CN105670971A - 一株克氏梭状芽胞杆菌jzz及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株克氏梭状芽胞杆菌JZZ及其应用。本发明从窖泥中分离获得一株克氏梭状芽胞杆菌JZZ。通过实验证明：该菌株为己酸高产菌株，兼具有温度、乙醇耐受性，其有益效果是适应了传统窖池发酵体系的温度变化和乙醇浓度变化，且适应性强，能够满足传统白酒酿造工艺中生产要求，不仅提高了白酒的品质，也提高了酿酒生产效益。

Description

一株克氏梭状芽胞杆菌JZZ及其应用

技术领域

本发明涉及一株克氏梭状芽胞杆菌JZZ及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

中国酿酒历史悠久，酒文化底蕴深厚。在漫长的酿酒实践中，形成了各具特色、风格迥异的多种香型的白酒，其中，浓香型白酒具有芳香浓郁、绵柔甘洌、香味协调、入口甜、落口绵、尾净余长等特点，成为白酒行业的主流产品。构成浓香型酒典型风格的主体成分是己酸乙酯，这种成分含量高且香气突出。传统固态白酒酿造的一个重要特征是利用窖泥微生物参与发酵过程。浓香型窖泥中关键功能菌己酸菌在香气形成中起到了至关重要的作用。己酸菌的代谢产物己酸，在白酒中不仅起到呈香、助香、减少酒体刺激的作用，而且还可以与粮醅发酵产生的酒精发生酯化反应，生成己酸乙酯等香味物质，从而改善浓香型白酒的风味及口感。

己酸菌不是生物学分类意义上的物种名称，是酿酒行业中约定俗成一个称谓，包含多个微生物种属，这类微生物的共同特征是代谢产物有己酸，可作为己酸乙酯合成的前体物。检索文献可知，已有大量的己酸菌分离、纯化、鉴定以及应用研究，其中，在菌种鉴定方面，除专利201010238106报道1例己酸菌(ClostridiumbutyriCum)GK13菌株外，其余报道的己酸菌均为克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)。

克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)早在上世纪30年代就被发现，是一个典型的具有产己酸能力的菌种。但实际生产中，由于各地的自然环境、气候条件、窖泥理化特性、酿酒工艺的不同，各酒企分离己酸菌的习性各不相同。己酸菌工业菌株的习性不同，在实际生产中的表现就会有很大差异，这直接关系到酿造的产酒效果。

在白酒酿造过程中，伴随着粮醅发酵进程发酵体系内部会发生显著变化。其中一个因素是发酵体系温度变化，下料时初始温度一般为20℃左右，随着淀粉降解放热，逐渐上升至35℃-40℃，之后会维持在这个水平或略有下降，当然，在窖池的不同位置，局部温度也会不同，有的甚至超过40℃以上，另外，由于窖池开放式生产，受季节、早晚、阴晴的天气变化，发酵体系温度也将产生变化；另一因素是发酵体系中乙醇浓度变化，随着发酵进程，乙醇浓度逐渐积累，发酵后期达到3-4％，局部可能更高。发酵体系温度和乙醇浓度变化，要求窖泥功能菌具有一定程度的温度、乙醇的耐受性。目前，尚未有较高温度耐受性和乙醇耐受性的高产己酸菌报道。

己酸菌的高己酸产量是浓香型白酒酿造的一直追求目标。有的己酸菌菌株虽然高产，但对温度变化和乙醇浓度变化适应性不强，导致生产效果不稳定。由于发酵体系处于动态变化之中，己酸菌对温度、乙醇耐受性也应列入考查指标，这对于己酸菌菌株工业生产中的稳定性以及适应传统酿造工艺具有重大意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZ。

本发明提供的克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZ的保藏编号为CGMCCNo.11948。

本发明的菌株JZZ的分类命名为克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)，该菌株于2015年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.11948。

本发明的另一个目的是提供上述克氏梭状芽孢杆菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂的新用途。

本发明提供了上述克氏梭状芽孢杆菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在如下1)-4)中任一种中的应用：

1)生产己酸和/或己酸乙酯；

2)制备生产己酸和/或己酸乙酯的产品；

3)酿酒；

4)制备酿酒的产品；所述产品具体为窖泥。

本发明还有一个目的是提供一种生产己酸的方法。

本发明提供的生产己酸的方法包括如下步骤：在含有乙醇的体系中发酵培养权利要求1所述的克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZ，收集发酵产物，得到己酸。

上述方法中，所述发酵培养的温度为36-40℃。

上述方法中，所述发酵培养的温度为37℃。

上述方法中，所述含有乙醇的体系中的乙醇体积百分含量为2-10％；所述含有乙醇的体系为乙酸钠液体培养基；乙酸钠液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度为：乙酸钠0.5％(质量分数)、酵母膏0.1％(质量分数)、硫酸镁0.02％(质量分数)、磷酸氢二钾0.04％(质量分数)、硫酸铵0.05％(质量分数)、碳酸钙1％(质量分数)，乙醇2％(质量分数)。

上述方法中，所述含有乙醇的体系中的乙醇体积百分含量为2％。

上述方法中，

所述发酵培养的时间为6-8天；

所述发酵培养的时间具体为7天。

上述方法中，在收集发酵产物后还包括如下步骤：有机溶剂萃取所述发酵产物，收集有机相得到己酸。

上述方法在生产己酸和/或生产己酸乙酯和/或酿酒中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明从窖泥中分离获得一株克氏梭状芽胞杆菌JZZ。通过实验证明：该菌株为己酸高产菌株，兼具有温度、乙醇耐受性，其有益效果是适应了传统窖池发酵体系的温度变化和乙醇浓度变化，且适应性强，能够满足传统白酒酿造工艺中生产要求，不仅提高了白酒的品质，也提高了酿酒生产效益。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的乙酸钠培养基配制方法：

1)乙酸钠液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度为：乙酸钠0.5％(质量分数)、酵母膏0.1％(质量分数)、硫酸镁0.02％(质量分数)、磷酸氢二钾0.04％(质量分数)、硫酸铵0.05％(质量分数)、碳酸钙1％(质量分数)，乙醇2％(质量分数)，灭菌后添加，pH为6.5。称量溶解后，121℃灭菌30min。

2)乙酸钠固体培养基为在乙酸钠液体培养基中加2％(质量分数)的琼脂得到的培养基。

实施例1、克氏梭状芽胞杆菌JZZ的获得

一、菌株的分离

1、窖泥的发酵培养

将乙酸钠液体培养基装入试管中(装液量90％)，向试管中加入1g老窖泥(安徽金种子酒业股份有限公司)，80℃水浴热处理10min，密封，37℃发酵培养7d，得到发酵液。

2、发酵液的纯化培养

用***萃取步骤1获得的发酵液，并用硫酸铜显色法初筛，蓝色为阳性；取初筛为阳性的菌液1mL，添加到装有乙酸钠液体培养基的试管中，80℃水浴热处理10min，密封，37℃培养7d；重复纯化2-3次，得到纯化后发酵液。

3、纯化后发酵液

将步骤2获得的纯化后发酵液进行梯度稀释，并在乙酸钠固体培养基中涂平板，37℃培养7d后，挑取单个菌落进行发酵，并通过气相色谱对发酵培养得到的菌液中乙酸含量进行检测。最终筛选到一株高产己酸的菌株，将其命名为JZZ。

二、JZZ的鉴定

1、形态鉴定

经对JZZ菌株的形态观察，JZZ菌株的形态如下：直杆状，芽抱端生或近端生，在固体培养基培养7d后，形成圆形菌落，表面平滑、乳白色，有光泽，边缘整齐，不透明。

2、分子鉴定

提取菌株JZZ的总DNA作为模板，采用通用引物27f和1492r进行PCR扩增，得到含有菌株JZZ16SrDNA保守区的片段并对其进行测序。引物序列如下：

27f(上游引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492r(下游引物)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

JZZ菌株的16SrDNA序列测定由上海美吉生物医药科技有限公司(上海市浦东新区康新公路3399号时代医创园3号楼，021-51875086)完成。菌株JZZ16SrDNA为序列1。并将其在GeneBank中进行比对。

在GeneBank的比对结果显示，JZZ与克氏梭状芽孢杆菌(JN592512.1)的16SrDNA基因的相似性达到100％。

3、菌株的保藏

根据形态特征和分子鉴定结果和分析，将菌株JZZ确定为克氏梭状芽孢杆菌。菌株JZZ的分类命名为克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)，该菌株于2015年12月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.11948。

实施例2、克氏梭状芽胞杆菌JZZ在高产己酸中的应用

一、JZZ的发酵培养及产己酸量检测

1、JZZ的发酵培养

(1)将实施1获得的JZZ菌株在装有乙酸钠液体培养基的试管中进行活化培养，37℃活化培养7d，得到种子液；

(2)将种子液5％接种量接种到装有乙酸钠液体培养基的三角瓶中进行发酵培养，37℃发酵培养7d，得到发酵液。

2、己酸气相检测条件

1)己酸提取

将步骤1获得的发酵液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到过滤液；取过滤液500μL于5mL容量瓶中，加***定容至5mL，充分振荡2min，静置1min，吸取上层***萃取液，即为己酸，备测。实验设置多次重复，重复实验样品分别编号为1、2、3、4、5、6。

2)检测

通过气相色谱对***萃取液中的己酸含量进行检测。色谱条件为：进样口温度240℃；柱箱起始温度：100℃(1min)；升温速率：10℃/min；柱温终温度：220℃(2min)；检测器温度250℃；气体流量：氢气40mL/min，空气400mL/min，尾吹气30mL/min；进样方式：分流进样，分流比20:1；进样体积：1μL。

测定结果见表1，从表中可以看出，己酸产量最高为4.55g/L，平均值为4.36g/L，表明JZZ菌株为稳定的己酸高产菌株。

表1、克氏梭状芽胞杆菌JZZ产己酸量检测

二、JZZ发酵产己酸的温度摸索

将步骤一中的(1)获得的种子液按照5％的接种量接种到装有乙酸钠液体培养基的三角瓶(装样量90％)中，分别在36℃、37℃、38℃、39℃和40℃的条件下厌氧培养7d，分别得到发酵液，按照上述一中提取己酸并运用气相色谱法检测各个发酵液中的己酸产量，每个样品三个重复。

检测结果如表2所示，从表2中可以看出，在37℃条件下，己酸产量最高，为4.36g/L±0.09g/L，为产乙酸的最适温度；39℃、40℃时的己酸产量分别是37℃时的94％、88％，但也仍然表现出高产特性，说明JZZ菌株具有较高温度耐受特性。

表2、不同温度条件下克氏梭状芽胞杆菌JZZ的己酸产量

三、JZZ发酵产己酸的反应体系乙醇含量摸索

将步骤一中的(1)获得的种子液按照5％的接种量接种到装有乙酸钠液体培养基的三角瓶(装样量90％)，并向三角瓶中添加乙醇，使乙醇在培养基中的体积分数分别为2％、4％、6％、8％和10％，37℃厌氧培养7d后，分别得到发酵液。按照上述一中提取己酸并运用气相色谱法检测各个发酵液中的己酸产量，每个样品三个重复。

检测结果表明，乙醇浓度(体积分数)为2％时，己酸产量为4.36±0.09g/L，随着乙醇质量分数的逐渐升高，己酸产量逐渐下降，乙醇浓度(体积分数)为4％、6％时的己酸产量分别是乙醇浓度(体积分数)为2％时的95％、90％。JZZ菌株在乙醇浓度(体积分数)为6％时，JZZ菌株仍然表现出高产乙酸的特性，说明JZZ菌株具有较高乙醇耐受特性。

表3、不同浓度乙醇下克氏梭状芽胞杆菌JZZ的己酸产量

Claims (10)

1.一株克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZ，其保藏编号为CGMCCNo.11948。

2.权利要求1所述的克氏梭状芽孢杆菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在如下1)-4)中任一种中的应用：

1)生产己酸和/或己酸乙酯；

2)制备生产己酸和/或己酸乙酯的产品；

3)酿酒；

4)制备酿酒的产品。

3.一种生产己酸的方法，包括如下步骤：在含有乙醇的体系中发酵培养权利要求1所述的克氏梭状芽孢杆菌(Clostridiumkluyveri)JZZ，收集发酵产物，得到己酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为36-40℃。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为37℃。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含有乙醇的体系中的乙醇体积百分含量为2-10％。

7.根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于：所述含有乙醇的体系中的乙醇体积百分含量为2％。

8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：

所述发酵培养的时间为6-8天；

所述发酵培养的时间具体为7天。

9.根据权利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于：在收集发酵产物后还包括如下步骤：有机溶剂萃取所述发酵产物，收集有机相得到己酸。

10.权利要求3-9中任一所述的方法在生产己酸和/或生产己酸乙酯和/或酿酒中的应用。