞相比，PDX1(>1×106倍诱导)和其他胰腺基因(ARX、GCG、GAST、INS、ISL、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PTF1a和SST的>1000倍诱导)的高表达水平，以及OCT4/POU5F1表达的接近全部损失(图37)。
在分化过程结束时，产生0.08-0.45×106细胞/mL(图38：每日细胞计数)。然后将该过程中产生的细胞冻存，或通过TheraCyteTM装置经皮下直接植入到动物体内，或放置在肾包膜下方。为了冻存细胞，将其转移到由具有2.43g/L碳酸氢钠的57.5％MCDB131、30％无异源的KSR、10％DMSO和2.5％HEPES组成的冻存培养基(最终浓度为25mM)。一旦细胞群集在环境温度下悬浮于冻存培养基中，则将冷冻小瓶在15分钟内移动到可控速率冷冻器(CRF)。室温度然后在45分钟内降低至4℃，并且进一步以2.00℃/分钟降低至-7.0℃(样品)。然后将样品快速冷却，将室温度以25.0℃/分钟的速率降低至-45.0℃。然后通过将室温度以10.0℃/分钟增加至-25.0℃来提供补偿增加(室)。然后以0.2℃/分钟冷却样品直到温度达到-40.0℃。然后以35.0℃/分钟的速率将室冷却至-160℃，并且在该温度下保持15分钟。在CRF运行终止时，将样品移动到气相液氮储存容器。
细胞已储存于气相液氮之后，通过从储存装置移除来解冻细胞，并将其转移到37℃水浴。将小瓶在水浴中轻轻旋动小于2分钟，直到小冰晶留在小瓶中。然后将小瓶内容物转移到50ml圆锥并且使用具有2.43g/L碳酸氢钠和2％BSA的MCDB131培养基在两分钟内逐滴稀释至最终体积总共为20ml。然后通过确定总的细胞数量，并且细胞悬浮液转移至超低附着培养皿持续1小时。然后将细胞从50ml圆锥中的培养基分离，移除上清液并且将细胞重悬在第4阶段培养基中。然后将细胞通过TheraCyteTM装置经皮下植入到动物体内或植入到肾包膜下方，或者将细胞在超低附着培养皿中温育过夜，然后植入到动物体内。
在移植物植入之后每四周监测动物的血糖和C-肽水平。用TheraCyteTM装置内的非冻存胰腺前体细胞处理或者通过将细胞直接放置在肾包膜下方来处理的动物成熟以到16周时表达超过1ng/mLC-肽，并且到植入后20周时达到2ng/mLC-肽(图39a和图39d)。此外，当用STZ处理以消除β细胞功能时，被移植的动物维持正常血糖直到移植物被移除，这表明移植物能够保护动物免患单次高剂量STZ诱导的糖尿病(图39b)。
还在用冻存细胞处理的动物中观察到该模式。由具有在解冻后已培养1小时的冻存胰腺前体细胞(1207B)的肾包膜移植物处理的动物在16周和20周时分别具有平均0.56ng/mL和1.09ng/mL的C-肽，而在解冻后培养过夜的细胞(1207C)在16周和20周时分别具有平均0.81ng/mL和1.35ng/mL的C-肽(图39d)。用TheraCyteTM装置内的冻存胰腺前体细胞处理的动物到16周时具有超过1ng/mLC-肽，并且与非冻存对照类似，能够在STZ处理后一周表达治疗水平的C-肽(0.98ng/mL，图39c)。这些结果表明，当在动物模型中测试时，冻存胰腺前体细胞可与非冻存对照起到同等作用。
表10
注意事项：
·当Glutamax不用于补充剂中时，以上表10中的基础培养基在第1-5阶段可任选地包括5mM葡萄糖。
·在以上所示表10中在第4阶段可任选地添加Cypi([100nM])。
表11
表12
由细胞聚集体在搅拌罐生物反应器中经历的剪切应力的计算
确定由细胞聚集体在3lDASGIP生物反应器中以70rpm的搅动速率混合的2.7升DASGIP搅拌悬浮生物反应器中经历的剪切应力。为了计算剪切应力值，作出以下所陈述的假设。
假设：
1.施加在细胞聚集体上的最大剪切应力不是湍流旋涡的结果。
2.施加在细胞聚集体上的最大剪切应力不是聚集体-聚集体或聚集体-叶轮碰撞的结果。
3.挡板(即，汲取管和探针)施加的剪切应力不在这些计算中处理。
为了本文中的计算目的，使用以下列出的术语和物理参数。
术语：
参数：
培养基参数
密度(ρ) 1000 kg/m3
粘度(μ) 8.50E-04< Pa s
运动粘度() 8.50E-07< m2/s
将列出的培养基参数和生物反应器参数应用于以下公式。
公式：
雷诺数：
Re = &rho;ND i 2 &mu;
聚集体上的最大剪切应力(Cherry和Kwon，1990年)
每单位质量消耗的功率(ε)
&epsiv; = P V L &rho;
消耗功率(P)
P = P N N 3 D i 5 &rho;
对于无挡板的搅拌罐，功率数计算基于来源于Nagata(1975年)的经验关联式。
P N = K 1 Re + K 2 &lsqb; 10 + 1.2 Re 0.66 10 + 3.2 Re 0.66 &rsqb; K 4
其中
K 1 = 14 + W D t &lsqb; 670 ( D i D t - 0.6 ) 2 + 185 &rsqb; &rsqb; K 2 = 10 K 3
K 3 = 1.3 - 4 &lsqb; W D t - 0.5 &rsqb; 2 - 1.14 D i D t
K 4 = 1.1 + 4 ( W D t ) - 2.5 &lsqb; D i D t - 0.5 &rsqb; 2 - 7 &lsqb; W D t &rsqb; 4
计算在2.7LDASGIP生物反应器中以70rpm的搅动速率施加到细胞聚集体上的至少2.5dyn/cm2的最大剪切。包含群集的最外层的细胞经历最高水平的剪切应力。剪切应力值高度依赖于陈述的假设。
实例9
人胚胎干细胞从细胞系WA01到定形内胚层的分化：MCX/GDF8在悬浮培养中的作用
将来自多能人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)的群集在含有3.64g/ml碳酸氢钠和5.5mM葡萄糖(目录号A13051DJ，Invitrogen,CA)的MCDB-131培养基中在锥形瓶/摇瓶、转瓶或未涂布的超低结合或未用组织培养物处理的6孔板中以0.25×106细胞/ml至2×106个细胞/ml范围内的细胞密度接种，该培养基补充有2％不含脂肪酸的BSA(目录号68700，Proliant,IA)、1XGlutamaxTM(目录号35050-079，Invitrogen,CA)、另外2.5mM葡萄糖(目录号G8769，Sigma)以及1:50,000原液浓度的ITS-X(目录号51500056，Invitrogen,CA)。为了本应用的目的，以这种方式补充的MCDB-131培养基将称为“第1阶段基础培养基”。该培养基中的群集在分化的第一天用以下所述物质中的任一者处理：3μMMCX(GSK3B抑制剂，14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七烷-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮，美国专利申请12/494,789，以引用方式全文并入本文)和100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，或仅3μMMCX，或20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)，或仅20ng/mlWNT-3A。在第二天，将细胞转移到补充有100ng/mlGDF8或100ng/ml活化素A的新鲜第1阶段基础培养基。收集样品以用于在零(紧接着在添加基础培养基加上补充剂之前)最多至分化开始后72小时范围内的多个时间点处进行流式细胞术、PCR和蛋白质印迹分析。
在分化3天之后，在每个条件下通过使用流式细胞术测量表达细胞表面标志物CXCR4、CD99和CD9的细胞的百分比来确定产生定形内胚层的效率。该数据(如图40a-d中的FACS图所示并且如表13所总结)指示，在悬浮培养中，在不存在TGF-β家族成员的情况下在分化的第一天添加3μMMCX以相当于在第一天用3μMMCX加上100ng/mlGDF-8或20ng/mlWNT-3A加上活化素A处理细胞时所获得的水平产生定形内胚层。
表13
实例10
人胚胎干细胞从细胞系WA01到定形内胚层的分化：MCX化合物浓度在悬浮培养中 的剂量响应
将来自多能人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)的群集在如实施例9中所述的第1阶段基础培养基中在锥形瓶/摇瓶或转瓶中以0.25×106细胞/ml至2×106个细胞/ml范围内的细胞密度接种。在分化的第一天用含有1.5、2、3或4μMMCX的第1阶段基础培养基，并且在第2天用含有100ng/mlGDF-8的第1阶段新鲜基础培养基处理群集。在第三天不进行培养基更换。收集样品以用于在分化第三天结束时进行流式细胞术和PCR分析。
然后通过使用流式细胞术测量表达细胞表面标志物CXCR4、CD99和CD9的细胞的百分比来确定产生定形内胚层的效率。该数据(如图41A-D中的FACS图所示并且如表14所总结)指示，在悬浮培养物中，以小于2μM的浓度添加MCX产生逐渐减少的定形内胚层阳性细胞(如较低百分比的CXCR4阳性细胞和较高百分比的CD9阳性细胞所证实)。另外，在高于4μM的浓度下，MCX表现出对细胞的有害作用，这导致下降的细胞活性。然而，通过增加BSA浓度，MCX的作用可被调控成使得可以使用≥4微摩尔的浓度。相反，当与较低BSA浓度一起使用时，可使用≤1.5微摩尔的浓度来产生定形内胚层。
表14
实例11
人胚胎干细胞从细胞系WA01到定形内胚层的分化：培养基更换频率在悬浮培养中 的作用
将来自多能人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)的群集在如实施例9中描述的第1阶段培养基在锥形瓶/摇动瓶中在介于0.25x106细胞/ml至2x106个细胞/ml的范围内密度下接种。群集用含有第1天分化的3μMMCX的第1阶段基础培养基处理并用含有第2天分化的100ng/mlGDF-8的第1阶段新鲜培养基处理。比照培养物在第3天接受更换培养基；对于单独容器，在第3天不执行培养基更换。收集用品用于在分化第3天结束时的流式细胞术和PCR分析。
然后在每个条件下通过使用流式细胞术测量表达细胞表面标志物CXCR4、CD99和CD9的细胞的百分比来确定产生定形内胚层的效率。结果示于图42A和图42B中的FACS图中并总结于表15中。
表15
实例12
人胚胎干细胞从细胞系WA01到定形内胚层的分化：使用悬浮培养物中GlutaMAX TM
将来自多能人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)的群集在锥形瓶/摇瓶或转瓶中以0.25×106至2×106细胞/ml范围内的细胞密度接种。
实施该实施例以通过将群集悬浮在加上或减去GlutamaxTM的第1阶段基础培养基(实施例9中有所描述9)中来确定产生定形内胚层是否需要GlutamaxTM补充物，该培养基在分化的第一天补充有3μMMCX，并且在第2天补充有含有100ng/mlGDF-8的第1阶段新鲜基础培养基。在第三天不进行培养基更换。收集样品以用于在分化第三天结束时进行流式细胞术和PCR分析。
在每个条件下通过使用流式细胞术测量表达细胞表面标志物CXCR4、CD99和CD9的细胞的百分比来确定产生定形内胚层的效率。数据和结果示于图43A和图43B中的FACS图中并总结于表16中。
表16
实例13
人胚胎干细胞从细胞系WA01到定形内胚层的分化：碳酸氢钠浓度在悬浮培养中的 作用
将来自多能人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)的群集在如实例9中所述的第1阶段基础培养基(含有3.64g/l碳酸氢钠)中，或者在含有2.43g/l碳酸氢钠的改性的第1阶段基础培养基中在锥形瓶/摇瓶或转瓶中以0.25×106至2×106细胞/ml范围内的细胞密度接种。用含有如实例12中所述的MCX和GDF-8的第1阶段基础培养基处理群集。收集样品以用于在分化第三天结束时进行流式细胞术分析。还在分化的每天捕获相差图像。
然后通过使用流式细胞术测量表达细胞表面标志物CXCR4、CD99和CD9的细胞的百分比来确定产生定形内胚层的效率。数据示于图44A和图44B中的FACS图中并总结于表17中。在悬浮培养物中，与当细胞在含有3.64g/L的培养基中分化时(平均97.35％的细胞表达CXCR4)相比，低至2.43g/L的碳酸氢钠水平(平均87.4％的细胞表达CXCR4)似乎更低效地产生定形内胚层。此外，可观察到，在第1阶段结束时，碳酸氢盐水平的差异与群集形态差异相关，如通过相差显微镜所观察到的(图44C和图44D)。另外，应当注意，在高碳酸氢盐水平下分化的细胞形成比在2.43g/L碳酸氢盐下分化的细胞更松散的群集。
表17
实例14
在可伸缩的生物反应器过程中由人诱导多能干细胞产生胰腺祖群集
细胞治疗将需要每剂大量的(>108)细胞。该实例示出能够分化诱导多能干细胞(iPS细胞)的过程，所述诱导多能干细胞的质量比当前细胞治疗制造实践可能需要的质量大3至5个数量级。
在该实施例中，使用iPS细胞系—UTC(来源于之前在美国专利申请13/330,931中描述的脐带组织细胞(美国公布申请2013/0157365)，由于该专利涉及衍生IPS细胞系，其公开内容全文并入本文)。该细胞以无“印痕”方式使用质粒转染在小鼠胚胎饲养细胞上得到，并且在第15次传代冻存。
由这些冻存细胞，通过将源材料小瓶直接解冻到来自LifeTechnologiesCorporation(GrandIsland,NY)的Essential8TM培养基(E8TM)中的人重组层粘连蛋白(来自Biolamina,Stockholm,Sweden的hrLaminin，目录号LN-521)上产生内部接种材料来产生一系列细胞库。该解冻和扩增材料称为“预备主细胞库”(预备MCB)，其用作未来库的接种材料。使用预备MCB，然后产生3个连续的细胞库，即预备MCB、MCB和工作细胞库(WCB)。然后将一个WCB小瓶解冻，使用EDTA传代在hrLaminin上扩增以用于在E8TM中进行三次传代。首先将细胞通过解冻接种到T225烧瓶(Corning；Corning,NY)中，然后传代到多个T225烧瓶中。然后将多个T225烧瓶进行传代和结合以接种单个1层CellStackTM(CS1)。一旦CS1中的细胞汇合，将细胞用PBS-/-洗涤一次，然后用的半强度溶液处理，用PBS-/-稀释，并且温育4分钟至5分钟。然后移除并且在应用酶溶液之后3分钟，轻按CS1以促进细胞提升。将补充有0.5％BSA并且包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的E8TM添加到CS1中以冲洗和灭活残余然后收集冲洗液并添加和收集第二冲洗液体积，并且与第一冲洗液合并。
将细胞在补充有0.5％BSA并且含有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的培养基中以1×106细胞/mL的浓度，以225mL的升数转移到1升一次性转瓶(Corning；Corning,NY)中。允许细胞在静态悬浮液中在湿度5％的CO2培养箱中群集持续60分钟，然后在55-65rpm下搅动5分钟，并且添加补充有0.5％BSA并且含有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的225mL额外培养基。允许细胞在静态培养物中另外沉降30分钟，然后将补充有0.5％BSA并且含有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的150mL额外培养基添加到转瓶中。此后，将细胞在湿度5％的CO2培养箱中以50-70rpm连续搅拌。二十四小时之后，将转瓶从培养箱移除，并且允许群集沉降5-10分钟。然后将培养基吸出，直到200mL保留在容器中，然后将400mL额外的新鲜培养基添加到转瓶中。在第2天结束时(转移后48小时)，重复该过程。
然后在初始处理后72小时，重复细胞群集解离和转瓶接种(传代)的过程以保持细胞在悬浮液中用于多次传代(测试范围：1代至10代)。
使用该过程，UTCiPS细胞从基底上的贴壁培养物转变成悬浮培养物作为细胞群集，然后在悬浮液中扩增。然后将这些悬浮传代和培养的细胞冻存并储存以供稍后使用。为了制备用于冻存的悬浮扩增细胞，将细胞群集如上所述用解离，不同的是细胞不穿过40微米
细胞滤网。然后对来自每个1升一次性***细胞进行计数，根据需要结合，并且在80-200rcf下离心5分钟。然后尽可能完全地移除上清液而不干扰细胞造粒。然后以逐滴方式添加冷(<4℃)以实现150百万个细胞/mL的最终浓度，并且在转移到1.8mLCorning冷冻小瓶(Corning；Corning,NY)或15mLMiltenyi冷冻袋(MiltenyiBiotecInc.Auburn,CA)的过程中将细胞溶液保持在冰浴中。
然后如下所述在可控速率冷冻器中将悬浮扩增细胞以高密度冷冻在小瓶中。将室预冷至4℃并且保持该温度直到样品小瓶温度达到6℃。然后将室温度以2℃/分钟缓慢降低直到样品达到-7℃。一旦样品小瓶达到-7℃，将室以20℃/分钟冷却直到室达到-45℃。然后允许室温度以10℃/分钟短暂上升直到室温度达到-25℃，然后将室进一步以0.8℃/分钟冷却直到样品小瓶达到-45℃。然后以35℃/分钟冷却室温度直到室达到-160℃。然后将室温度保持在-160℃至少10分钟，此后，将小瓶转移到气相液氮储存装置。
为了接种搅拌罐生物反应器，将高密度冻存细胞从液氮储存装置中移除，解冻并且用于接种封闭的0.2升玻璃生物反应器(DASGIP；Julich,Germany)。将冷冻小瓶从气相液氮储存装置移除，并且直接放置在37℃水浴中105秒。然后通过2mL玻璃移液管将解冻小瓶内容物转移到50mL圆锥管。然后将含有0.5％BSA、补充有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的9mLE8TM以逐滴方式添加到管。然后使细胞在80fcf至200rcf下离心5分钟。之后，将上清液从管中吸出，并且添加含有0.5％BSA且补充有10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的10ml新鲜E8。将包含细胞的该体积移取到培养基转移瓶(Sanisure,Moorpark,CA)中，并且通过由蠕动泵焊接的无菌C-flex配管将瓶内容物直接泵入到生物反应器中。在制备多能干细胞接种中，生物反应器用0.15L补充有0.5％BSA并且包含10微摩尔Rho激酶抑制剂Y-27632的E8TM制备，预热至37℃，以70rpm搅拌，通过CO2调控至6.8pH至7.1pH，其中溶解氧设定点为30％(CO2、空气、O2和N2调控)。紧接着在接种之后，对生物反应器进行取样以用于细胞计数，根据需要调整培养基体积以得到0.225×106个细胞/mL的最终细胞浓度。
接种到搅拌罐生物反应器中的细胞在连续搅拌罐中形细胞群集。在接种之后，将细胞群集在反应器中保持在补充有0.5％BSA的E8TM培养基中三天。每天更换培养基，接种之后24小时，移除90％用过的培养基并且添加0.15升新鲜培养基。接种后四十八小时，移除90％用过的培养基并且添加0.15升新鲜培养基。在接种后72小时处，通过移除>90％用过的培养基并且添加分化培养基来引发多能细胞分化(表18)。
一旦开始分段分化过程，细胞在温度(37℃)、pH(对于分化为7.4)和溶解氧(对于第1阶段为10％DO设定点，而所有其它时间为30％DO设定点，CO2、O2、N2和空气调控)经调控的封闭无菌悬浮生物反应器中保持12天或更多天。在整个分化过程中，在每次培养基更换时，叶轮停止5分钟至20分钟，然后通过汲取管移除培养基以允许群集沉降。通过穿过使用TerumoTM管焊机连接到配管的汲取管的蠕动泵将生物反应器中的培养基从封闭的瓶或袋移除或添加到其中以保持封闭***。一旦足够的培养基被添加到容器以完全浸没叶轮，便对叶轮和加热器重新通电。
为了监测生物反应器过程，每天抽吸包含细胞群集的培养基样品以确定细胞数量和活性如图45所示。在该过程期间观察到细胞的一般扩增，因为在第4阶段第3天，0.225×106活细胞/mL的接种体扩增生成0.65×106活细胞/mL(图45)。
除了每天计数之外，通过NOVAFLEX(NovaBiomedical,Corporation，Waltham,MA)对生物反应器培养基样品进行分析。可观察到，根据第0阶段的反应器设定点(pH6.8)，在整个第0阶段中，第0阶段培养基的pH为酸性的(pH6.8)(图46)。观察到在第0阶段培养基中，在相对较低的乳酸水平和高葡萄糖水平下，第0阶段的酸性设定点似乎降低细胞的代谢活性。一旦细胞开始分化直到第3阶段结束，细胞消耗培养基中的几乎所有葡萄糖(图47)并且产生高水平的乳酸(图48)。在第1和第2阶段的过程中观察到细胞密度的额外增加(图45)。
为了确定pH和代谢的阶段特异性变化是否匹配如通过qRT-PCR所测量的mRNA表达模式的阶段变化，进行以下所述。使用指定多能性、定形内胚层(DE)、肠管(GT)或第4阶段(S4)的四个应用生物***低密度阵列(LifeTM,Carlsbad,CA)。结果呈现为与作为整个运行和阵列上的标准化表达的对照的未分化UTCiPS细胞样品相比的倍差。
使用这些阵列，在分化的每个阶段确定基因表达。然后观察到，解冻到生物反应器中的接种材料细胞在第0阶段，第1天、第2天和第3天(生物反应器接种之后24小时、48小时和72小时：图49和图50)显示出未分化基因表达模式。这些结果与流式细胞术结果密切相关，其显示出高表达水平的CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，但不存在CXCR4/CD184(图51)。这些流式细胞术和qRT-PCR数据显示出多能性基因(CD9、NANOG、POU5F1、SOX2、TDGF和ZFP42)的强烈且稳定的表达模式，但是没有在分化过程中特征性表达的基因(CD99、CDH2、CDX2、CER1、CXCR4、EOMES、FGF17、FGF4、FOXA2、GATA2、GATA4、GATA6、GSC,HAND2、HNF4α、KIT、MNX1、MIXL1、PRDM1、PTHR1R、SOX17、SOX7、T、TMPRSS2和VWF)的表达，这与稳定多能状态一致。
在完成第0阶段时(反应器接种后72小时)，将细胞移动到包含MCX和GDF8的分化培养基中(表18)。该培养基更换后二十四小时，注意到基因表达模式的显著改变(图49和图50，与未分化对照相比的倍数表达)，诸如FOXA2、HAND2、PRDM1、PTH1R和SOX17的表达增加>10倍，CER1、FGF4、GATA4、GATA6、GSC和MNX1的表达增加>100倍，以及EOMES、FGF17、MIXL1和T的表达增加>1000倍。这些增加的表达水平指示细胞转变通过中内胚层命运。还应当注意，CDX2水平与未分化细胞相比在第1阶段第1天有所提高(与对照相比表达增加2700倍)，然而，这是表达的瞬时增加，并且CDX2水平到第1阶段，第3天下降97％，到与诱导分化之前观察到的那些相当的水平(图49和图50，与未分化对照相比的倍数表达)。
在暴露于第1阶段分化培养基之后72小时处，细胞表达与定形内胚层的规格一致的分布，这是因为CXCR4水平在超过历史对照约400倍处达到峰值，FOXA2以超过对照136倍来表达，并且SOX17以超过历史对照470,000倍来表达。与定形内胚层一致，还注意到，第1阶段结束时(第3天)CER1、EOMES、FGF4、GSC、MIXL1和T的基因表达已从在第1阶段第1天观察到的升高水平下降(图49和图50，与未分化对照相比的倍数表达)。
利用qRT-PCR观察到的基因表达的这些改变与通过流式细胞术观察到的结果相关。观察到从分化引发时的CD9表达/CXCR4阴性多能细胞群(图51)到第1阶段结束时的同质CXCR4表达细胞群(98.6％细胞为CXCR4阳性)(图52)的接近完全转变。
在完成定形内胚层形成(第1阶段)之后，将培养基更换为含有FGF7(用于诱导原前肠形成的形态发生素)的培养基。与原前肠的形成一致，HNF4α和GATA6表达水平在第2阶段第1天和第3天增加，而在第1阶段第3天以高水平表达的基因(CXCR4、EOMES、FGF17、FGF4、MNX1、PRDM1、SOX17和VWF)在第2阶段结束时显示出减少的表达(图50和图53，与未分化对照相比的倍数表达)。前肠基因(AFP、HHEX、PDX1和PROX1)的表达增加(图53，与未分化对照相比的倍数表达)。
细胞已在第2阶段培养基中培养72小时之后，将培养物转换到第3阶段培养基(表18)。一旦在该培养基中，细胞就表达与如通过用于基因表达的qRT-PCR测定法测量的内胚层胰腺谱系一致的标志物。PDX1的基因表达从第2阶段第3天结束时超过对照12,000倍到第3阶段第3天结束时超过对照739,000倍增加了60倍。这些数据指示细胞被指定为胰腺命运(图54)。支持该观察结果的是，与未分化对照相比，通常在胰腺中表达的基因(ARX、GAST、GCG、INS、ISL1、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PAX6、PTF1A和SST)的宿主的增加的表达水平，如图54和图55所示。有趣的是，也观察到，对于内胚层AFP、ALB以及CDX2的其它标记物没有OCT4/POU5F1表达(qRT-PCR的37个样品Ct)和高水平表达。这指示，在生物反应器中细胞群首先从多能干细胞群分化成相对整体肠道管并然后进一步分化成胰腺命运(图54和图55)。
在四阶段分化过程结束时，细胞保持高水平的PDX1(通过FACS确定为95.6％阳性，通过qRT-PCR确定为超过对照约1,000,000倍诱导)和FOXA2(通过FACS确定为99.5％阳性)表达。细胞显示出与胰腺祖细胞(通过FACS确定为39.2％NKX6.1阳性)和胰腺内分泌细胞(全部通过FACS确定为9.4％PAX6阳性、12.4％嗜铬粒蛋白阳性、15.2％NKX2.2阳性)群一致的表达模式。该阶段特异性标志物表达模式指示从多能群体有效逐步分化成胰腺前体细胞。通过qRT-PCR确认用流式细胞术观察到的这些结果。还应当注意，通常在胰腺中表达的基因(ARX、GAST、GCG、IAPP、INS、ISL1、MAFB、NEUROD1、NGN3、NKX2.2、NKX6.1、PAX4、PAX6、PTF1A，和SST)的宿主在第4阶段第3天全部具有增加的表达水平。(图55)。作为参考，每个阶段结束时细胞群集的代表性显微图(4倍)示于图56中。
表18
表18a
表18b
材料：
·人胚胎干(hES)细胞系H1，(WA01细胞，WiCell,MadisonWI)
·PBS(目录号14190，Invitrogen)
·Y-27632(Axxora目录号ALX-270-333，SanDiego,CA)
·EDTA，(Lonza，目录号17-7-11E)
·-(ChemoMetecA/S，目录号YC-T100,Allerod,Denmark)
·未用组织培养物处理的6孔培养皿(BectonDickinson，目录号Falcon351146，FranklinLakes,NJ)
·(Sigma，目录号12604-013，St.Louis,MO)
·pH和溶解氧(DO)生物反应器探针(pH电极225mm，型号F-635，以及DO12mm传感器，型号D-145，来自Broadley-James,IrvineCA)
·免疫保护性大型封装装置(TheracyteTM,IrvineCA)
·人C-肽ELISA(MERCODIA目录号10-1141-01)
·GlutamaxTM、MCDB131和ITS-XInvitrogen
·FAF-BSA(Proliant)
·视黄酸，葡萄糖45％(2.5M)，SANT(Shh抑制剂)(Sigma)
·GDF8(Peprotech)
·MCX
·FGF7(R&DSystems)
·LDN-193189(BMP受体拮抗剂)(Stemgent)
·TPPB(PKC活化剂)(ChemPartner)
实例15
人胚胎干细胞从细胞系WA01到定形内胚层的分化：MCX/GDF8作为细胞周期调控剂 在悬浮培养中的作用
将来自多能人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)的群集在含有3.64g/ml碳酸氢钠和5.5mM葡萄糖(目录号A13051DJ，Invitrogen,CA)的MCDB-131培养基中在锥形摇瓶中以0.5×106个细胞/ml接种，该培养基补充有2％不含脂肪酸的BSA(目录号68700，Proliant,IA)、1XGlutamaxTM(目录号35050-079，Invitrogen,CA)、另外2.5mM葡萄糖(目录号G8769，Sigma)以及1:50,000原液浓度的ITS-X(目录号51500056，Invitrogen,CA)。为了该实例的目的，以这种方式补充的MCDB-131培养基将称为第1阶段基础培养基或“纯”培养基。GSK3B抑制剂，14-丙-2-烯-1-基-3,5,7,14,17,23,27-七氮杂四环[19.3.1.1～2,6～.1～8,12～]二十七烷-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-壬烷-16-酮将称为“MCX”，美国专利申请12/494,789，以引用方式全文并入本文。
在分化的第一天用以下六种条件中的一种处理群集：(1)纯的，(2)3μMMCX加上100ng/mlGDF-8(目录号120-00，Peprotech)，(3)仅3μMMCX，(4)仅100ng/mlGDF-8，(5)20ng/mlWNT-3A(目录号1324-WN-002，R&DSystems,MN)加上100ng/ml活化素A(目录号338-AC，R&DSystems,MN)或(6)仅20ng/mlWNT-3A。
在引发分化后24和48小时，在所述条件中的每种条件下更换培养基。在这些时间，将在条件1、2、3和4中的细胞更换为补充有100ng/mlGDF8的新鲜第1阶段基础培养基，而将在条件5和6中的细胞更换为补充有100ng/ml活化素A的新鲜第1阶段基础培养基。
引发分化之前一小时，以及引发分化之后5小时、23小时、29小时、47小时或71小时(称为“时间0”)，将悬浮液样品转移到未用组织培养物处理的六孔培养皿中，并且用EdU(EdU试剂盒，LifeTechnologiesCorporation,Carlsbad,CA)温育一小时。然后在引发分化后时间0、6、24、30、48或72小时处通过流式细胞术评估EdU温育的细胞，测量细胞周期的G0/G1期、S期或G2/M期中的细胞百分比(图81至图87)。
在该方案之后，观察到细胞周期的G0/G1期、S期或G2/M期中的细胞百分比的显著差异(图82至图87)，并且注意到，MCX和MCX+GDF8处理的细胞与其它四种处理条件相比，结合的EdU减少接近40％(图81)。EDU结合的这种减少通过对于MCX+GDF8处理的样品增加38％G0/G1细胞以及对于仅MCX处理的细胞增加54％G0/G1细胞而匹配。在引发分化后6小时，EDU结合的这些改变以及到G0/G1的转变的增加在用GDF8、WNT3A、WNT-3A+活化素A或纯净培养基处理的细胞中未观察到。相反，用GDF8、WNT-3A、WNT-3A+活化素A或纯净培养基处理的细胞表现出具有EDU结合的细胞的百分比的最小减少(平均值，48.1％，SD±1.2)以及引发分化后六小时G0/G1中细胞数量的平均13％减少(标准偏差，±5％)，如图81和图82所示。
与其他处理条件相比，对于用MCX或MCX+GDF8处理的细胞在稍后的过程中观察到G0/G1值之间的差距的相同差异。在时间0之后30小时，MCX或MCX+GDF8处理的细胞与用WNT-3A+活化素A、GDF8、WNT-3A或纯净培养基处理的细胞相比在G0/G1中具有少43％至45％的细胞。G0/G1细胞百分比之间的差距保持在引发分化后48小时处，这是因为用MCX或MCX+GDF8处理的71.9-75.5％细胞在细胞周期的G0/G1中，而48.5％GDF8、55.8％WNT3A、57.7％WNT-3A+活化素A或49％纯净培养基处理的细胞在G0/G1中。除了在EDU结合和G0/G1分布中观察到的差异，当与WNT3A+活化素A、GDF8、WNT-3A或纯净培养基处理的细胞相比时，MCX或MCX+GDF8处理的细胞在时间0之后30和48小时处在细胞周期的S期中具有多15-33％的细胞(图84和图85)。
该数据(示于图57至图80和图88a至图88f中的CD99、CD9、CDH1、CDH2、CDX2、CER1、CXCR4、FGF17、FGF4、FOXA2、GATA4、GATA6、GSC、KIT、MIXL1、MNX1、NANOG、OTX2、POU5F1、SOX17、SOX7和T的基因表达)指示，在悬浮培养物中，分化第一天添加具有或不具有TGF-β家族成员GDF8的MCX产生可与在第一天用20ng/mlWNT-3A加上100ng/ml活化素A处理细胞时所获得的定形内胚层相比的定形内胚层，如通过定形内胚层形成结束时的基因表达所测量的。然而，与形成定形内胚层的过程中所观察到的细胞周期中的差异一致，观察到中间基因表达差异。在用MCX或MCX+GDF8处理的样品中，基因T(短尾类(brachyury))、GATA4和CDX2以基本上高于在分化的第一个24小时中用WNT-3A+活化素A或其它三个测试条件处理的细胞的水平来诱导(图88b、图88c和图88d)。相反，当与起始细胞群或其他四个测试条件相比时，多能性基因(NANOG和POU5F1/OCT4)的表达在用MCX或MCX+GDF8处理的样品中经过24小时显著减少(图88e)。当与在引发分化后24小时处测试的其他四个条件相比时，基因(诸如FGF4、FOXA2和SOX17)表达诱导的量级在MCX或MCX+GDF8样品中低得多，然而到48小时，所有样品均以相当的水平表达FGF4、FOXA2和SOX17。(图88c和图88e)。
实例16
使用可扩展的悬浮分化过程产生外胚层和中胚层组织
该实例示出能够扩增和分化多能干细胞(PSC)以实现可扩展的制造过程，从而产生外胚层组织或中胚层组织的过程。
将两种细胞系悬浮扩增以提供这些研究的接种材料：H1(WA01)hES细胞系-WB0106的亚克隆，以及由脐带组织细胞(UTC)产生的诱导多能干细胞(iPSC)。如之前的实施例中所述，将悬浮扩增的细胞以高密度冷冻在可控速率冷冻器中，然后解冻以在0.225×106细胞/mL的最终细胞浓度下接种封闭的3升玻璃生物反应器(DASGIP；Julich,Germany)或一次性3升单次使用生物反应器(EMDMilliporeCorporation,Billerica,MA)。接种到搅拌罐生物反应器中的细胞在连续搅拌罐中形成细胞群集，并且保持在反应器中的多能性培养基(补充有0.5％BSA的E8TM)中总共三天。在接种后72小时处，通过将细胞群集转移到塑料一次性锥形瓶(PETG125mL烧瓶，目录号4112，ThermoScientificRochesterNY)来在其相应分化培养基(表19)中引发多能细胞分化，从而形成中胚层/心脏组织(1)或外胚层/神经组织(2)。
一旦引发阶段分化过程，将细胞在摇床平台(MAXQ416hp,ThermoScientific,RochesterNY)上在湿度5％的CO2培养箱中以100rpm保持十(10)天。在分化引发之后的第1天、第3天、第5天和第7天，烧瓶中的培养基用如表19中描述制备的新鲜培养基更换。在用于参考的开始分化之前然后在引发分化的第3天、第5天、第7天以及第10天之后采用qRT-PCR样品。
为了确定mRNA表达模式中的外胚层或中胚层特异性改变能否通过qRT-PCR检测到，使用指定多能性、定形内胚层(DE)和第6阶段(S6)的三个应用生物***低密度阵列(LifeTM,Carlsbad,CA)，并且将结果与作为标准化表达的对照的适当未分化多能干细胞样品进行比较。
使用这些阵列，确定在外胚层(图89)或中胚层(图90)分化培养基中培养的多能细胞的基因表达模式。可观察到，在任一条件下在摇瓶中分化的细胞在第3天到第10天的扩增培养中对于像NANOG、POU5F1/OCT4、TDGF1和ZFP42的多能性基因表现出减少的多能基因表达，如多能性阵列所测量的。CXCR4的表达在来自分化成外胚层或中胚层的hES或iPS细胞的样品中有所增加。这些结果与qRT-PCR数据相关，其示出高表达的基因分化特征。用外胚层分化培养基处理的细胞表达引发分化后3至10天由qRT-PCR确定的ARX、NEUROD、NKX6.1、PAX6(>100倍)和ZIC1(>1000倍)的增加水平(图91)。这些数据由FACS阵列确认，其显示出在开始引发分化成外胚层命运之后三(3)天，iPSC细胞和hES细胞均保持SOX2(多能性和神经干细胞两者均需要的基因)的高表达，但是损失POU5F1/OCT4(多能性所需的基因)的表达，同时增加PAX6(神经和内分泌分化的基因)表达(图92)。
还观察到用中胚层分化培养基处理的细胞的相似分化动力。在10天分化的过程中，多能基因表达下降(图90)，对于第3天的早期瞬时中内胚层命运(CER1、EOMES、CKIT和VWF)的基因特征观察到早期诱导，并且这些基因表达水平到第10天下降至接近基线(图93)。还观察到，在引发分化后3、5、7和10天，特征性中胚层基因的表达显示出提前且增加的基因表达(在图93中为CDH2、CDX2、GATA6、HNF4α、MNX1、PRDM1和SOX17)。在iPS细胞样品和hES细胞样品两者中均观察到相同模式的基因诱导，这表明分化过程被定向并且本质上不是自发的。
通过qRT-PCR观察到的基因表达中的这些改变与通过相差显微镜所观察到结果相关，并且对群集的冷冻部分进行免疫染色(immunstained)。在中胚层分化悬浮培养物中第10天，10个群集中的约1个开始自发地“跳动”，这表明细胞已分化成心肌组织(图94，左图，第10天，白条)。一些群集的着色横截面显示出指示肌肉形成的有条纹的端对端β-微管蛋白染色模式(图94，右图)。
当与分化成中胚层的群集(图94)相比时，对于分化成外胚层命运的群集(图95，左图)观察到显著不同的形态图案。整个外胚层分化中的群集比分化成中胚层命运的细胞更大且更密集，并且外胚层分化细胞表达总数更少的β微管蛋白。那些的确表达β微管蛋白的细胞显示出更加树枝状图案的神经元染色特征(图95，右图，白色箭头)。
与qRT-PCR和FACS数据结合，这些结果表明，在悬浮液中库存和扩增的细胞可以定向和可再生方式在悬浮培养物中分化成中胚层或外胚层命运。
表19
表20
尽管已结合各种具体材料、程序和实例描述和示出了本发明，然而应当理解，本发明并不限于针对该目的所选材料和程序的特定组合。本领域的技术人员将理解，可对这些细节作出多种改变。说明书和实例应被认为仅为示例性的，本发明的真实范围和实质由随附权利要求书限定。本申请中所提到的所有参考文献、专利和专利申请均全文以引用方式并入本文中。

Claims (21)

1.一种在动态搅动悬浮培养***中扩增和分化多能细胞的方法，所述方法包括在平面贴壁培养物中将多能细胞培养成聚集的细胞群集，并在动态搅动悬浮培养***中分化所述多能细胞群集，其中所述分化步骤包括使用Cyp26抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法增加处于所述细胞周期的G0/G1期中的细胞百分比。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养包括包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述环境还包含Rho激酶抑制剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能细胞是贴壁的。
6.一种增加处于细胞周期的G0/G1期中的细胞百分比的方法，所述方法包括在包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中在平面贴壁培养物中将多能细胞扩增成聚集的细胞群集，将所述多能干细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮液，并在用小分子和任选地用TCGβ家族成员补充的培养基中在所述动态悬浮液中培养所述细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述小分子为MCX并且其中所述TGFβ家族成员为GDF-8。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述扩增包括包含Rho激酶抑制剂的环境。
9.一种将多能细胞分化成定形内胚层的方法，所述方法包括在包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中在平面贴壁培养物中将多能细胞扩增成聚集的细胞群集，将所述多能干细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮液，并在用MCX和GDF8或WNT3A以及活化素A补充的培养基中在所述动态悬浮液中培养所述细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增包括包含Rho激酶抑制剂的环境。
11.一种在动态搅拌悬浮培养***中扩增和分化多能干细胞的方法，所述方法包括在平面贴壁培养物中将多能干细胞扩增成聚集的细胞群集，将所述多能干细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮液，并在动态搅动悬浮培养***中分化所述多能细胞群集，其中所述细胞在包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中扩增成聚集的细胞群集。
12.根据权利要求11所述的方法，其中分化所述多能细胞群集以产生胰腺前体细胞群、神经前体细胞群或心肌细胞前体群。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、人脐带组织来源的细胞、孤雌生殖体、人胚胎干细胞（hES）以及羊水来源的细胞。
14.一种可移植干细胞来源的细胞产物，所述可移植干细胞来源的细胞产物包含由根据权利要求11所述的方法制备的所述分化胰腺前体细胞群。
15.一种在动态搅动悬浮培养***中扩增和分化多能细胞的方法，所述方法包括：
a.在包含约0.1%至约2%的牛血清白蛋白的环境中在平面贴壁培养物中将所述多能细胞扩增成聚集的细胞群集，
b.使用酶或螯合剂将所述多能细胞群集从所述平面贴壁培养物中转移至动态悬浮培养物，
c.将所述细胞群集保持在动态搅动悬浮培养***中，以及
d.在动态搅动悬浮培养***中分化所述多能细胞群集以产生胰腺前体细胞群、神经前体细胞群或心肌细胞前体群，
其中所述分化环境包括约缺氧至约环境的30%的氧范围，0.1%至约2%范围内的脂质或它们的组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述干细胞群集表达CD9、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81，但是缺少对CXCR4的表达。
17.根据权利要求15所述的方法，其中用于扩增的所述环境还包含Rho激酶抑制剂。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述分化环境为约0.1%至约2%的牛血清白蛋白。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述多能细胞选自诱导多能干细胞、人脐带组织来源的细胞、孤雌生殖体、人胚胎干细胞（hES）以及羊水来源的细胞。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法产生胰腺前体细胞，所述胰腺前体细胞表达β细胞转录因子。
21.根据权利要求15所述的方法，其中所述转录因子为PDX1和/或NKX6.1。
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