CN105663043A - 131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了131I标记的环RGD肽靶向的阿霉素热敏纳米脂质体及其制备与应用，属于医药技术领域，131I标记的环RGD肽靶向阿霉素热敏纳米脂质体的结构为：131I与c(RGDyk)相偶联，c(RGDyk)则通过DSPE-PEG-NHS活化***包裹阿霉素及磁性颗粒的脂质体的DPPC分子层中。本发明主要应用于乳腺癌肿瘤的治疗诊断及预防，其优点是以脂质体为载体，以整合素αvβ3为作用靶点，将化疗、放疗、热疗三者有机结合起来，并通过c(RGDyk)靶向性作用于肿瘤，不仅能提高肿瘤的杀伤率，而且对正常机体的影响较小，尽量满足了特异性、安全性、有效性等方面的要求。

Description

131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体及其制备与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体及其制备与应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其传统的治疗方法是手术切除结合放化疗。然而这一疗法对于早期乳腺癌效果较好，对于发现较晚或者已发生转移的病人，则仅能以放化疗为主，其治愈率较低。而传统的化学药物主要以被动运输的方式扩散至肿瘤细胞，细胞毒副作用较大。随着脂质体技术的发展，一些研究发现将一些配体修饰在脂质体的表面，通过其与肿瘤细胞或肿瘤新生血管细胞表面的过表达受体相结合，从而靶向性运输药物到肿瘤细胞附近，有效的提高细胞对药物的摄取能力，并且降低对正常组织的毒副作用。RGD(精-甘-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp)序列，能够与细胞表面的整合素相结合，从而抑制血管新生。Pasqualin等人则发现含有二硫键的环RGD肽(cRGD)对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制作用是普通线形RGD肽的10-200倍。通过将cRGD偶联至脂质体表面，使脂质体包裹的抗肿瘤药物递送至肿瘤附近，可以特异性杀伤肿瘤细胞。近年来，新生血管抑制剂与化疗药物联合***，已经取得了良好的临床治疗效果。
而肿瘤热疗为一项临床上广泛使用的治疗技术，通过利用物理能量在人体组织中产生的热效应，使组织细胞的温度升高，进而加速肿瘤细胞死亡的方法。然而对于位于身体内部较深部位的肿瘤热疗，由于人体组织对电磁波具有反射作用，电磁波能量难以集中到肿瘤部位，热效应分布不均匀，无法保证恒温，这些问题都限制了热疗在肿瘤治疗中的应用。而研究者发现，脂质体形式的纳米药物可以在包裹药物的同时搭载纳米级的Fe3O4粒子，对肿瘤进行热疗联合化疗，有效的提高肿瘤杀伤率。研究者Jordan通过注射含有磁性纳米粒悬液的C3H大鼠乳腺癌移植瘤的肿瘤内，通过交变磁场(AMF)的局部照射，磁性微粒吸收能量而升温至47℃，热疗效果显著，肿瘤得到了有效的控制。
发明内容
鉴于以上问题，本发明的主要目的在于提供一种131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体及其制备与应用。
本发明通过长循环脂质体为载体，包裹纳米级的Fe3O4粒子和阿霉素，并以131I标记的c(RGDyk)修饰，将化疗、放疗、热疗组合到一起，并对肿瘤组织进行靶向性治疗。
本发明采用如下技术方案：
本发明的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体的结构为：131I与c(RGDyk)相偶联，c(RGDyk)则通过DSPE-PEG-NHS活化***包裹阿霉素及磁性颗粒的脂质体的DPPC分子层中。
所述的c(RGDyk)是含有精-甘-天冬氨酸序列的环肽，其中含有精-甘-天冬氨酸序列，并包含酪-赖氨酸，由酰胺键-成环，所述的赖氨酸由其他氨基酸取代。
其化疗药物阿霉素由其他抗乳腺癌的水溶性药物替代，水溶性药物包括吉西他滨或米托蒽醌。
本发明的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体的制备方法包括以下步骤：
(1)采用改良化学共沉淀法制备铁氧磁性纳米粒子：
在N2气条件下将FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O按n(Fe2+)∶n(Fe3+)摩尔比2-3：1溶于去离子水中，将浓度为0.4-1.0mol/L的氨水缓慢滴入该溶液中，同时通过磁力搅拌混匀，通过水解产生黑色的晶体粒子，再继续滴入氨水，调pH至8.0-10.0，使溶液呈碱性，加热使磁铁分散开，离心并洗涤，将沉淀加入到酸性溶液中，在温度60-80℃下经胶溶化处理得到棕色胶体溶胶；
(2)碘化反应：
称取c(RGDyk)溶于甲醇/乙醇、pH＝7.4的PBS中，配制成10mg/mL的RGD环肽溶液，甲醇/乙醇与PBS体积比为1：10-50；称取氯胺-T和偏重亚硫酸钠，配制成相应溶液，将131I加入至RGD环肽溶液与氯胺-T混合液中，每500-50000μCi131I对应0.5-1mgRGD环肽溶液和10-50μg氯胺-T，室温反应0.5-30min，加入偏重亚硫酸钠终止反应，偏重亚硫酸钠与氯胺-T重量比为1：1；将产物对应与15ml水混合过C18柱，并再用15ml水淋洗C18柱2-4次，每次均测定C18柱的放射活性，淋洗至其放射性不发生改变为止，再用盐酸乙醇作为淋洗液，回收标记上131I的c(RGDyk)；
(3)脂质体制备：
称取DSPE-PEG-NHS溶于新鲜蒸馏的无水无氨的DMF中终浓度为1mg-5mg/ml，将DSPE-PEG-NHS溶液逐滴加入131I-cRGD溶液中，DSPE-PEG-NHS与131I-cRGD的摩尔比为3∶1-2，室温避光搅拌，1天后终止反应，反应液置Mw2000透析袋中，于去离子水中透析12h后冷冻干燥；
准确称量DPPC、胆固醇、DSPE-PEG-NHS-131I-cRGD混合置于茄形瓶中，DPPC、胆固醇与DSPE-PEG-NHS-131I-cRGD的质量比为8：1：1，加入体积比为2:1的氯仿和甲醇的混合液，混合液与胆固醇的体积重量比为9:2ml/mg，，超声混匀后，旋转蒸发形成白色、均匀的脂质薄膜；
配制pH4.0的柠檬酸溶液，加入与柠檬酸溶液质量比为1：60-300的Fe3O4纳米粒子，超声混匀，用此溶液对磷脂膜进行水化，制备脂质体；将所得脂质体加入与柠檬酸溶液体积比为1：100-500的1mg/ml盐酸阿霉素，并用1mol/LNa2HPO4将pH值调至7.0，水浴即得修饰131I-cRGD的载阿霉素磁性脂质体。
步骤(2)中，优选称取c(RGDyk)溶于甲醇与pH＝7.4的PBS中；优选每1000-5000μCi131I对应0.5-1mgRGD环肽溶液和10-50μg氯胺-T，室温反应0.5-10min。
一种包含本发明的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体的药物组合物以131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体为活性组分，与药学上可接受的赋型剂一起制备成药物组合物。
该药物组合物采用制剂领域的常规方法制备成各种剂型，如注射液、粉剂、胶囊、膏剂、霜剂、乳剂或敷贴剂，根据所制备的剂型不同，该药物组合物使用的赋型剂也不同，常用赋型剂包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、渗透压调节剂。
本发明的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体可以应用于单光子发射计算机断层显像或正电子发射计算机断层显像。
本发明的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体可以用于预防、诊断及治疗乳腺癌肿瘤。
本发明的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体其粒径分布于80nm-200nm间，具一定的缓释性和稳定性，包封率为70％-90％，相变温度为42℃，放化纯度达到95％。
本发明利用改良化学共沉淀方法成功的制备了纳米级Fe3O4作为肿瘤热疗的磁感应物质，通过靶向磁感应加热治疗乳腺癌，已取得了较好的效果，并且生物安全性良好。
在前期研究取得初步成效的基础上，本发明制备了同时包裹化疗药物(阿霉素)、磁粒的脂质体，实现以磁流体热疗为基础的腹腔热灌注化疗(IPHC)，努力解决传统IPHC治疗中存在的问题，并在脂质体表面修饰131I的RGD配体以实现靶向性，并将放疗作为辅助治疗方式，将放疗、化疗、热疗结合起来，对肿瘤治疗起着良好效果。
受体和相应配体结合具有特异性强和生物效应明显等特点。利用这一特异性，将配体与化疗药物或放射性核素相结合，通过受体介导作用，可以显著增加药物在病灶的聚集能力、提高疗效，降低毒副作用，从而达到靶向治疗目的。RGD能与细胞表面的整合素相结合，从而抑制血管新生，而用NHS活化的羧基可与氨基反应生成酰胺，使RGD连接到脂质体上。结果显示经过条件优化，经透析后的131I标记的RGD-DPPC脂质体，其透析缓冲液中放射性极低，表明131I标记的RGD基本偶联至DPPC脂质体上，方法简便易行。
与国内外相关研究比较，本发明的优点是以脂质体为载体，以RGD为靶向性肽段，将热疗、化疗、放疗三者有机结合起来。不仅有效解决了肿瘤热疗中的温度问题，还将化疗和放疗集中到肿瘤部位，降低对正常组织的损伤作用，尽量满足了有效性、特异性、安全性三方面的要求。
本发明的积极效果如下：
(1)本发明制备了新化合物131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4liposome)。
(2)本发明131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4liposome)安全无毒副作用，抗肿瘤效果好，预示着良好的使用前景。
(3)本发明的制备工艺较简单，标记物放化纯度高，稳定性良好，可用于***，效果良好。
(4)本发明131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4liposome)可作为活性成分与一些赋型剂一起制备不同药物制剂，并可用于多种肿瘤的治疗。
(5)本发明开拓了一个新的应用领域，可用于乳腺癌肿瘤治疗、SPECT显像。
附图说明
图1为实施例1中制备的脂质体的透射电镜图。
图2为实施例1中制备的脂质体的粒径分布图。
图3为实施例1中制备的脂质体的释药图。
图4为实施例3中不同浓度DOX脂质体对细胞的杀伤效果图。
图5为实施例4中131I-RGD在荷MCF-7肿瘤小鼠体内分布图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进一步说明，但不作对其的限定：
实施例1：阿霉素热敏纳米脂质体(DPPC-DOX-Fe3O4liposome)的制备及表征测定
准确称量胆固醇2mg、DPPC16mg、PEG-DSPE2mg置于茄形瓶中，缓缓加入3ml甲醇和6ml氯仿，短时超声迅速混匀后，旋转蒸发成圆形、白色、均匀的脂质薄膜。在10mL0.3mol/L柠檬酸溶液(pH4.0)中加入30mgFe3O4，短时超声混匀后对脂膜进行水化，制备脂质体。将所制得脂质体中加入盐酸阿霉素，并用1mol/LNa2HPO4将pH值调节至7.0，55℃水浴30min即制得磁性热敏阿霉素脂质体。
取脂质体稀释10倍后于铜网点样，待干燥后使用透射电镜(TEM)观察脂质体表征及粒径大小，并用粒径分析仪测定其粒径大小。
取1ml脂质体，于37℃摇床中用PBS透析，分别在2、4、6、8、12、16、24、48小时后打开透析袋取出100μL，并加入100μLPBS补足。取出的100μL于480nm处测定DOX含量，绘制脂质体稳定性曲线，表面制备的脂质体有一定的缓释性。
实施例2：131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4liposome)的制备及标记条件优化
称取1.5mgc(RGDyk)溶于5μL甲醇中，加入45μLPBS，短时超声混匀；称取1mg氯胺-T和偏重亚硫酸钠，配制成10mg/mL相应溶液。取1mCi131I，加入至RGD环肽溶液与氯胺-T混合液中，室温反应5min，加入偏重亚硫酸钠终止反应。将产物与15ml水混合过C18柱，并再用15ml水淋洗C18柱3次，以300μL盐酸乙醇作为淋洗液，回收标记上131I的c(RGDyk)。
准确称取1.5mgDSPE-PEG-NHS溶于新鲜蒸馏的无水无氨的DMF中。将DSPE-PEG-NHS溶液逐滴加入131I-cRGD溶液中，室温避光搅拌，1天后终止反应。反应液置透析袋(Mw2000)中，于去离子水中透析12h后冷冻干燥。准确称量DPPC2mg、胆固醇16mg、DSPE-PEG-NHS-cRGD3mg混合置于茄形瓶中，加入3ml甲醇和6ml氯仿，超声混匀后，旋转蒸发形成白色、均匀的脂质薄膜。在10mL0.3mol/L柠檬酸溶液(pH4.0)中加入30mgFe3O4，短时超声混匀后对脂膜进行水化，制备脂质体。将所制得脂质体中加入盐酸阿霉素，并用1mol/LNa2HPO4将pH值调节至7.0，55℃水浴30min即制得修饰131I-cRGD磁性热敏阿霉素脂质体。
实施例3：不同浓度131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体(131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4liposome)对细胞的影响
在96孔板中加入MCF-7细胞，分为四组，分别加入实例1、2中制备的脂质体、游离DOX和对照组，按DOX浓度加入为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL的相应脂质体和游离药物，48小时后每孔加MTT液20μL，继续培养4小时之后吸尽上清，每孔加入DMSO150μl，振荡溶解10分钟。用酶标仪在492nm下测定OD值。根据公式“细胞抑制率(％)＝(对照组OD值—各实验组OD值)/对照组OD值×100％”计算细胞抑制率，结果见图4。其中游离DOX的IC50约为25μg/mL。结果显示实例2制备的脂质体杀伤作用最高，能抑制乳腺癌细胞生长。
实施例4：131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体在荷瘤裸鼠体内的生物分布
将9只荷瘤裸鼠随机分为3组，每组3只。各组自尾静脉分别注射131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体(100μCi/0.2ml)并于注射后1h和24h各时间点将各组小鼠断颈处死，取血、心、肝、脾、肺、肾、肌肉、膀胱和肿瘤等主要脏器，称湿重、测量放射性计数率值，经放射性衰变校正后计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)。
结果如图5所示：经尾静脉注射131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体后，131I-RGD-DPPC-DOX-Fe3O4脂质体在荷瘤裸鼠体内主要分布于肝脏、肾脏及肿瘤组织，注药后血中放射性留存时间久。肿瘤组织放射性于肿瘤与对侧肌肉(T/M)的放射性比值大于5，说明脂质体靶向性良好。
以上已对本发明的技术内容作了详细说明。对本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理的前提下对它所做的任何显而易见的改动，都不会超出本申请所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于：所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素复合热敏纳米脂质体的结构为：131I与c(RGDyk)相偶联，c(RGDyk)则通过磷脂-聚乙二醇-活性酯(DSPE-PEG-NHS)活化***包裹阿霉素及磁性颗粒的脂质体的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)分子层中。
2.如权利要求1所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于：所述的c(RGDyk)是含有精-甘-天冬氨酸序列的环肽，其中含有精-甘-天冬氨酸序列，并包含酪-赖氨酸，由酰胺键-成环。
3.如权利要求2所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于：所述的赖氨酸可由其他氨基酸取代。
4.如权利要求1所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体，其特征在于：其阿霉素由其他抗乳腺癌的水溶性药物替代，水溶性药物包括吉西他滨或米托蒽醌。
5.131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体制备，其特征在于：所述制备包括以下步骤：
(1)采用改良化学共沉淀法制备铁氧磁性纳米粒子：
在N2气条件下将FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O按n(Fe2+)∶n(Fe3+)摩尔比2-3：1溶于去离子水中，将浓度为0.4-1.0mol/L的氨水缓慢滴入该溶液中，同时通过磁力搅拌混匀，通过水解产生黑色的晶体粒子，再继续滴入氨水，调pH至8.0-10.0，使溶液呈碱性，加热使磁铁分散开，离心并洗涤，将沉淀加入到酸性溶液中，在温度60-80℃下经胶溶化处理得到棕色胶体溶胶；
(2)碘化反应：
称取c(RGDyk)溶于甲醇/乙醇、pH＝7.4的PBS中，配制成10mg/mL的RGD环肽溶液，甲醇/乙醇与PBS的体积比为1：10-50；称取氯胺-T和偏重亚硫酸钠，配制成相应溶液，将131I加入至RGD环肽溶液与氯胺-T混合液中，每500-50000μCi131I对应0.5-1mgRGD环肽溶液和10-50μg氯胺-T，室温反应0.5-30min，加入偏重亚硫酸钠终止反应，偏重亚硫酸钠与氯胺-T重量比为1：1；将产物对应与15ml水混合过C18柱，并再用15ml水淋洗C18柱2-4次，每次均测定C18柱的放射活性，淋洗至其放射性不发生改变为止，再用盐酸乙醇作为淋洗液，回收标记上131I的c(RGDyk)；
(3)脂质体制备：
称取DSPE-PEG-NHS溶于新鲜蒸馏的无水无氨的DMF中，终浓度为1mg-5mg/ml，将DSPE-PEG-NHS溶液逐滴加入131I-cRGD溶液中，DSPE-PEG-NHS与131I-cRGD的摩尔比为3∶1-2，室温避光搅拌，1天后终止反应，反应液置Mw2000透析袋中，于去离子水中透析12h后冷冻干燥；
准确称量DPPC、胆固醇、DSPE-PEG-NHS-131I-cRGD混合置于茄形瓶中，DPPC、胆固醇与DSPE-PEG-NHS-131I-cRGD的质量比为8：1：1，加入体积比为2:1的氯仿和甲醇的混合液，混合液与胆固醇的体积重量比为9:2ml/mg，超声混匀后，旋转蒸发形成白色、均匀的脂质薄膜；
配制pH4.0的柠檬酸溶液，加入与柠檬酸溶液质量比为1：60-300的Fe3O4纳米粒子，超声混匀，用此溶液对磷脂膜进行水化，制备脂质体；将所得脂质体加入与柠檬酸溶液体积比为1：100-500的1mg/ml盐酸阿霉素，并用1mol/LNa2HPO4将pH值调至7.0，水浴即得修饰131I-cRGD的载阿霉素磁性脂质体。
6.如权利要求5所述的制备，其特征在于：步骤(2)中，称取c(RGDyk)溶于甲醇与pH＝7.4的PBS中；每1000-5000μCi131I对应0.5-1mgRGD环肽溶液和10-50μg氯胺-T，20-25℃反应0.5-10min。
7.包含如权利要求1所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物以131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体为活性组分，与药学上可接受的赋型剂一起制备成药物组合物。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为注射液、粉剂、胶囊、膏剂、霜剂、乳剂或敷贴剂。
9.如权利要求1所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体用于单光子发射计算机断层显像或正电子发射计算机断层显像的用途。
10.如权利要求1所述的131I标记的c(RGDyk)靶向阿霉素热敏纳米脂质体用于预防、诊断及治疗乳腺癌肿瘤相关药物中的用途。
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