发明内容
本发明人针对现有的碘制剂存在的缺陷开展研究,最终研制出了一种高浓度碘消毒液,其特点是碘的浓度高,储存稳定性好,不含壬基酚聚氧乙烯醚,对环境友好。将本发明的碘消毒剂应用于挤奶器消毒和奶牛******炎的控制,具有安全性高、对乳制品的品质无影响、杀菌高效、无皮肤刺激性、易清洗无黄染、无难闻气味等优点。本发明的碘消毒剂制备方法简单、稳定可靠、制备周期短、对设备无特殊要求、非常适合工业化生产。
本发明的技术方案之一是:提供一种高浓度碘消毒液,该消毒液使用的是不含壬基酚聚氧乙烯醚类的非离子表面活性剂作为碘载体,碘载体和碘的质量之比为5:1~20:1,它包括下列各质量(g)与体积(ml)百分比的各组分:
优选地,该消毒液包括下列各质量(g)与体积(ml)百分比的各组分:碘1~5%,助溶剂1~5%,载体非离子表面活性剂8~70%,润肤剂1.5~25%,pH调节剂0.8~20%,水加至100%;更优选地,该消毒液包括下列各质量(g)与体积(ml)百分比的各组分:碘1~3%,助溶剂1~3%,载体非离子表面活性剂8~30%,润肤剂5~25%,pH调节剂0.8~2%,水加至100%。
本发明的消毒液还可以包括皮肤粘合剂及碘络合物,其质量(g)与体积(ml)百分比为0.5~20%,优选地为4~12%。
所述的皮肤粘合剂及碘络合物可选自羟丙甲纤维素,聚维酮,淀粉等中的一种或几种的组合物,优选聚维酮k25,聚维酮k30,聚维酮k90。例如,为了使得本产品在皮肤上留存时间长以达到更好的消毒效果,比如做成***消毒剂,可加入皮肤粘合剂及碘络合物;用作喷剂时,可以考虑不加皮肤粘合剂及碘络合物,以利于产品分散。
本发明的消毒液,所述助溶剂为卤化物,优选地,选自溴化钾,溴化钠,碘化钾,碘化钠中的一种或几种的组合物。更优选地,所述助溶剂为碘化钾,因碘单质能够与碘离子结合生成碘三负离子,在配制碘水过程中,加入碘化钾就可使其在水中的溶解度增加,其反应式为:I2+KI=KI3。
其中,载体非离子表面活性剂选自脂肪醇聚氧乙烯醚和丙二醇嵌段聚醚中的一种或几种的组合物。优选地,脂肪醇聚氧乙烯醚选自具有如下结构的脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或几种的组合物:脂肪醇碳链长度为12~16和聚氧乙烯基数(EO)为9~11个;丙二醇嵌段聚醚优选为泊洛沙姆407,普流尼克P123,普流尼克P105,普流尼克P65中的一种或几种的组合物。本发明人偶然发现,在众多型号的脂肪醇聚氧乙烯醚中,适用于配制碘消毒液的型号并不多,使用上述型号的脂肪醇聚氧乙烯醚或丙二醇嵌段聚醚配制的碘消毒液能够达到含碘量高,稳定性好的效果。
所述的润肤剂选自多元醇,溶于水的聚氧乙烯羊毛脂中的一种或几种的组合物,优选地,多元醇选自为甘油、丙二醇、山梨醇中的一种或多种;溶于水的聚氧乙烯羊毛脂选自为PEG-50羊毛脂,PEG-60羊毛脂,PEG-75羊毛脂中的一种或多种。
经过反复实验,本发明的碘消毒剂的杀菌效果在酸性条件下效果最强,因此加入酸作为pH调节剂,本发明所述的pH调节剂可为有机酸和无机酸的一种或几种的组合物;优选地,为柠檬酸,乳酸,硫酸,山梨酸,磷酸,盐酸中的一种或多种,更优选为柠檬酸、硫酸或者磷酸一种或多种,其用量优选0.8~2%;本发明的碘消毒液其pH优选为1.0~6.0,更优选地为1.5~3.0。
本发明的技术方案之二是:提供高浓度碘消毒液的一种制备方法,该方法包括以下步骤:
a.取碘载体非离子表面活性剂加入一定量水中加热至50~60℃溶解;
b.向步骤a所得溶液中依次加入助溶剂、碘和pH调节剂,再于45℃~60℃下,加热30分钟~60分钟搅拌溶解;
c.向步骤b所得溶液中加入润肤剂;
d.可选地,加入皮肤粘合剂和络合物;
e.余量水定容,搅拌混合均匀,即得所述的高浓度碘消毒液。
本发明所述的高浓度碘消毒液的制备方法,首先称取非离子表面活性剂,加入一定量水中加热至50~60℃,形成澄清溶液,再加入碘化钾后,形成了对碘最大增溶和助溶的溶液体系,碘在该溶液体系中溶解度达到最大,这样做的目的是可以缩短碘的溶解时间,并且可以配制更高浓度的碘制剂,产品更加稳定。如果我们颠倒次序,按照CN102335128A公开的碘制剂的制备方法,则制备耗时明显变长,需要在60℃进行5~6小时。而在CN102697803A中公开的奶牛***消毒剂的制备方法,其制备温度高达80℃,而碘一般在60℃以上就会开始升华,因此物料的加入次序对于碘消毒液的制备尤为重要。
本发明所述的高浓度碘消毒液,其性状为棕红色或棕褐色粘稠均相液体,使用方式可取原液直接使用,或用冷水稀释使用。使用方法可以作为浸剂、喷剂、洗剂、涂剂等使用。
本发明所述的高浓度碘消毒液,其适用于皮肤组织的抗菌消毒,特别适用于产奶动物******炎的预防和治疗。
本发明所述的高浓度碘消毒液经过40℃,60℃、4500lx光照条件十天影响因素试验(实验方法和步骤参见2010版《兽药典》--稳定性指导原则)。实验结果显示,60℃下,十天后碘含量仅下降0.5%,4500lx光照条件下,十天后碘含量无下降趋势。将本发明的碘消毒液与市售产品碘灭杀(商品名:UDDERSAN,由澳大利亚塔斯曼TASMAN公司生产)的稳定性对比,本发明的消毒液更加稳定,本发明的碘消毒液与市售产品碘灭杀的影响因素试验结果见表1。
表1:本发明的碘消毒液与市售产品碘灭杀影响因素试验结果
本发明的高浓度碘消毒液的有益效果是:
1、本发明提供了一种制备高浓度碘消毒剂的非离子表面活性剂载体,替代壬基酚聚氧乙烯醚,解决了壬基酚聚氧乙烯醚的安全性问题,从化学结构上分析壬基酚聚氧乙烯醚之所以有毒性是由于分子一端中含有壬基酚结构,壬基酚是一种公认的环境激素,其降解非常缓慢。而壬基酚聚氧乙烯醚在自然环境中会分解成壬基酚。其干扰生物内分泌,对生殖***有毒性。因此本发明解决了国内外市场中碘消毒剂中壬基酚聚氧乙烯醚产生的生物毒性作用及对环境造成的不良影响等重大问题;
2、本发明提供了制备高浓度碘消毒剂的安全性功能载体非离子表面活性剂-脂肪醇聚氧乙烯醚和/或丙二醇嵌段聚醚,脂肪醇聚氧乙烯醚结构中脂肪醇链段结构为C12~C16脂肪醇,聚氧乙烯基数(EO)为9~11个;丙二醇嵌段聚醚优选为泊洛沙姆407,普流尼克P123,普流尼克P105,普流尼克P65。同时加入了pH调节剂,增强了本发明产品的消毒效果。应用本消毒剂中碘浓度高,作为动物挤奶器和***、皮肤、粘膜、伤口、创面清洗消毒时,能有效抑制病原菌的生长繁殖,且其浓度高,稀释倍数更大,用量小,运输成本更低。
3、本消毒剂在高温、强光照条件十天影响因素试验证明其化学稳定性良好,故常温环境下贮存可以保证较长的有效期。
4、本消毒剂无皮肤刺激性,适量润肤剂能改善动物***、周围皮肤状况,特别适合秋冬季节和干燥环境,其无黄染易清洗,无残留。
5、本发明制备方法简单,不需要特殊的反应装置,反应条件温和不苛刻,整个生产工时短,适合工业化大生产。
6、动物******炎是由病原微生物感染而引起的***组织及***发炎的一种疾病,加上隐性***炎,发病率极高。在我国,每年用于治疗奶牛***炎的费用近亿元人民币,在美国由此造成奶牛业经济损失高达20亿美元。而本消毒剂制备简单,成本低廉,尤其适用于动物******炎的控制。
实施例1
本实施实例消毒剂包含以下组分(单位:质量(g)与体积(ml)百分比)
制备100升本发明碘消毒液的方法:称取8kg非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚(C13脂肪醇+11EO)加入10kg水中加热到50℃,溶解完全后依次加入2.5kg碘化钾、1.0kg碘、2.0kg柠檬酸,在50℃温度条件下边加热边搅拌30分钟到1个小时至碘完全溶解形成均一溶液,再依次加入5.0kg山梨醇、0.5kg聚氧乙烯羊毛脂(PEG-75羊毛脂)搅拌溶解,冷却后加入10.0kg丙二醇和余量水,搅拌均匀即得所述的高浓度碘消毒液,可用于体表伤口喷雾消毒和***浸剂。
实施实例2
本实施实例消毒剂包含以下组分(单位:质量(g)与体积(ml)百分比)
制备100升本发明碘消毒液的方法:称取50kg非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚(C16脂肪醇+9EO)加入10kg水中加热到55℃,溶解完全后依次加入3.0kg碘化钾、3.0kg碘、2.0kg盐酸,在60℃温度条件下边加热边搅拌30分钟到1个小时至碘完全溶解形成均一溶液,再依次加入2.5kg山梨醇、15.0kg甘油搅拌溶解,冷却后加入1.0kg羟丙甲纤维素和余量水,搅拌均匀即得所述的高浓度碘消毒液,可以用于环境和挤奶器消毒。
实施实例3
本实施实例消毒剂包含以下组分(单位:质量(g)与体积(ml)百分比)
制备100升本发明碘消毒液的方法:称取70kg非离子表面活性剂丙二醇嵌段聚醚(pluronicP105)加入1kg水中加热到60℃,溶解完全后依次加入1.0kg碘化钾、5.0kg碘、20kg硫酸,在45℃温度条件下边加热边搅拌30分钟到1个小时至碘完全溶解形成均一溶液,再依次加入0.5kg聚氧乙烯羊毛脂(PEG-50羊毛脂)、1kg甘油搅拌溶解,冷却后加入余量水,搅拌均匀即得所述的高浓度碘消毒液,可以用于环境和挤奶器消毒。
实施实例4
本实施实例消毒剂包含以下组分(单位:质量(g)与体积(ml)百分比)
制备100升本发明碘消毒液的方法:称取20kg非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚(C15脂肪醇+9EO)加入10kg水中加热到55℃,溶解完全后依次加入2.0kg碘化钠、2.0kg碘、1.5kg磷酸,在50℃温度条件下边加热边搅拌30分钟到1个小时至碘完全溶解形成均一溶液,再依次加入5.0kg山梨醇、10kg甘油搅拌溶解,冷却后加入10kg聚维酮k30和余量水,搅拌均匀即得所述的高浓度碘消毒液,可用于体表伤口喷雾消毒和***浸剂。
实施实例5
本实施实例消毒剂包含以下组分(单位:质量(g)与体积(ml)百分比)
制备100升本发明碘消毒液的方法:称取60kg非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚(C14脂肪醇+11EO)加入5kg水中加热到55℃,溶解完全后依次加入1.5kg碘化钾、5.0kg碘、15kg柠檬酸,在50℃温度条件下边加热边搅拌30分钟到1个小时至碘完全溶解形成均一溶液,再依次加入5.0kg丙二醇、5.0kg甘油搅拌溶解,冷却后加入余量水,搅拌均匀即得所述的高浓度碘消毒液。可以用于环境和挤奶器消毒。
实施实例6
本实施实例消毒剂包含以下组分(单位:质量(g)与体积(ml)百分比)
制备100升本发明碘消毒液的方法:称取30kg非离子表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚(C12脂肪醇+11EO)加入5kg水中加热到55℃,溶解完全后依次加入1.0kg碘化钾、1.0kg碘、0.8kg柠檬酸,在50℃温度条件下边加热边搅拌30分钟到1个小时至碘完全溶解形成均一溶液,再依次加入5.0kg丙二醇、5.0kg甘油搅拌溶解,冷却后加入余量水,搅拌均匀即得所述的碘消毒液。本发明实施例产品可以直接用于***消毒。
本发明消毒剂,经消毒试验效果表明一种高浓度碘消毒液经稀释后碘浓度为5000ppm对试验菌金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,白色葡萄球菌在1.5分钟到5分钟内灭菌率达100%。本发明所述实施实例的碘消毒液经皮肤刺激性试验表明对皮肤无刺激性,其无黄染易清洗,在奶牛***炎预防和治疗取得了很好的效果。
为了验证本发明碘消毒液的实际效果,取实施例4的碘消毒液进行临床试验。
实验一、对奶牛***的刺激性试验
取实施例4得到的碘消毒液,参考美国FDA《GuidanceforIndustry-CVMGFI#50:TargetAnimalandHumanFoodSafety,DrugEfficacy,EnvironmentalandManufacturingStudiesforTeatAntisepticProducts》指南和按照农业部《兽用消毒剂鉴定技术规范》(试行)的要求,中国农业大学动物医学院于2015年03月对本发明产品进行了奶牛***刺激性试验。
随机选择12头无***炎症状的健康奶牛,其中6头经产奶牛,6头初产奶牛开展试验。在用药前1周、用药过程中(4周)和用药后1周内,每日观察并记录奶牛日产奶量、***症状和***外观等指标。分别于给药前第3日,连续给药4周的每周三和停药后1周的周三当日共6次采集奶样进行体细胞数测定。试验奶牛在开始用药前第6日和试验最后1周第6日分别无菌采集各乳区奶样进行细菌检测。用药前第6日和试验最后1周第6日对奶牛***皮肤状态的评价主要从颜色、水肿、干燥程度、皲裂和角化程度来评价并进行打分。
1.1、试验动物选择
随机选择12头无***炎症状的健康奶牛,其中6头经产奶牛,6头初产奶牛。经产奶牛和初产奶牛中各有3头奶牛在泌乳早期,日产奶量约为25kg/日,3头奶牛在泌乳晚期日产奶量约为15kg/日。受试奶牛在2周前未进行***消毒剂处理。受试奶牛***经兽医检查和评分处于健康正常状态。
1.2、临床观察
在用药前1周、用药过程中(4周)和用药后1周内,每日观察并记录奶牛日产奶量(以高产奶牛和低产奶牛为单位)、***症状和***外观等指标。
1.3、试验奶牛处理
(1)预处理期为用药前1周。此期间进行基准观测,确保所有受试奶牛都是正常的。在开始用药前第6日,对全部奶牛4个乳区的奶样进行采集并进行细菌分离培养,此步骤主要用于判断如果***出现刺激现象是由于病原微生物还是药物因素导致的。
(2)处理期于第2周开始。用药按照指南和本发明产品说明书进行,所有的4个乳区在挤奶完成后同时接受本发明产品的处理。受试奶牛各***挤奶后,用装有适量本发明产品的浸杯浸渍整个***约30秒。12头受试奶牛每次挤奶均需按上述方法进行用药持续4周。
(3)后处理期于给药第4周后开始并持续1周。在此期间,受试奶牛每次挤奶后,各***不作任何消毒处理。
1.4、观测指标
(1)奶牛***皮肤状态评价
由于机器挤奶会造成***变化,***管口的变化也可以在挤奶后观察到,理论上应选择在挤奶杯移除时进行***观察。但是,由于***会在挤奶期间受到牛奶的浸润,使***皮肤被滋润从而掩盖皮肤的变化。因此,调查***用药对***的具体影响,本试验中选择在挤奶和***清洗前观察(参考依据:Hillerton,J.E.,J.CooperandJ.Morelli.(2007)Preventionofbovinemastitisbyapostmilkingteatdisinfectantcontainingacidifiedsodiumchlorite.JournalofDairyScience90:1201-1208)
对奶牛***皮肤状态的评价主要从颜色、水肿、干燥程度、皲裂和角化程度来评价,评价标准见表1.4
在用药前第6日和用药4周后停止用药的第6日对受试奶牛的所有***进行评分。
表1.4、奶牛***皮肤刺激性反应评分标准
注:出现严重焦痂或腐蚀皮肤情况应单独记录和描述。制定参考依据(U.S.FoodandDrugAdministration.CVMGFI#50TargetAnimalandHumanFoodSafety,DrugEfficacy,EnvironmentalandManufacturingStudiesforTeatAntisepticProducts)。
(2)牛奶体细胞计数
牛奶的体细胞计数采用KD-400型牛奶体细胞计数仪进行测定(购自北京康达智信科技有限公司)。该体细胞计数仪可测定的牛奶中的体细胞数范围为9万-150万个体细胞数/毫升牛奶。分别于给药前第3日,连续给药4周的每周3和停药后1周的周3日共6次采集奶样进行体细胞数测定,样品采集在中午奶牛挤奶时进行,各***消毒完毕套上挤奶设备之前,先挤掉前三把奶,随后采集约50mL奶样后立即进行体细胞数的测定并记录结果。
(3)细菌分离培养
试验奶牛在开始用药前第6日和试验最后1周第6日分别无菌采集各乳区奶样进行细菌检测。采集奶样时先用消毒毛巾清洁各***(较脏的***,先用温热水冲洗后再用消毒毛巾清洁),手工挤奶,弃掉前三把奶后,再用灭菌试管收集奶样10-15ml,低温保送至中国农业大学国家兽药安全评价中心微生物实验室进行细菌学检查。奶样先以2000-3000r/min离心10分钟,弃去上层液体,无菌挑取管底沉淀物接种至绵羊鲜血琼脂培养基上,置37℃恒温箱培养24-28h,观察菌落形态。取不同形态的菌落接种选择性培养基(麦康凯琼脂、甘露醇氯化钠琼脂、KF链球菌琼脂等),进一步观察其生长情况并做细菌染色镜下观察,初步归属细菌并做好记录。
1.5、数据处理
使用SPSS软件统计分析试验数据,采用单因素方差分析(OneWayANOVA)方法,比较各组奶牛用药前(第1周)、用药后观察周(第6周)***评分和每一周奶牛体细胞数的差异显著性。
1.6、试验结果与分析
1.6.1、奶牛***皮肤刺激性反应评分结果
在用药前第6日和用药4周后停止用药的第6日对受试奶牛的所有***进行评分,对奶牛***皮肤状态的评价主要从颜色、水肿、干燥程度、皲裂和角化程度来评价,统计分析结果见表1.6.1。数据可见,在连续用药4周后,不同组别奶牛***病变评分差异均不显著,说明本发明产品对奶牛***不会导致临床可见的明显***病变。
表1.6.1、试验奶牛用药前第6日和用药4周后停止用药的第6日***评分比较(n=12)
1.6.2、牛奶体细胞数
各组试验奶牛在用药前1周和用药过程中(每周)和停药后1周每周采集奶样进行体细胞数检测,统计分析结果见表1.6.2。数据可见:在用药前1周和用药第2周和停药后1周,各组试验奶牛的体细胞数均小于50万个/mL(我国判定奶牛桶奶奶样体细胞数如超过该数值即为发生***炎),用药前后差异均不显著(P>0.05),均在正常范围之内,证明消毒剂对奶牛***无明显刺激性,不会导致体细胞数的改变。
表1.6.2:试验奶牛用药前1周、用药过程中和用药后1周乳汁SCC检测值比较(n=12)
注:1)在同一行,标注*号表示组内不同时间的数值比较差显著(P<0.05);
2)在同一列,具小写字母上标的数值表示相互之间差异显著(P<0.05)。
1.6.3、试验奶牛各乳区用药前后病原菌分离鉴定结果
统计各组试验奶牛用药前和用药后的主要病原菌分离(株)数,结果见表1.6.3。用药前,12头奶牛(48个乳区)采集奶样共分离出3株细菌,主要为链球菌(3株,32.9%)。用药后,48个乳区的奶样仅分离出1株链球菌,其它奶样均未分离出病原菌。
表1.6.3各组试验奶牛用药前后主要病原菌分离(株)数统计
注:1)链球菌包括无乳链球菌、停乳链球菌、***链球菌、牛链球菌、屎链球菌等,其中无乳链球菌和停乳链球菌为优势菌;2)葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、松鼠葡萄球菌等,其中金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌为优势菌;3)其他肠杆菌包括克雷伯菌、变形杆菌、柠檬酸杆菌、克吕沃尔氏菌等。
1.6.4、高产奶牛和低产奶牛在用药前1周第6日和停止用药1周后第6日平均产奶量
以高产奶牛和低产奶牛进行分组,在用药前1周第6日和停止用药1周后第6日分别统计每组奶牛的平均产奶量,结果见下表1.6.4,从表中可以看出,应用本发明产品后对奶牛产奶量无明显改变,因此不会导致明显的经济损失。
表1.6.4试验奶牛用药前1周后用药后1周产奶量比较(n=6)
注:1)在同一行,标注*号表示组内不同时间的数值比较差显著(P<0.05);2)在同一列,具小写字母上标的数值表示相互之间差异显著(P<0.05)。
1.7、结论
上述结果显示,奶牛用药前和用药后牛奶体细胞数差异不显著,奶牛***评分无显著性改变,奶牛用药前后病原菌分离数极少,用药前后对奶牛产奶量无明显影响,因此可以得出以下结论:***健康的奶牛用药4周后,本发明产品对泌乳奶牛***皮肤无刺激性,可以安全应用。
实验二、本发明产品对导致奶牛***炎常见病原菌杀菌效能试验
本发明产品实施例4,按照农业部《兽用消毒剂鉴定技术规范》(试行)的要求,采用定量法分别测定本发明产品五种稀释比例(1:1;1:2;1:3;1:4;1:5)的杀菌消毒效能。以金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、停乳链球菌(CVCC588)和无乳链球菌(CVCC1886)制备细菌繁殖体;经鉴定试验确定以3%的硫代硫酸钠作为专利发明产品的中和剂;每个稀释比例测定5次,最后对作用后的混合液进行10倍梯度稀释,选适宜稀释度悬液(每一稀释度接种3个平板)进行活菌计数,计算杀菌率(Pt)、杀灭指数(KI)、平均杀菌率(P)、杀菌率标准误(Sp)、杀菌率95%可信限等。
试验结果显示:
1)本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。
2)本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对大肠杆菌(8099)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。
3)本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对停乳链球菌(CVCC588)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。
4)本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对无乳链球菌(CVCC1886)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。
上述试验结果表明,本发明产品即使按1:5的比例稀释,在体外对可引起奶牛***炎的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、停乳链球菌和无乳链球菌也均具有很好的杀灭作用。具体试验结果见后。
2.1本发明产品的中和剂鉴定试验结果
中国农业大学提供的中和剂鉴定试验结果分别见表2.1.1-表2.1.4。表中数据显示,委托方提供的中和剂均可有效中和本发明产品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、停乳链球菌和无乳链球菌的杀灭作用,而其本身及其与本发明产品的中和产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、停乳链球菌和无乳链球菌的生长无明显影响。因此确定该中和剂可用于本发明产品对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、停乳链球菌和无乳链球菌的消毒杀菌试验。
表2.1.1、中和剂对本发明产品杀灭金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的中和作用试验结果
注:1)杀灭试验温度为20℃±1℃,持续时间为5min;2)菌落数为3个平板计数的平均值;
3)下表同。
表2.1.2、中和剂对本发明产品杀灭大肠杆菌(8099)的中和作用试验结果
表2.1.3、中和剂对本发明产品杀灭停乳链球菌(CVCC588)的中和作用试验结果
注:1)杀灭试验温度为20℃±1℃,持续时间为5min;2)菌落数为3个平板计数的平均值;
3)下表同。
表2.1.4、中和剂对本发明产品杀灭无乳链球菌(CVCC1886)的中和作用试验结果
2.2、本发明产品对金黄色葡萄球菌的杀灭试验结果
表2.2数据显示,本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。上述结果表明,本发明产品在小于1:5的稀释比例条件下,在体外对金黄色葡萄球菌均具有很好的杀灭作用。
表2.2、不同稀释比例本发明产品对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)的定量杀灭试验结果
注:1)每一种稀释比例分别进行五次试验;2)杀灭试验温度为20℃±1℃,持续时间为5min;
3)试验组和对照组菌落数均为3个平板计数的平均值;4)下表同。
2.3、本发明产品对大肠杆菌的杀灭试验结果
表2.3数据显示,本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对大肠杆菌(8099)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。上述结果表明,本发明产品在小于1:5的稀释比例条件下,在体外对大肠杆菌均具有很好的杀灭作用。
表2.3、不同稀释比例本发明产品对大肠杆菌(8099)的定量杀灭试验结果
注:1)每一种稀释比例分别进行五次试验;2)杀灭试验温度为20℃±1℃,持续时间为5min;
3)试验组和对照组菌落数均为3个平板计数的平均值;4)下表同。
2.4、本发明产品对停乳链球菌的杀灭试验结果
表2.4数据显示,本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对停乳链球菌(CVCC588)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。上述结果表明,本发明产品在小于1:5的稀释比例条件下,在体外对停乳链球菌均具有很好的杀灭作用。
表2.4、不同稀释比例本发明产品对停乳链球菌(CVCC588)的定量杀灭试验结果
注:1)每一种稀释比例分别进行五次试验;2)杀灭试验温度为20℃±1℃,持续时间为5min;
3)试验组和对照组菌落数均为3个平板计数的平均值;4)下表同。
2.5、本发明产品对无乳链球菌的杀灭试验结果
表2.5数据显示,本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对无乳链球菌(CVCC1886)的平均杀菌率为100%;杀灭指数无穷大。上述结果表明,本发明产品在小于1:5的稀释比例条件下,在体外对无乳链球菌均具有很好的杀灭作用。
表2.5、不同稀释比例本发明产品对无乳链球菌(CVCC1886)的定量杀灭试验结果
注:1)每一种稀释比例分别进行五次试验;2)杀灭试验温度为20℃±1℃,持续时间为5min;
3)试验组和对照组菌落数均为3个平板计数的平均值;4)下表同。
2.6、试验结论
综合上述试验结果,可获如下结论:
本发明产品实施例4,在体外对可引起奶牛***炎的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、停乳链球菌和无乳链球菌均具有很好的杀灭作用。本发明产品分别按1:1;1:2;1:3;1:4;1:5的比例稀释,在20℃±1℃条件下持续作用5min,对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、停乳链球菌(CVCC588)和无乳链球菌(CVCC1886)的平均杀菌率均为100%。
实验三、本发明产品对奶牛***消毒效果的评估试验
本发明产品实施例4,根据美国国家***炎协会(NationalMastitisCouncil)推荐的《基于降低自然的新***内感染判定奶牛***浸液疗效的建议试验方案》、Hogan等文献报道和农业部颁布的有关临床试验技术规范要求,农业部颁布的有关试验临床实验技术规范要求,中国农业大学于2015年3-8月在北京某养殖有限公司,对本发明产品进行了奶牛***消毒效果的评估试验。
在试验奶牛场通过临床检查对泌乳牛群进行***炎摸底诊断,筛选60头未患***炎的健康奶牛进入本试验。然后采集试验奶牛的奶样进行体细胞数(SCC)和细菌检测,根据各奶牛的日均奶产量、乳汁体细胞数、***内感染病原种类按分层随机方法将60头泌乳奶牛分成2个组,即:试验药物组(I组)和空白对照组(II组),每组30头牛。试验药物组奶牛在每次挤奶前后使用本发明产品(按说明书推荐使用)进行***药浴;空白对照组奶牛***在每次挤奶前后均不做任何***消毒处理。试验持续12周。试验奶牛的生产管理按该奶牛场常规进行。试验奶牛每日早、中、晚挤奶三次,采用机械式挤奶。挤奶前先刷洗清洁牛体,然后用温热湿毛巾擦洗***,继而用装有消毒液的塑料浸杯对每个***药浴30秒左右再用毛巾擦干,手工挤出并弃掉前三把奶后套上奶杯进行挤奶,挤完奶并取下奶杯后使用相同消毒液对***进行再次药浴。每次挤奶完毕按奶牛场常规清洗消毒挤奶设备,***药浴消毒液每日更换。
3.1在试验过程中观测下述指标:
1)各组奶牛在试验开始(第0周)和试验结束(12周)时的日均奶产量;2)各组奶牛在试验第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周牛奶SCC计数;3)试验开始(第0周)和试验结束(第12周)时奶牛***感染病原菌种类(包括病原菌头检出率和乳区检出率);4)试验奶牛临床型***炎发生情况。综合上述指标,评价奶牛使用本发明产品药浴***对***新感染的预防作用。具体试验结果见后。
3.2试验结果与分析
3.2.1、试验奶牛的选择及分组
经奶样体细胞数(SCC)测定,参考奶牛的日均奶产量等因素,从泌乳牛群中选出60头未患***炎的健康奶牛(SCC≤50万/mL),按分层随机方法分成I组(试验药物组)、II组(空白对照组)开展试验。
3.2.2、试验奶牛用药前后的SCC值
试验药物组(I组)和空白对照组(II组)奶牛在第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周采集奶样测定的SCC数值统计分析结果见表3.2.2。数据显示,I组奶牛在持续用药12周后的SCC值保持稳定,无显著性差异(P>0.05);试验开始时(第0周)I、II组之间奶牛的SCC值比较无明显差异(P>0.05);试验第5周之后,II组奶牛SCC值极显著提高(P<0.01),逐渐超过50×104个/mL。试验第7周,II组奶牛SCC值升至70×104个/mL左右,致使该组奶牛所产牛奶不能正常售卖,通过与养殖场的协商,于试验第8周对II组奶牛使用受试药物本发明产品进行***药浴;试验第12周,II组奶牛SCC值仍高于50×104个/mL,而且与第0周有极显著差异(P<0.01)。
上述结果表明,在挤奶前后持续使用专利发明产品进行***药浴,可稳定奶牛乳汁的SCC值在正常水平。
3.2.3、试验奶牛用药前后的日奶产量
表3.2.3为试验药物组(I组)和空白对照组(II组)奶牛在试验开始(第0周)和试验结束时(第12周)的日均奶产量统计分析结果。表中数据可看出,I组奶牛的日均奶产量在持续用药12周后略有下降(P>0.05);而II组奶牛的日均奶产量在试验第7周和12周极显著下降(P<0.01)。表中数据还可看出,用药前(第0周)I、II组之间奶牛的日均奶产量均无显著性差异(P>0.05),但在试验第7周和12周,I组奶牛的日均奶产量与II组均存在极显著差异(P<0.01)。
上述结果表明,在挤奶前后持续使用本发明产品,对健康奶牛的泌乳性能有稳定作用。
3.2.4、试验奶牛用药前后***内感染菌检出情况
在用药第0周和用药第12周试验奶牛采集奶样分离鉴定感染菌。统计感染菌检测结果,在用药第0周,60头奶牛240个乳区中有9头奶牛13个乳区存在***内感染,共检出23株菌,其中无乳链球菌占47.8%(11/23),停乳链球菌占30.4%(7/23),金葡菌占4.3%(1/23),大肠杆菌占13.0%(3/23),其他细菌占4.3%(1/23)。I、II组奶牛检出菌株数分别为10、13,各组奶牛***感染的病原菌种类基本一致。用药12周后,有22头奶牛31个乳区仍存在***内感染,共检出51株菌,其中无乳链球菌占47.1%(24/51),停乳链球菌占35.3%(18/51),金葡菌占3.9%(2/51),大肠杆菌占11.8%(6/51),其他细菌占2.0%(1/51)。I、II组奶牛检出菌株数分别为13、38。比较用药第0周和用药第12周感染菌的分离鉴定结果,可发现用药12周后I奶牛***内感染菌无明显变化,而II组奶牛***内感染菌的株数明显上升。
上述结果表明,在挤奶前后持续使用本发明产品进行***药浴,均可显著降低感染菌对奶牛***的侵染,而不进行***药浴的空白组奶牛,侵入***的病原菌增加。
3.2.5、试验奶牛用药前后的***感染率
根据***内感染菌的分离鉴定结果,统计各组奶牛在试验第0周、第7周和试验第12周***感染的头感染率和乳区感染率,结果见表3.2.5。
在试验第0周:I组(试验药物组,)、II组(空白对照组)奶牛的头感染率分别为10.0%、10.0%,乳区感染率分别为5.0%、5.8%,两组之间的头感染率和乳区感染率无显著性差异(P>0.05)。
在试验第7周后:与试验第0周相比,I组奶牛的头感染率和乳区感染率无显著性差异;而II组奶牛的头感染率和乳区感染率发生了极显著上升(P<0.01),分别达到66.7%和27.5%。由于试验所处季节属于夏季并开始进入雨季,牛场卫生环境有所下降,空白对照组(II组)的体细胞在试验第7周升至70×104个/mL左右,致使该组奶牛所产牛奶不能正常售卖,通过与养殖场的协商,于试验第8周对II组奶牛使用受试药物本发明产品进行***药浴。
在试验第12周:与试验第0周和第7周相比,II组奶牛的头感染率和乳区感染率发生了极显著上升(P<0.01),且与I组奶牛差异极显著(P>0.05)。II组奶牛自试验第8周用药后,第12周头感染率和乳区感染率与第7周相比,分别下降至53.3%和19.2%,但差异不显著(P>0.05)。
表3.2.5各组奶牛在试验第0周、第7周和第12周的***内病原菌感染情况
注:1)头感染率=***内检出感染菌牛数/受检牛数;
2)乳区清除率=检出感染菌乳区数/受检乳区数;
3)表中同一列数值上标相同大写字母表示相互之间差异极显著(P<0.01),上标相同小写字母表示相互之间差异显著(P<0.05);
4)*表示第12周乳区感染率与第0周比较差异极显著(P<0.01);
5)#表示第12周头感染率与第0周比较差异极显著(P<0.01)。
上述结果表明,在挤奶前后持续使用本发明产品进行***药浴,均可有效阻止感染菌对奶牛***的侵染,控制奶牛***的感染率;对于已经发生***炎的奶牛,其治疗效果不明显,但是作为一种消毒剂来长期预防***炎的发生,其效果是稳定且优良的。本发明产品安全,是奶牛***炎防治的最优选择。
3.2.6、试验奶牛用药后***感染的清除与新增感染情况
根据感染菌的分离鉴定结果,统计I组和II组奶牛在用药7周和12周后***内感染的清除率和新增感染率,结果见表3.2.6。数据可见,用药7周后,I组出现了3头新感染牛,头新增感染率仅11.1%(3/27),出现了3个新感染乳区,乳区新增感染率仅2.6%(3/114);II组出现了17头新感染牛和26个新感染乳区,头新增感染率和乳区新增感染率分别达到63.0%(17/27)和23.0%(26/113)。I组和II组比较,头新增感染率和乳区新增感染率差异极显著(P<0.01)。用药12周后,与第0周相比,I组未见新感染牛,出现了2个新感染乳区,乳区新增感染率仅1.8%(2/114);II组出现了13头新感染牛和16个新感染乳区,头新增感染率和乳区新增感染率分别达到48.1%(13/27)和14.2%(16/113);II组与I组比较,头新增感染率和乳区新增感染率差异极显著(P<0.01)。
表3.2.6试验奶牛用药7周和用药12周后***新增感染率
注:1)头新增感染率=(用药第0周未检出***感染菌而用药后检出***感染菌牛数)/用药第0周未检出***感染菌牛数;
2)乳区新增感染率=(用药第0周未检出感染菌而用药后检出感染菌乳区数/用药第0周未检出感染菌乳区数;
3)同列数值之间,具相同大写字母上标表示差异极显著(P<0.01);具相同小写字母上标表示差异显著(P<0.05)。
上述结果表明,在挤奶前后持续使用本发明产品进行***药浴,对奶牛***内病原菌新感染有明显预防作用,但对已有感染无明显清除作用。
3.3、结论
综合本试验结果,可获如下结论:
1.在挤奶前后使用本发明产品对***进行药浴消毒,可有效预防病原菌侵染奶牛***并促进***对已感染病原菌的清除,从而减少奶牛隐性型***炎甚至临床型***炎的发生,降低乳汁体细胞数,稳定奶牛的泌乳性能。
2.按推荐用法与用量使用本发明产品对奶牛***进行药浴消毒,其疗效显著。
3.鉴于本发明产品具有上述功效,推荐奶牛场使用该消毒剂,以加强奶牛***炎的防控,提高奶产量和牛奶质量,而且更加稳定安全,是奶牛***炎预防的最优选择。