CN105675559A - 一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法，包括：荧光探针的制备、标准曲线的建立以及多巴胺浓度的测定。本发明以发光效率高的碳点作为荧光探针，利用多巴胺对碳点的荧光增强作用，进行痕量多巴胺的高效检测，其检测限达0.1pM,检测灵敏度高、选择性好。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感领域。更具体地，涉及一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法。
背景技术
多巴胺是一种儿茶酚胺，在人体中充当重要的神经递质的角色，其在人体中的含量与人的行为联系比较紧密。这种物质的浓度直接影响人类的学习和记忆能力。多巴胺含量偏高或偏低均有可能引起一系列疾病。多巴胺在帕金森症病人体内的含量很低，小于10-10mol/L。多巴胺的含量测定在生理功能和临床方面都有很大的意义。目前报道的多巴胺检测方法有多种。其中高效液相色谱法的检测成本高，灵敏度较低(J.Chromatogr.2000,179-189)，可见光分光光度法比较稳定，但是其检测限高(Analyst.2009,1692-1698)，而采用电化学法检测多巴胺时，存在抗坏血酸和尿酸的干扰问题(Biosens.Bioelectron.2012,55-60)。
碳点作为近年来新兴的碳纳米材料，在用于多巴胺检测方面有一定的进展。ZhouXi等(Biosens.Bioelectron.2015,404-410)利用聚吡咯ppy与石墨烯量子点复合后作为多巴胺的检测探针，其检测限达10pM；MaoYan等(Biosens.Bioelectron.2012,55-60)利用分子印迹的方法将碳点包裹在二氧化硅印迹薄膜作为多巴胺的检测探针，其检测限达1.7nM。
3-氨基苯硼酸可以用来识别有儿茶酚结构的物质，LiuSiyu等(Biosens.Bioelectron.,2013,47,379-384)利用3-氨基苯硼酸通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与CuInS2量子点连接，从而使得CuInS2量子点表面连接硼酸根功能基团。这种检测多巴胺方法的检测限可达0.2μmol/L。
上述几种方法的灵敏度无法满足多巴胺检测的临床要求，因此可以实现更低的灵敏度，快速的检测多巴胺的方法成为了研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法。该方法利用多巴胺对荧光碳点的特异性增强的现象，通过制备特定的荧光探针，在碳点表面实现含氮、硼官能团的双功能化，实现了痕量多巴胺的检测，提高了检测灵敏度，从而实现对于浓度低至0.1pM的多巴胺的检测。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法，包括如下步骤：
1)荧光探针的制备；
2)将荧光探针水溶液加入一系列浓度已知的不同浓度的多巴胺水溶液中，测量混合溶液的荧光强度，以多巴胺水溶液浓度对数为横坐标，测得的混合溶液的荧光强度为纵坐标，建立多巴胺浓度与荧光强度之间的标准曲线；
3)按步骤2)所述的方法，将与步骤2)中相同浓度的荧光探针水溶液加入到待测多巴胺水溶液中，测量混合溶液的荧光强度，将测得的荧光强度值代入上述步骤2)所得标准曲线，得到待测多巴胺水溶液的浓度。
优选地，步骤1)中所述荧光探针为碳点，所述碳点的粒径为1-10nm；所述碳点中碳：硼：氮元素的摩尔比为10:5:2-80:4:7。
优选地，步骤1)中所述荧光探针由如下方法制备：以3-氨基苯硼酸为前驱体，完全溶解于去离子水中，得到前驱体水溶液；再将前驱体水溶液转移到水热反应釜中，进行水热合成反应，在150-250℃下反应8-16h后，将所得物过滤、干燥，得到的粉末状碳点即为荧光探针。
所述碳点为硼酸根和氨基双功能化的碳点，发光效率高。
优选地，步骤2)中，标准曲线的建立包括如下步骤：向水中按体积比2.5:1-10:1加入荧光探针水溶液，作为空白对照组；向一系列已知浓度的多巴胺水溶液中加入荧光探针水溶液，充分混合，得到标准溶液；检测标准溶液中的荧光强度，并与空白对照组对比，以多巴胺水溶液浓度对数为横坐标，测得的混合溶液的荧光强度为纵坐标，绘制出多巴胺浓度与荧光强度之间的标准曲线。
优选地，步骤2)中，所述荧光探针水溶液的浓度为0.001-0.01g/L；更优选地，所述荧光探针水溶液的浓度为0.005g/L；所述多巴胺水溶液的浓度在0.1pM-1μM之间；所述荧光探针水溶液与多巴胺水溶液的体积比为1:2.5-1:10。
优选地，步骤2)、3)中，所述荧光强度使用检测波长范围涵盖200-900nm的荧光分光光度计测量。
优选地，步骤2)、3)中，荧光强度的测量过程中，使用的激发波长为250-400nm；更优选地，激发波长为365nm；荧光发射峰的波长为350-560nm；优选地，荧光发射峰的波长为418nm。
优选地，步骤3)中，所述荧光探针水溶液与多巴胺水溶液的体积比为1:2.5-1:10。
优选地，所述方法检测多巴胺浓度的检测限为0.1pM。
本发明的有益效果如下：
本发明中以硼酸根和氨基原位双功能化碳点为荧光探针，在此基础上，利用多巴胺对碳点的荧光增强现象，通过制备特定的荧光探针，进行痕量多巴胺的检测。本发明检测限达0.1pM，与以往使用其他碳点作为多巴胺检测探针相比，其检测限低两个数量级，而且具有很好的选择性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出实施例1中制备得到的碳点荧光探针的高分辨率TEM图。
图2示出实施例13多巴胺溶液和碳点溶液充分混合后标准溶液的荧光强度，激发波长为365nm。
图3示出实施例13所建立的荧光强度变化与多巴胺浓度对数之间的拟合曲线。其中，x表示的是横坐标：多巴胺浓度的对数；y1、y2表示的是纵坐标：对应的荧光强度变化。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1碳点荧光探针1的合成
称取3-氨基苯硼酸粉末置于小烧杯中，加入20mL去离子水并搅拌至固体完全溶解，得到前驱体水溶液；将均一分散的溶液转移到聚四氟乙烯水热反应釜中，在烘箱中进行反应，150℃反应8h得到碳点的棕黄色溶液；将得到的棕黄色溶液过滤，除去大颗粒杂质；之后将初产物溶液旋蒸，得到硼酸根和氨基原位双功能化的碳点固体粉末，所得碳点即为荧光探针，碳点中碳：硼：氮元素的摩尔比为10:5:2；利用透射电子显微镜表征所得的碳点粉末，其粒径范围为2nm-5nm；合成碳点的荧光发射峰的波长在350nm-550nm，峰值在410nm。
实施例2碳点荧光探针2的合成
称取3-氨基苯硼酸粉末置于小烧杯中，加入20mL去离子水并搅拌至固体完全溶解，得到前驱体水溶液；将均一分散的溶液转移到聚四氟乙烯水热反应釜中，在烘箱中进行反应，150℃反应16h得到碳点的棕黄色溶液；将得到的棕黄色溶液过滤，除去大颗粒杂质；之后将初产物溶液旋蒸，得到硼酸根和氨基原位双功能化的碳点固体粉末，所得碳点即为荧光探针，碳点中碳：硼：氮元素的摩尔比为30:7:4；利用透射电子显微镜表征所得的碳点粉末，其粒径范围为1nm-6nm；合成碳点的荧光发射峰波长在395nm-550nm，峰值在414nm。
实施例3碳点荧光探针3的合成
称取3-氨基苯硼酸粉末置于小烧杯中，加入20mL去离子水并搅拌至固体完全溶解，得到前驱体水溶液；将均一分散的溶液转移到聚四氟乙烯水热反应釜中，在烘箱中进行反应，250℃反应8h得到碳点的棕黄色溶液；将得到的棕黄色溶液过滤，除去大颗粒杂质；之后将初产物溶液旋蒸，得到硼酸根和氨基原位双功能化的碳点固体粉末，所得碳点即为荧光探针,碳点中碳：硼：氮元素的摩尔比为42:5:4；利用透射电子显微镜表征所得的碳点粉末，其粒径范围为3nm-5nm；合成碳点的荧光发射峰波长在385nm-560nm，峰值在418nm。
实施例4碳点荧光探针4的合成
称取3-氨基苯硼酸粉末置于小烧杯中，加入20mL去离子水并搅拌至固体完全溶解，得到前驱体水溶液；将均一分散的溶液转移到聚四氟乙烯水热反应釜中，在烘箱中进行反应，250℃反应16h得到碳点的棕黄色溶液；将得到的棕黄色溶液过滤，除去大颗粒杂质；之后将初产物溶液旋蒸，得到硼酸根和氨基原位双功能化的碳点固体粉末，所得碳点即为荧光探针,碳点中碳：硼：氮元素的摩尔比为32:5:4；利用透射电子显微镜表征所得的碳点粉末，其粒径范围为2nm-10nm。
实施例5标准曲线的建立
取实施例1中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针1，配制成浓度为0.001g/L的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点溶液，取1ml配制的碳点溶液加入2.5ml水中，作为空白对照组；另外取10支离心管中再分别加入1ml配制的碳点溶液，然后10支离心管中依次加入2.5ml浓度为0.1pM-1μM的多巴胺水溶液，充分混合后，得到的碳点与多巴胺的标准溶液静置2分钟后，用荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度(激发波长为365nm)，并与空白对照组对比，绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例6标准曲线的建立
取实施例2中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针2，配制成浓度为0.001g/L的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点溶液，取1ml配制的碳点溶液加入2.5ml水中，作为空白对照组；另外取10支离心管中再分别加入1ml配制的碳点溶液，然后10支离心管中依次加入2.5ml浓度为0.1pM-1μM的多巴胺水溶液，充分混合后，得到的碳点与多巴胺的标准溶液静置2分钟后，用荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度(激发波长为365nm)，并与空白对照组对比，绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例7标准曲线的建立
取实施例3中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针3，配制成浓度为0.001g/L的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点溶液，取1ml配制的碳点溶液加入2.5ml水中，作为空白对照组；另外取10支离心管中再分别加入1ml配制的碳点溶液，然后10支离心管中依次加入2.5ml浓度为0.1pM-1μM的多巴胺水溶液，充分混合后，得到的碳点与多巴胺的标准溶液静置2分钟后，用荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度(激发波长为365nm)，并与空白对照组对比，绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例8标准曲线的建立
取实施例4中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针4，配制成浓度为0.001g/L的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点溶液，取1ml配制的碳点溶液加入2.5ml水中，作为空白对照组；另外取10支离心管中再分别加入1ml配制的碳点溶液，然后10支离心管中依次加入2.5ml浓度为0.1pM-1μM的多巴胺水溶液，充分混合后，得到的碳点与多巴胺的标准溶液静置2分钟后，用荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度(激发波长为365nm)，并与空白对照组对比，绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例9标准曲线的建立
取实施例4中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针4，配制成浓度为0.005g/L的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点溶液，取1ml配制的碳点溶液加入2.5ml水中，作为空白对照组；另外取10支离心管中再分别加入1ml配制的碳点溶液，然后10支离心管中依次加入2.5ml浓度为0.1pM-1μM的多巴胺水溶液，充分混合后，得到的碳点与多巴胺的标准溶液静置2分钟后，用荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度(激发波长为365nm)，并与空白对照组对比，绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例10标准曲线的建立
取实施例4中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点碳点荧光探针4，配制成浓度为0.01g/L的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点溶液，取1ml配制的碳点溶液加入2.5ml水中，作为空白对照组；另外取10支离心管中再分别加入1ml配制的碳点溶液，然后10支离心管中依次加入2.5ml浓度为0.1pM-1μM的多巴胺水溶液，充分混合后，得到的碳点与多巴胺的标准溶液静置2分钟后，用荧光光度计检测标准溶液中的荧光强度(激发波长为365nm)，并与空白对照组对比，绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例11标准曲线的建立
同实施例6，仅将激发波长改变为250nm,绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例12标准曲线的建立
同实施例6，仅将激发波长改变为400nm,绘制出荧光强度与多巴胺浓度之间的标准曲线。
实施例13待测样品中多巴胺的测定
将人体血清溶液稀释10倍后，向其中加入已知浓度的多巴胺溶液，然后取实施例1中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针1，碳点溶液和待检测溶液的体积比为1:2.5，检测其荧光强度，得到荧光强度变化值；将其代入实施例5中的标准曲线中，计算得到多巴胺的浓度；检测限达10nM。
实施例14待测样品中多巴胺的测定
将人体血清溶液稀释10倍后，向其中加入已知浓度的多巴胺溶液，然后取实施例2中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针2，碳点溶液和待检测溶液的体积比为1:2.5，检测其荧光强度，得到荧光强度变化值；将其代入实施例6中的标准曲线中，计算得到多巴胺的浓度；检测限达1nM。
实施例15待测样品中多巴胺的测定
将人体血清溶液稀释10倍后，向其中加入已知浓度的多巴胺溶液，然后取实施例3中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针3，碳点溶液和待检测溶液的体积比为1:2.5，检测其荧光强度，得到荧光强度变化值；将其代入实施例7中的标准曲线中，计算得到多巴胺的浓度；检测限达1nM。
实施例16待测样品中多巴胺的测定
将人体血清溶液稀释10倍后，向其中加入已知浓度的多巴胺溶液，然后取实施例4中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针4，碳点溶液和待检测溶液的体积比为1:2.5，检测其荧光强度，得到荧光强度变化值；将其代入实施例8中的标准曲线中，计算得到多巴胺的浓度；检测限达0.1nM。
实施例17待测样品中多巴胺的测定
将人体血清溶液稀释50倍后，向其中加入已知浓度的多巴胺溶液，然后取实施例4中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针4，碳点溶液和待检测溶液的体积比为1:2.5，检测其荧光强度，得到荧光强度变化值；将其代入实施例8中的标准曲线中，计算得到多巴胺的浓度；检测限达10nM。
实施例18待测样品中多巴胺的测定
将人体血清溶液稀释100倍后，向其中加入已知浓度的多巴胺溶液，然后取实施例4中的硼酸根和氨基原位双功能化的碳点荧光探针4，碳点溶液和待检测溶液的体积比为1:2.5，检测其荧光强度，得到荧光强度变化值；将其代入实施例8中的标准曲线中，计算得到多巴胺的浓度；检测限达0.1pM。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种利用碳点作为荧光探针检测多巴胺的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)荧光探针的制备；
2)将荧光探针水溶液加入一系列浓度已知的不同浓度的多巴胺水溶液中，测量混合溶液的荧光强度，以多巴胺水溶液浓度对数为横坐标，测得的混合溶液的荧光强度为纵坐标，建立多巴胺浓度与荧光强度之间的标准曲线；
3)按步骤2)所述的方法，将与步骤2)中相同浓度的荧光探针水溶液加入到待测多巴胺水溶液中，测量混合溶液的荧光强度，将测得的荧光强度值代入上述步骤2)所得标准曲线，得到待测多巴胺水溶液的浓度；
步骤1)中，所述荧光探针为碳点，所述碳点的粒径为1-10nm；所述碳点中碳：硼：氮元素的摩尔比为10:5:2-80:4:7。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述荧光探针由如下方法制备：以3-氨基苯硼酸为前驱体，完全溶解于去离子水中，得到前驱体水溶液；再将前驱体水溶液转移到水热反应釜中，进行水热合成反应，在150-250℃下反应8-16h后，将所得物过滤、干燥，得到的粉末状碳点即为荧光探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，标准曲线的建立包括如下步骤：向水中按体积比2.5:1-10:1加入荧光探针水溶液，作为空白对照组；向一系列已知浓度的多巴胺水溶液中加入荧光探针水溶液，充分混合，得到标准溶液；检测标准溶液中的荧光强度，并与空白对照组对比，以多巴胺水溶液浓度对数为横坐标，测得的混合溶液的荧光强度为纵坐标，建立多巴胺浓度与荧光强度之间的标准曲线。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述荧光探针水溶液的浓度为0.001-0.01g/L；优选地，所述荧光探针水溶液的浓度为0.005g/L；所述多巴胺水溶液的浓度在0.1pM-1μM之间；所述荧光探针水溶液与多巴胺水溶液的体积比为1:2.5-1:10。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤2)、3)中，所述荧光强度使用检测波长范围涵盖200-900nm的荧光分光光度计测量。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)、3)中，荧光强度的测量过程中，使用的激发波长为250-400nm；优选地，激发波长为365nm；荧光发射峰的波长为350-560nm；优选地，荧光发射峰的波长为418nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述荧光探针水溶液与多巴胺水溶液的体积比为1:2.5-1:10。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法检测多巴胺浓度的检测限为0.1pM。
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