CN105662905B

CN105662905B - 二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途

Info

Publication number: CN105662905B
Application number: CN201610036173.8A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 王一飞; 何哲; 袁晓
Original assignee: Guangdong Tianjian Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Tianjian Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-01-20
Filing date: 2016-01-20
Publication date: 2018-08-07
Anticipated expiration: 2036-01-20
Also published as: CN105662905A

Abstract

本发明属于医药化妆品领域，公开了二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途。所述的二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤的护肤品为隔离霜，其中隔离霜的组分为：水、丙二醇、甘油、海藻糖、燕麦β‑葡聚糖、二氢杨梅素、C_20‑22醇磷酸酯、聚二甲基硅氧烷、异壬酸异壬酯和羟苯甲酯。本发明通过UVA诱导HaCaT细胞模型试验，证明二氢杨梅素可有效抑制细胞ROS生成及减低凋亡因子、炎症因子的表达，减轻细胞氧化损伤，降低细胞炎症反应和细胞凋亡，达到防治皮肤光损伤的效果。二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤的护肤品或药品中具有广泛的开发前景。

Description

二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途

技术领域

本发明属于医药化妆品领域，具体涉及二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途。

背景技术

随着大气臭氧层遭到日益严重的破坏，紫外线辐射强度增强，且生活水平逐渐提高，户外运动，日光浴的机会增多，导致人们接受过多的紫外线照射，光损害性皮肤病逐渐增多。紫外线按其波长不同可以分为长波紫外线(UVA，320-400nm)，中波紫外线(UVB，280-320nm)和短波紫外线(UVC，200-280nm)三种。其中UVC几乎全部被大气平流层中的臭氧吸收，因此对人体起作用的主要是UVA和UVB。以前的研究认为UVB具有比UVA更强的能量，故UVB被认为是引起皮肤损伤的主要原因。但近几年的最新研究表明UVA在导致皮肤损伤和光老化方面也产生着不容小觑的影响。因为相比于UVB而言，UVA在紫外线辐射中的含量占到了95-98%；而且UVA具有比UVB更强的穿透能力，能够直达皮肤真皮层；最后UVA能够在一年四季都能对人类产生辐射影响，而UVB的辐射影响主要集中在夏季。

目前引起光敏性皮肤病的机制仍未十分清楚，但较为明确的是其发病与炎症反应、免疫反应及细胞凋亡等相关，其中又以角质形成细胞凋亡与光敏性皮肤病的发病关系最为密切。

角质形成细胞（HaCaT）是构成表皮的主要细胞，能够保护机体免受外界物理，化学及微生物的侵害，维持机体内环境的稳定。除此之外现代研究表明角质形成细胞还参与了各种生物学过程如免疫，炎症，增生以及肿瘤转化等。UVA照射皮肤之后能够引起氧自由基的增多，导致皮肤中的ROS过量产生。体内产生的大量ROS能够导致氧化***和抗氧化***的失衡，氧化物来不及清除堆积在体内发生氧化应激反应，造成中性粒细胞炎性浸润和炎性因子的大量释放，此被认为是导致疾病和衰老发生的一个重要因素。另一方面，过量的ROS还可以通过破坏细胞DNA，诱导细胞凋亡破坏酶的活性，破坏线粒体，造成其功能损坏。综上所述，ROS所导致的细胞氧化损伤是UVA致皮肤光老化的一个重要机制。因此为了保护角质形成细胞，维护其正常功能，减轻紫外线引起的氧化损伤是一个重要的方面。

二氢杨梅素(Dihydromyricelin, DHM或DMY)为葡萄属植物藤茶的提取物，是藤茶中主要活性成分黄酮类化合物，分子式为C₁₅H₁₂O₈。现代药理学研究表明，DHM具有清除自由基，抗氧化，抗炎，抗血栓，抗肿瘤、降压、降脂、镇痛等多种生物学活性。迄今为止，未有DHM具有抗UVA所致皮肤损伤作用的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明的二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤产品中的用途，所述的产品为护肤品或药品。

进一步地，所述的护肤品为洁面乳、乳液、精华素、爽肤水、面霜、面膜、隔离霜或原液。

进一步地，所述的药品为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、针剂、粉针剂或软膏剂。

进一步地，本发明所述的护肤品为隔离霜。

进一步地，所述的隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇2-6%、甘油2-6%、海藻糖2-4%、燕麦β-葡聚糖2-4%、二氢杨梅素2-6%、C_20-22醇磷酸酯1-4%、聚二甲基硅氧烷1-4%、异壬酸异壬酯1-4%、羟苯甲酯0.1-0.2%，余量为水。

优选地，所述的隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇4%、甘油4%、海藻糖4%、燕麦β-葡聚糖4%、二氢杨梅素6%、C_20-22醇磷酸酯4%、聚二甲基硅氧烷3%、异壬酸异壬酯3%、羟苯甲酯0.1%，余量为水。

相应地，所述隔离霜的制备方法，包括以下步骤：

S1：取二氢杨梅素、丙二醇、甘油、海藻糖和水置于乳化锅中，加热至75-80℃，搅拌均匀，即得物料A；

S2：取C_20-22醇磷酸酯、聚二甲基硅氧烷和异壬酸异壬酯置于油锅中，加热至75-80℃，搅拌均匀，即得物料B；

S3：将所述物料B加入到S1的乳化锅中与物料A充分搅拌均匀，均质10-15min，冷却；

S4：降温至40℃，加入燕麦β-葡聚糖和羟苯甲酯，充分搅拌均匀，冷却，即得隔离霜。

此外，本发明请求保护含二氢杨梅素的组合物在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途。

本发明通过UVA 诱导HaCaT细胞模型试验，证明DHM能够提高UVA照射后的HaCaT细胞的存活率，使HaCaT细胞的凋亡减少，并降低炎性因子的表达。所述DHM通过减少UVA引起的HaCaT细胞的ROS生成，保护细胞的增殖活性，减轻氧化损伤，并通过干预UVA损伤HaCaT细胞的ROS－MAPKs－NF-κB通路，从而降低炎性因子的表达；此外，DHM通过减少ROS的过度生成，调控线粒体膜上Bcl-2家族蛋白表达，恢复线粒体膜电位，减少caspases和PARP的裂解活化，抑制UVA所致的细胞凋亡，达到防治皮肤光损伤的作用。

本发明的二氢杨梅素在制备防治皮肤光损伤护肤品或药品中的用途，与现有的技术相比，具有以下优势：

（1）二氢杨梅素为葡萄属植物藤茶的提取物，在藤茶的中的含量可高达30%，为纯天然成分，来源丰富，容易获取且安全无刺激；

（2）二氢杨梅素能有效地抑制UVA诱导HaCaT细胞ROS生成，减轻氧化损伤，降低炎性因子、凋亡因子的表达，抑制细胞凋亡，达到防治皮肤光损伤的作用，可广泛应用于防治皮肤光损伤的护肤品或药品中；

（3）临床试验表明，含有二氢杨梅素的隔离霜能显著地降低光损伤患者皮肤瘙痒、红肿、疼痛等不适症状的发生率，并且可有效地对抗光照后红斑的发生，对于皮肤光损伤具有较好的防治作用，适合长期应用于对抗皮肤光损伤。

附图说明

图1为不同UVA剂量照射的HaCaT细胞的细胞存活率；

图2为DHM作用6h之后对UVA照射的HaCaT细胞的细胞存活率的影响；

图3为DHM作用6h之后对UVA照射的HaCaT细胞内ROS水平的影响；

图4为DHM作用6h之后对UVA照射的HaCaT细胞内细胞因子Cox-2，IL-1β，IL-6基因表达水平的影响；

图5为DHM作用6h之后对UVA照射的HaCaT细胞内细胞因子Bax，Bcl-2基因表达水平的变化。

具体实施方式

本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，在所公开的具体实施方案中可以做出许多改变，并仍然获得相同或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1 DHM对UVA照射的HaCaT细胞的细胞存活率的影响

1. 溶液配制

（1）DHM的配制：取2.1mg的二氢杨梅素粉末溶于65.6μLDMSO中（DMSO的终体积不超0.1%），配制成100mmol/L的储备液，以10μL/管存储在200μL的PCR管中，避光保存在－20℃冰箱。使用时提前取出，根据实验不同浓度的需要，使用DMEM稀释成相应浓度。

（2）HaCaT细胞培养基（完全培养基）：DMEM培养基（高糖无血清培养基）＋10%FBS（南美胎牛血清），其比例为9:1；培养基中加入双抗（青霉素和链霉素），使其终浓度为100mg/L；封口膜封口，4℃保存备用。

2. 实验方法

2.1不同剂量UVA照射HaCaT细胞的存活影响

（1）收集对数期生长的细胞按照1x10⁵cells/ml的细胞密度接种于96孔板内，每孔接种100μL，每组设置10个实验孔，同时设置细胞对照组，5%CO₂，37℃孵育。

（2）培养24h，细胞长至单层之后，吸弃培养基并添加PBS至覆盖细胞，实验组分别给予7.5min，15min，30min，60min，90min，120min，150min的UVA照射；

（3）照射之后每孔加入100μl完全培养基后继续培养，在照射之后的24h在每孔中加入10μLMTT溶液，继续培养4h；

（4）终止培养，小心地吸去孔内培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜后将96孔板置于摇床上低速振荡15min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm的波长条件下测量各孔的吸光值。

（5）计算各组UVA辐射的存活率：细胞存活率(％)＝(OD_实验组-OD_空白孔)/(OD_{细胞对照组}-OD_空白孔)×100%

2.2 DHM对UVA照射的HaCaT细胞存活情况的影响

（1）收集对数期生长的细胞按照1x10⁵cells/ml的细胞密度接种于96孔板内，每孔接种100μL，同时设置细胞对照组。每组均设置4个实验孔。5%CO2，37℃孵育。

（2）培养24h之后细胞长至单层，在实验组中加入不同浓度的DHM（浓度设置为30μmol/L，20μmol/L，10μmol/L，5μmol/L，1μmol/L，0.5μmol/L，0.1μmol/L，0μmol/L）并继续培养6h。6h之后吸弃培养基并添加PBS至覆盖细胞，给予UVA照射60min；

（3）照射完成之后吸弃PBS并恢复照射之前的药物处理并继续孵育24h；

（4）UVA照射之后的24h在每孔中加入10μLMTT溶液，继续培养4h；

（5）终止培养，小心吸去孔内的培养基。每孔加入100μL二甲基亚砜后将96孔板置于摇床上低速振荡15min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在490nm的波长条件下测量各孔的吸光值。细胞存活率(％)＝(OD_实验组-OD_空白孔)/(OD_{细胞对照组}-OD_空白孔)×100%

3. 数据处理

数据均以平均值±标准差表示，采用Student’s t-test分析，P＜0.05表示数据具有显著性差异，P＜0.01表示数据具有极显著性差异。

4．实验结果

4.1不同剂量UVA照射的HaCaT细胞的存活情况

结果如图1所示。MTT法测定数据显示，随着UVA照射强度的增加HaCaT细胞的存活率逐渐下降，呈现出一定的剂量关系。并且在10J/cm²时细胞的存活率下降至50%左右，因此我们选取10J/cm²的UVA强度作为后续实验的照射强度。

4.2 DHM对UVA照射的HaCaT细胞存活情况的影响

结果如图2所示。当DHM的浓度在1μmol/L以下时，DHM没有显著的提高UVA（10J/cm²）照射后24h HaCaT细胞的存活率，但是当DHM的浓度在1～30μmol/L时能够显著的抑制UVA照射所引起的HaCaT细胞的存活率的下降，并且在10μmol/L时达到最大效应。

实施例2 DHM对UVA照射的HaCaT细胞内ROS水平的影响

1. 实验方法

（1）DCFH-DA配制：用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10μmol/L；

（2）将对数期的HaCaT细胞按照1x10⁵cells/ml的细胞密度接种于35mm细胞培养皿内，每皿2ml；

（3）培养24h之后弃去旧的培养液，并加入含有不同浓度DHM的培养基并继续孵育6h；

（4）6h之后将培养基吸弃并换成PBS，然后紫外照射60min；

（5）紫外照射结束后将PBS换成含血清的培养基并继续孵育30min；

（6）30min之后吸弃上清，用PBS洗涤细胞3次之后加入稀释好的DCFH-DA，每皿2ml并继续在37℃孵育30min；

（7）30min之后吸弃上清，用PBS洗涤细胞3次之后，采用共聚焦显微镜检测ROS荧光强度，488nm作为激发波长，568nm作为发射波长。

2. 数据处理

3.实验结果

结果如图3所示。由共聚焦结果可以看出UVA照射之后HaCaT细胞内生成了大量的ROS，而DHM能够显著的降低紫外辐射之后ROS的生成，但没有呈现出一定的剂量依赖性。

实施例3 DHM对UVA照射的HaCaT细胞内炎症因子基因表达水平的影响。

1. 实验方法

（1）收集对数期生长的细胞按照1x10⁵cells/ml的细胞密度接种于35mm的细胞培养皿内，每皿2ml，置于37℃，5%CO₂培养箱内培养；

（2）培养24h之后待细胞长至单层之后弃去旧培养液，在实验组中添加不同浓度的二氢杨梅素（浓度为10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1.25μmol/L，0μmol/L），细胞对照组添加含血清的培养基后在37℃继续孵育6h，6h之后吸弃培养基并添加PBS至覆盖细胞，然后紫外照射60min，紫外照射结束之后吸弃PBS并重新添加含血清的培养基，然后继续培养不同时间；

（3）紫外照射之后的20min，40min，60min，80min，100min收细胞并按照Trizol法提取总RNA。

（4）采用Q-PCR检测不同时间细胞内炎性因子基因表达水平的变化。

2. 数据处理

3. 实验结果

结果如图4所示。由Q-PCR结果可以看出DHM能够浓度依赖性的降低由于紫外辐照所引起的炎性因子COX-2、IL-1、IL-6的表达。

实施例4 DHM对UVA照射的HaCaT细胞内凋亡因子表达水平的影响。

1.实验方法

（2）培养24h之后待细胞长至单层之后弃去旧培养液，在实验组中添加不同浓度的DHM（浓度为10μmol/L，5μmol/L，2.5μmol/L，1.25μmol/L，0μmol/L），细胞对照组添加含血清的培养基后在37度继续孵育6h，6h之后吸弃培养基并添加PBS至覆盖细胞，然后紫外照射60min，紫外照射结束之后吸弃PBS并重新添加含血清的培养基，然后继续培养不同时间；

（3）紫外照射之后的2h，4h，6h，8h，10h，12h，14h收集细胞并按照Trizol法提取总RNA。

（4）采用Q-PCR检测不同时间细胞内凋亡因子基因表达水平的变化。

2. 数据处理

3. 实验结果

结果如图5所示。DHM能够浓度依赖性的下调由于UVA照射所引起的促凋亡基因Bax的上升，同时还能上调抑凋亡基因Bcl-2的表达。

实施例5 本发明抗皮肤光损伤隔离霜的制备

本发明抗皮肤光损伤的隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇4%、甘油4%、海藻糖4%、燕麦β-葡聚糖4%、二氢杨梅素6%、C_20-22醇磷酸酯4%、聚二甲基硅氧烷3%、异壬酸异壬酯3%、羟苯甲酯0.1%，余量为水。

制备方法：

S1：取二氢杨梅素、丙二醇、甘油、海藻糖和水置于乳化锅中，加热至80℃，搅拌均匀，即得物料A；

S2：取C_20-22醇磷酸酯、聚二甲基硅氧烷和异壬酸异壬酯置于油锅中，加热至80℃，搅拌均匀，即得物料B；

S3：将所述物料B加入到S1的乳化锅中与物料A充分搅拌均匀，均质15min，冷却；

实施例6 本发明抗皮肤光损伤隔离霜的制备

本发明抗皮肤光损伤的隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇2%、甘油2%、海藻糖2%、燕麦β-葡聚糖2%、二氢杨梅素2%、C_20-22醇磷酸酯1%、聚二甲基硅氧烷1%、异壬酸异壬酯1%、羟苯甲酯0.1%，余量为水。

制备方法同实施例5。

实施例7 本发明抗皮肤光损伤隔离霜的制备

本发明抗皮肤光损伤的隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇6%、甘油6%、海藻糖4%、燕麦β-葡聚糖4%、二氢杨梅素6%、C_20-22醇磷酸酯4%、聚二甲基硅氧烷4%、异壬酸异壬酯4%、羟苯甲酯0.2%，余量为水。

制备方法同实施例5。

经检验实施例5~7产品均符合QB/T 1857-2013 的有关规定要求，感观指标（色泽、香气、结构）符合行业规定，理化指标（pH、耐热、耐寒、活性物）符合行业规定。

试验例一、本发明抗皮肤光损伤隔离霜产品安全性评价（人体皮肤斑贴实验）

1.试验药品：实施例5-7制备得到的抗皮肤光损伤隔离霜。

2.试验对象及分组：240例皮肤健康，无皮肤病过敏史的女性受试志愿者， 25-55岁，平均年龄34岁，随机分为3组，每组80人。

3.试验方法：选用合格的斑试器，以封闭式斑贴实验方式，取约黄豆大小的受试物置于于斑试器内，外用专用胶带贴覆于受试者背部，24小时后去除受试物，分别去除后2、4、6、12、24、48小时观察皮肤反应，按照《化妆品卫生规范》中皮肤反应分级标准记录其结果。

4.试验结果：人体皮肤斑贴试验结果显示：各组受试者通过实施例5~7的抗过敏爽肤水的斑贴试验，在2、4、6、12、24、48小时观察皮肤反应，均无出现皮肤不良反应，说明本发明制得的隔离霜使用安全。

试验例二、本发明抗皮肤光损伤隔离霜临床药效研究

1. 试验对象：

筛选320例皮肤健康的患者作为研究对象，所有研究对象皮肤类型相似，患者签署知情同意书，自愿参与实验，排除心、肝、肾严重疾病患者，排除光过敏患者，研究对象依从性良好。其中男120例，女200例，年龄18-55岁，平均35岁。采用随机数字表法将研究对象平均分成试验A、B、C组和对比例组，每组80人。这些患者在习惯上均无明显差异，配合治疗，差异无统计学意义，具有可比性。

2. 试验方法：

对比例组采用市售雅诗兰黛红石榴防晒霜；试验A、B、C组分别采用实施例5-7制得的抗皮肤光损伤隔离霜。试验者清洁皮肤后，取隔离霜均匀涂抹于皮肤暴露部位表面，在涂抹过程中避免进入眼睛，四组患者同时在进行紫外线照射，波长320-400 nm，照射部位为研究对象面部，照射时间为半小时，比较四组患者出现红斑、不适反应发生情况。

3. 观察指标：

比较四组患者皮肤出现不适反应的情况，主要包括瘙痒、疼痛和红肿，比较四组患者皮肤出现红斑的情况，分别为无红斑、淡红斑和明显红斑。明显红斑为红斑面积＞2 cm，淡红斑为红斑面积1-2 cm，无红斑为红斑面积＜1 cm，红斑由同一评估者进行评估，根据患者不同情况进行评估，淡红斑为可见少量红斑且颜色较淡，明显红斑是指红斑面积大且颜色深。

4. 试验结果

表1 各组患者皮肤不适应发生的情况比较

表2 各组患者皮肤出现红斑情况的比较

皮肤光损伤主要是由于紫外线作用于皮肤，破坏皮肤表面角质层，细胞出现应急反应，最终造成皮肤表面的瘙痒、红肿、热痛，形成红斑，甚至破坏皮肤完整性。市售的市售雅诗兰黛红石榴防晒霜含有红石榴精华、绿茶提取液、维生素、二氧化钛等成分，具有防晒、隔离、保湿的功效，本发明通过使用雅诗兰黛红石榴防晒霜作为对比例，考察本发明含二氢杨梅素的隔离霜抗皮肤光损伤的作用。

由上表1可知，四组患者经过光照射后，试验A、B、C组的皮肤不适应发生率分别为2.5%、3.75%、3.75%，明显低于对照组不适应发生率8.75%，其中以试验A组即实施例5制得隔离霜的皮肤不适应发生率最低；由上表2可知，试验A、B、C组的皮肤红斑不适应发生率分别为2.5%、3.75%、3.75%，明显低于对照组不适应发生率10%，其中以试验A组即实施例5制得隔离霜的皮肤红斑发生率最低。以上结果表明，二氢杨梅素可明显降低患者皮肤瘙痒、红肿、疼痛等不适症状的发生率，可有效地对抗光照后红斑的发生，对于皮肤光损伤具有较好的防治作用，并且以实施例5制得的隔离霜的效果最好。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种含有二氢杨梅素的防治皮肤光损伤的隔离霜，其特征在于：所述隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇2-6%、甘油2-6%、海藻糖2-4%、燕麦β-葡聚糖2-4%、二氢杨梅素2-6%、C20-22 醇磷酸酯1-4%、聚二甲基硅氧烷1-4%、异壬酸异壬酯1-4%、羟苯甲酯0 .1-0.2%，余量为水；所述隔离霜的制备方法包括以下步骤：

S2：取C20-22 醇磷酸酯、聚二甲基硅氧烷和异壬酸异壬酯置于油锅中，加热至75-80℃，搅拌均匀，即得物料B；

2.如权利要求1所述的防治皮肤光损伤的隔离霜，其特征在于，所述隔离霜由以下百分比计的组分组成：丙二醇4%、甘油4%、海藻糖4%、燕麦β-葡聚糖4%、二氢杨梅素6%、C20-22 醇磷酸酯4%、聚二甲基硅氧烷3%、异壬酸异壬酯3%、羟苯甲酯0 .1%，余量为水。