CN105658797A - 用于调节rna的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的一些方面涉及用于以靶向方式提高基因表达的方法。在一些实施方案中，提供了可用于以靶向方式转录后改变蛋白质和/或RNA水平的方法和组合物。本文中公开的本发明的一些方面提供了可用于保护RNA免受降解(例如，核酸外切酶介导的降解)的方法和组合物。

Description

用于调节RNA的组合物和方法
相关申请的交叉应用
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2014年6月10日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSFORMODULATINGRNASTABILITY”的美国临时申请No.62/010,417、于2013年10月31日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSFORMODULATINGRNASTABILITY”的美国临时申请No.61/898,461和于2013年8月16日提交的标题为“COMPOSITIONSANDMETHODSFORMODULATINGRNASTABILITY”的美国临时申请No.61/866,989的权益，其内容分别通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及基于寡核苷酸的组合物，以及使用基于寡核苷酸的组合物来调节核酸的方法。
背景技术
相当一部分的人疾病可通过选择性地改变疾病相关转录单位(非编码RNA、编码蛋白质的RNA或者其他调节性编码或非编码基因组区)的蛋白质和/或RNA水平来治疗。用于抑制基因表达的方法是本领域中已知的，并且包括例如反义、RNAi和miRNA介导的方法。这样的方法可涉及阻断mRNA的翻译或引起靶RNA的降解。然而，可用于提高基因表达的方法有限。
发明内容
本文中公开的本发明的一些方面涉及可用于调节核酸的方法和组合物。在一些实施方案中，本文中提供的方法和组合物可用于保护RNA(例如，RNA转录物)免受降解(例如，核酸外切酶介导的降解)。在一些实施方案中，所保护的RNA存在于细胞外。在一些实施方案中，所保护的RNA存在于细胞中。在一些实施方案中，提供了可用于以靶向方式转录后改变蛋白质和/或RNA水平的方法和组合物。在一些实施方案中，本文中公开的方法涉及降低或防止所靶向RNA的降解或加工，从而升高所靶向RNA的稳态水平(steadystatelevel)。在一些实施方案中，本文中公开的方法还可或可替选地涉及提高所靶向RNA的翻译或提高所靶向RNA的转录，从而以靶向方式升高RNA水平和/或蛋白质水平。
本发明的一些方面涉及这样的认识：某些RNA降解是由核酸外切酶介导的。在一些实施方案中，核酸外切酶可从RNA3’端和/或5’端破坏RNA。期望不受理论的限制，在一些实施方案中，认为可通过使RNA与跟RNA在或接近一端或两端杂交的寡核苷酸(oligo)接触来保护RNA的一端或两端免受核酸外切酶酶活性，从而提高RNA的稳定性和/或水平。如本文中公开的，通过在或接近一端或两端靶向RNA来提高RNA稳定性和/或水平的能力是令人惊讶的，部分地是因为存在(例如，细胞中)能够通过内侧切割来破坏RNA的核酸外切酶。另外，在一些实施方案中，令人惊讶的是，5’靶向寡核苷酸单独(例如，不与3’靶向寡核苷酸组合，或者在假环化寡核苷酸的情形下)有效地稳定RNA或提高RNA水平，因为在细胞中例如3’端加工核酸外切酶可占优势(例如，与5’端加工核酸外切酶相比)。然而，在一些实施方案中，将3’靶向寡核苷酸与5’靶向寡核苷酸组合使用或者单独使用以稳定靶RNA。
在一些实施方案中，当所靶向的RNA是编码蛋白质的RNA时，则该RNA的稳态水平提高导致所编码蛋白质的水平伴随地提高。因此，在一些实施方案中，本文中提供了当递送至细胞时提高靶RNA的蛋白质水平的寡核苷酸(包括5’靶向、3’靶向和假环化寡核苷酸)。在一些实施方案中，值得注意的是，不仅靶RNA水平提高，而且所得翻译产物也得以增加。在一些实施方案中，这一结果是令人惊讶的，部分地是因为以下了解：对于发生翻译而言，核糖体机器要求接近RNA的某些区域(例如，5’帽区、起始密码子等)以有利于翻译。
在一些实施方案中，当所靶向的RNA是非编码的RNA时，则非编码RNA的稳态水平提高导致与该非编码RNA相关的活性伴随地提高。例如，在非编码RNA是miRNA的情况下，miRNA的稳态水平提高可导致由该miRNA靶向的mRNA降解增加。
在一些实施方案中，提供了具有适于在细胞内递送、杂交和稳定以靶向并使RNA转录物稳定的化学性质的寡核苷酸。另外，在一些实施方案中，提供了可用于控制寡核苷酸的药代动力学、生物分布、生物利用度和/或效力的寡核苷酸化学物质。
在本发明的一些方面，提供了用于使合成RNA(例如，待递送至细胞的合成RNA)稳定的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及使合成RNA与一种或更多种寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与合成RNA的5’区和合成RNA的3’区结合并且当与合成RNA结合时与所述合成RNA形成环化(circularized)产物。在一些实施方案中，使合成RNA与一种或更多种寡核苷酸在细胞外接触。在一些实施方案中，所述方法还涉及将环化产物递送至细胞。
在本发明的一些方面，提供了用于在细胞中提高蛋白质的表达的方法，其涉及向细胞递送编码所述蛋白质的环化的合成RNA，其中在向所述细胞递送环化的RNA之后，所述蛋白质在所述细胞中的合成增加。在一些实施方案中，所述环化的合成RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，提供了这样的方法，其涉及向细胞递送编码蛋白质的环化的合成RNA，其中在向所述细胞递送所述环化的合成RNA之后，所述蛋白质在所述细胞中的合成增加。在一些实施方案中，环化的合成RNA是单链的共价闭合环状RNA。在一些实施方案中，单链的共价闭合环状RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，环化的合成RNA通过合成具有5’和3’端的RNA并将5’和3’端连接在一起形成。在一些实施方案中，环化的合成RNA如下形成：产生合成RNA(例如，通过体外转录或人工(非天然)化学合成)并使所述合成RNA与一种或更多种寡核苷酸接触，所述寡核苷酸与所述合成RNA的5’区和所述合成RNA的3’区结合并且当与所述合成RNA结合时与所述合成RNA形成环化产物。
在一些实施方案中，提供了用于使合成RNA稳定的方法，其涉及在第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸与合成RNA上的靶序列杂交的条件下使所述合成RNA与所述第一稳定化寡核苷酸和所述第二稳定化寡核苷酸接触，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的5’区，所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的3’区。在一些实施方案中，第一稳定化寡核苷酸与第二稳定化寡核苷酸共价连接以使得合成RNA在与所述第一和第二稳定化寡核苷酸杂交时形成环化产物。在一些实施方案中，使合成RNA与第一和第二稳定化寡核苷酸在细胞外接触。
在一些实施方案中，提供了向细胞递送合成RNA的方法，其涉及：在第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸与合成RNA上的靶序列杂交的条件下使所述合成RNA与所述第一稳定化寡核苷酸和所述第二稳定化寡核苷酸接触，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的5’区，所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的3’区；以及向所述细胞递送环化产物。在一些实施方案中，第一稳定化寡核苷酸与第二稳定化寡核苷酸共价连接以使得合成RNA在与所述第一和第二稳定化寡核苷酸杂交时形成环化产物。在一些实施方案中，第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸通过本文中公开的任何合适的接头(例如，寡核苷酸接头)共价连接。
本发明的一些方面涉及在细胞中提高RNA转录物的稳定性的方法。在一些实施方案中，本文中提供的方法涉及向细胞递送稳定RNA转录物之本文中公开的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，所述方法涉及向细胞递送靶向RNA转录物之5’区的第一稳定化寡核苷酸和靶向RNA转录物之3’区的第二稳定化寡核苷酸。在一些实施方案中，第一稳定化寡核苷酸与第二稳定化寡核苷酸共价连接。在一些实施方案中，第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在RNA转录物5’端之第一个被转录核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，RNA转录物包含5’-甲基鸟苷帽，并且第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在紧接5’-甲基鸟苷帽内侧之核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在RNA转录物3’端的250个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，RNA转录物包含3’-poly(A)尾，并且第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在RNA转录物之多腺苷酸化接点(polyadenylationjunction)的100个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，第二稳定化寡核苷酸的互补区与RNA转录物的多腺苷酸化接点紧邻或重叠。在一些实施方案中，细胞在体外。在一些实施方案中，细胞在体内。在一些实施方案中，第二稳定化寡核苷酸包含与位于3’-poly(a)尾中的RNA转录物互补的互补区。在一些实施方案中，第二稳定化寡核苷酸包含含有5至15个嘧啶(例如胸腺嘧啶)核苷酸的区域。
本发明的另一些方面涉及在对象中治疗与RNA转录物水平降低相关的病症或疾病的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及向所述对象施用寡核苷酸。
在前述方法的一些实施方案中，所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA、miRNA、snoRNA或任何其他合适的转录物。
在一些实施方案中，所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、PTEN、MECP2和FOXP3。
在一些实施方案中，所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
在一些实施方案中，所述RNA转录物是选自HOTAIR和ANRIL的非编码RNA。
在一些实施方案中，所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：FXN、EPO、KLF4、ACTB、UTRN、HBF、SMN、FOXP3、PTEN、NFE2L2和ATP2A2。
在本发明的一些方面，提供了这样的寡核苷酸，其包含与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中所述互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的10个核苷酸之内的核苷酸互补。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含通过至少一个经修饰的核苷间键(internucleosidelinkage)连接的核苷酸或至少一个桥连(bridged)核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度为8至50个或9至20个核苷酸。
在本发明的一些方面，提供了包含两个互补区的寡核苷酸，所述互补区各自与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中第一互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的100个核苷酸之内的核苷酸互补，并且其中第二互补区与末端在所述RNA转录物3’端的300个核苷酸之内的RNA转录物区互补。
在本发明的一些方面，提供了包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1包含具有与RNA转录物之至少5个连续核苷酸互补的互补区的5至20个核苷酸，其中X1之互补区3’端的核苷酸与所述RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补；并且X2包含1至20个核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA转录物在其5’端具有7-甲基鸟苷帽。在一些实施方案中，所述RNA转录物具有7-甲基鸟苷帽，并且其中X1之互补区3’端的核苷酸与紧接7-甲基鸟苷帽内侧的RNA转录物的核苷酸互补。在一些实施方案中，X25’端的至少第一核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。在一些实施方案中，X25’端的第二核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。在一些实施方案中，X2包含式5’-Y1-Y2-Y3-3’，其中X2形成具有环区和茎区的茎环结构，所述环区包含Y2的核苷酸，所述茎区包含与Y3的至少两个连续核苷酸杂交的Y1的至少两个连续核苷酸。在一些实施方案中，Y1、Y2和Y3独立地包含1至10个核苷酸。在一些实施方案中，Y3在紧接茎区3’端之后的位置包含与鸟嘌呤互补的嘧啶。在一些实施方案中，Y3在茎区3’端之后包含1至2个核苷酸。在一些实施方案中，Y3在茎区3’端之后的核苷酸是DNA核苷酸。在一些实施方案中，所述茎区包含2至3个LNA。在一些实施方案中，与鸟嘌呤互补的嘧啶是胞嘧啶。在一些实施方案中，Y2的核苷酸包含至少一个腺嘌呤。在一些实施方案中，Y2包含3至4个核苷酸。在一些实施方案中，Y2的核苷酸是DNA核苷酸。在一些实施方案中，Y2包含3至4个DNA核苷酸，其含有至少一个腺嘌呤核苷酸。应认识到，Y2中可存在一个或更多个经修饰的核苷酸(例如2’-O-甲基、LNA核苷酸)。在一些实施方案中，X2包含与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的互补区，所述至少5个连续核苷酸不重叠于与X1的互补区互补的RNA转录物区。在一些实施方案中，X2的互补区在RNA转录物之多腺苷酸化接点的100个核苷酸之内。在一些实施方案中，X2的互补区在紧邻或重叠于RNA转录物之多腺苷酸化接点的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，X2还包含至少2个连续的嘧啶核苷酸，其与RNA转录物的poly(A)尾的腺嘌呤核苷酸互补。在一些实施方案中，X2的互补区在poly(a)尾内。在一些实施方案中，X2的互补区包含5至15个嘧啶(例如，胸腺嘧啶)核苷酸。在一些实施方案中，所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA、miRNA、snoRNA或任何其他合适的RNA转录物。在一些实施方案中，所述RNA转录物是mRNA转录物，并且X2包含与转录物之3’-UTR中的至少5个连续核苷酸互补的互补区。在一些实施方案中，所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ARCA1、APOA1、ATP2A2、RDNF、FXN、HRA2、HRR、HRD、HRE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、PTEN、MECP2和FOXP3。在一些实施方案中，X1包含序列5’-CGCCCTCCAG-3’。在一些实施方案中，X2包含序列CC。在一些实施方案中，X2包含序列5’-CCAAAGGTC-3’。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含序列5’-CGCCCTCCAGCCAAAGGTC-3’。在一些实施方案中，所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
在本发明的一些方面，提供了这样的寡核苷酸，其长度为10至50个或9至50个或9至20个核苷酸并且具有第一区和第二区，所述第一区与mRNA转录物的5’-UTR的至少5个连续核苷酸互补，所述第二区与mRNA转录物之3’-UTR的至少5个连续核苷酸、mRNA转录物之poly(A)尾的至少5个连续核苷酸或者重叠于mRNA转录物之多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，5’-UTR的至少5个连续核苷酸中的第一个在mRNA转录物之5’-甲基鸟苷帽的10个核苷酸之内。在一些实施方案中，第二区与重叠于多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，第二区与poly(a)尾的至少5个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，第二区包含5至15个嘧啶(例如，胸腺嘧啶)核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸还包含将第一区的5’端与第二区的3’端连接的2至20个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸还包含将第一区的3’端与第二区的5’端连接的2至20个核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的长度为10至50个或9至50个或9至20个核苷酸。
在本发明的一些方面，提供了包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1包含2至20个与腺嘌呤形成碱基对的嘧啶核苷酸；并且X2包含与多腺苷酸化RNA转录物的至少3个连续核苷酸互补的互补区，其中X2之互补区5’端的核苷酸与RNA转录物中紧接所述RNA转录物之多腺苷酸化接点内侧的核苷酸互补。在一些实施方案中，X1包含2至20个胸苷或尿苷。
在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键。在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一个核苷酸包含2’O-甲基。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸、至少一个2’-氟-脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。在一些实施方案中，所述桥连核苷酸是LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷酸均为LNA核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-氟-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或桥连核苷酸。在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸是混合体(mixmer)。在一些实施方案中，本文中提供的寡核苷酸是吗啉代寡核苷酸。
在本发明的一些方面，提供了这样的寡核苷酸，其包含如表3、7、8或9中所示的核苷酸序列。在本发明的一些方面，提供了这样的寡核苷酸，其包含如表3、7、8或9中所示的核苷酸序列的至少8个核苷酸的片段。
在本发明的一些方面，提供了组合物，其包含具有通过核苷间键连接之5至25个核苷酸的第一寡核苷酸和具有通过核苷间键连接之5至25个核苷酸的第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸与RNA转录物5’端的100个核苷酸之内的至少5个连续核苷酸互补，并且其中所述第二寡核苷酸与RNA转录物3’端的100个核苷酸之内的至少5个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸通过接头连接，所述接头不是具有与所述RNA转录物互补之序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述接头是寡核苷酸。在一些实施方案中，所述接头是多肽。
在本发明的一些方面，提供了这样的组合物，其包含本文中公开的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，提供了包含多种寡核苷酸的组合物，其中至少75％的寡核苷酸各自包含如表3、7、8或9中所示的核苷酸序列，或者由其组成。在一些实施方案中，所述寡核苷酸与单共价阳离子(例如，Li+、Na+、K+、Cs+)络合。在一些实施方案中，所述寡核苷酸为冻干形式。在一些实施方案中，所述寡核苷酸在水溶液中。在一些实施方案中，所述寡核苷酸与载体(例如，可药用载体)组合或混合提供。在一些实施方案中，在缓冲溶液中提供所述寡核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸与载体(例如，肽、类固醇或其他分子)缀合。在本发明的一些方面，提供了药盒，其包含装有所述组合物的容器。
附图简述
图1是描绘用于靶向3’RNA端的示例性寡核苷酸设计的图示。第一个实例示出了在polyA尾之前与RNA3’端互补的寡核苷酸。第二个实例示出了与RNA3’端互补且具有与polyA尾杂交之5’T段(stretch)的寡核苷酸。
图2是描绘用于靶向5’RNA端的示例性寡核苷酸的图示。第一个实例示出了与RNA5’端互补的寡核苷酸。第二个实例示出了与RNA5’端互补的这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有3’突出端残基以产生具有凹缺末端(recessedend)的RNA-寡核苷酸双链体。突出端可包含潜在地与5’甲基鸟苷帽相互作用并进一步稳定该帽的核苷酸(包括但不限于C)的组合。
图3A是描绘用于靶向5’RNA端的示例性寡核苷酸以及用于靶向5’和3’RNA端的示例性寡核苷酸的图示。该实例示出了具有稳定5’RNA帽的环的寡核苷酸或与5’和3’RNA端结合以产生假环化RNA的寡核苷酸。
图3B是描绘示例性寡核苷酸介导的RNA假环化的图示。该图示示出了与示例性RNA的5’和3’区结合的LNA混合体寡核苷酸。
图4是描绘弗氏共济失调蛋白(Frataxin，FXN)3’polyA位点的图。
图5是描绘FXN5’起始位点的图。
图6是描绘实施例中测试的5’和3’寡核苷酸之位置的图。
图7是描绘测试3’端寡核苷酸的结果的图。在GM03816FRDA患者细胞系中进行筛选并且在转染后1至3天测量FXNmRNA的水平。用于转染的寡核苷酸浓度为100nM。
图8是描绘测试3’端寡核苷酸的结果的图。在GM03816FRDA患者细胞系中进行筛选并且在转染后1至3天测量FXNmRNA的水平。用于转染的寡核苷酸浓度为400nM。
图9是描绘FXN3’oligo73、75、76和77的位置和序列的图，显示其上调FXNmRNA。所述寡核苷酸均包含poly-T序列。示出了每种寡核苷酸与mRNA结合的示意图。
图10是描绘测试5’端寡核苷酸的结果的图。在GM03816FRDA患者细胞中进行筛选并且在转染后2天测量FXNmRNA的水平。用于转染的寡核苷酸浓度为100nM(红色条，每对中的左侧条)和400nM(蓝色条，每对中的右侧条)。用400nM水平获得较低的应答水平可归因于寡核苷酸浓度太高且降低了适当地包被每个寡核苷酸以供递送的转染剂利用度。
图11是描绘在GM03816FRDA患者细胞中测试5’端寡核苷酸与FXN3’oligo75之组合的结果的图。在转染后2和3天测量FXNmRNA的水平。对于寡核苷酸A/B，寡核苷酸A靶向5’端并且寡核苷酸B靶向3’端。用于转染的寡核苷酸浓度为200nM终浓度＝100nM寡核苷酸A+100nM寡核苷酸B。
图12示出了图8中所示的相同图。条周围的方框指示在GM03816FRDA患者细胞中特别有效地上调FXN的5’和3’寡核苷酸对。
图13是描绘FXN5’oligo51、52、57和62的位置和序列的图，显示其上调FXNmRNA。所述寡核苷酸全部包含基序CGCCCTCCAG。示出了由oligo62形成的茎环结构的示意图。
图14是描绘FXNoligo62的预测结构的图示。1-15位核苷酸与FXN同工型之一的5’端互补。在2至8位核苷酸中显示的预测环可能在细胞中不存在，因为该部分将与RNA杂交，因此该环将打开并与RNA杂交。16-24位核苷酸是人工添加的环以将3’最末端的C残基以紧邻FXNmRNA的5’甲基鸟苷帽放置。
图15A和15B是描绘两天处理的细胞毒性(cytoxicity，CTG)的图。在100和400nM下，用寡核苷酸处理FRDA患者细胞系GM03816在寡核苷酸处理的第2(图15A)和第3(图15B)天期间未产生细胞毒性。
图16是示出了在GM03816FRDA患者细胞系中测试来自先前实验之寡核苷酸的组合的一组图。对于一些寡核苷酸而言，FXNmRNA水平接近GM0321B正常成纤维细胞中的FXNmRNA水平。对于寡核苷酸A/B，寡核苷酸A靶向5’端并且寡核苷酸B靶向3’端。用于转染的寡核苷酸浓度为200nM终浓度＝100nM寡核苷酸A+100nM寡核苷酸B。
图17是描绘用寡核苷酸进行两天和三天处理的FXNmRNA水平的图。先前实验中的阳性命中(positivehit)在GM03816FRDA患者细胞中的生物学重复证实了稳态FXNmRNA水平在2至3天时提高。对于寡核苷酸A/B，寡核苷酸A靶向5’端并且寡核苷酸B靶向3’端。用于转染的寡核苷酸浓度为200nM终浓度＝100nM寡核苷酸A+100nM寡核苷酸B。
图18是描绘在GM04078FRDA患者成纤维细胞中测试寡核苷酸的图。
图19是描绘在“正常”细胞系GM0321B成纤维细胞中测试寡核苷酸的图。与FRDA患者细胞相比，GM0321B细胞表达约4倍的更多FXNmRNA。
图20是描绘5’和3’FXN寡核苷酸组合62/77的转染剂量-响应测试的图。FXN寡核苷酸62/77组合在GM03816FRDA患者细胞系中的生物学重复和剂量响应示出稳态FXNmRNA水平在2至3天内提高。对于寡核苷酸A/B，寡核苷酸A靶向5’端并且寡核苷酸B靶向3’端。转染试剂的量在不同浓度的寡核苷酸之间保持恒定，这可能是对寡核苷酸处理具有相对平坦响应的原因。浓度以nM终浓度表示(即，10nM终浓度＝5nMoligo62+5nMoligo77)。
图21是描绘用寡核苷酸(100nM的单一寡核苷酸)或以组合(200nM终浓度的两种寡核苷酸)处理之GM03816FRDA患者成纤维细胞中的FXN蛋白水平以及GM0321B正常成纤维细胞中的FXN蛋白水平的图。
图22是描绘在寡核苷酸处理下的FXN蛋白水平的图。FXN蛋白(100nM，d3)n＝2。
图23A和23B是描绘在从头(denovo)转录抑制剂放线菌素D(ActD)存在下，在有或无oligo62和75(还分别称为oligo385和398)之组合的处理下的相对mRNA水平的图。图23A描绘了MYCmRNA的相对水平。图22B描绘了FXNmRNA的相对水平。cMyc具有相对短的半衰期(约100分钟)并且用作ActD处理的阳性对照。
图24是描绘用放线菌素D(ActD)处理的GM03816细胞中的寡核苷酸的图。在0、2、4和8小时描绘FXN表达。
图25A和25B是描绘用5’和3’FXN寡核苷酸之组合处理的GM15850和GM15851细胞(图25A)或者GM16209和GM16222(图25B)中的FXNmRNA水平的图。这是用10微摩尔寡核苷酸进行的裸实验(gymnoticexperiment)。
图26是示出了用5’端靶向寡核苷酸和3’端靶向寡核苷酸与其他FXN靶向寡核苷酸的组合处理细胞提高FXNmRNA水平的图。
图27是示出了3’端寡核苷酸筛选的一系列图。用10或40nM寡核苷酸转染细胞并在转染后2天测量FXNmRNA。
图28是示出了3’端寡核苷酸筛选的一系列图。用10或40nM寡核苷酸转染细胞并在转染后3天测量FXNmRNA。
图29是示出了5’端寡核苷酸筛选的图和表。用10或40nM寡核苷酸转染细胞并在转染后2天测量FXNmRNA。
图30是示出了5’和3’端寡核苷酸之组合测试的一系列图。用10或40nM寡核苷酸组合转染细胞并在转染后2天测量FXNmRNA。
图31是示出了5’和3’端寡核苷酸之组合的测试的一系列图。用10或40nM寡核苷酸组合转染细胞并在转染后3天测量FXNmRNA。
图32是示出了在用5’和3’端寡核苷酸之组合处理的细胞中FXNmRNA的稳态水平随时间提高的图。用10nM寡核苷酸组合转染细胞并在转染后2和3天测量FXNmRNA。
图33是示出了在用5’和3’端寡核苷酸之组合处理的细胞中FXNmRNA的稳态水平随时间提高的图。用40nM寡核苷酸组合转染细胞并在转染后2和3天测量FXNmRNA。
图34是示出了来自例如在内侧、接近poly-A尾或者跨越外显子靶向FXN之其他寡核苷酸之测试的结果的图。
图35是示出了使用单一寡核苷酸使FXNmRNA水平提高的图。用10nM寡核苷酸转染细胞并在转染后2和3天测量FXNmRNA。
图36是示出了使用单一寡核苷酸使FXNmRNA水平提高的图。用40nM寡核苷酸转染细胞并在转染后2和3天测量FXNmRNA。
图37是示出了使用5’和3’寡核苷酸之组合使FXNmRNA水平提高的图。用10或40nM寡核苷酸组合转染细胞并在转染后2和3天测量FXNmRNA。
图38A和38B是示出了用10或40nM寡核苷酸进行的转染在转染后的第2天(图38A)或第3天(图38B)对细胞无细胞毒性的图。
图39A和39B是示出了在用10nM寡核苷酸转染的细胞中，FXN蛋白水平(图39A)和mRNA水平(图39B)提高的图。在转染后2或3天测量蛋白质和mRNA水平。
图40A和40B是示出了在用40nM寡核苷酸转染的细胞中，FXN蛋白水平(图40A)和mRNA水平(图40B)可提高的图。在转染后2或3天测量蛋白质和mRNA水平。
图41是描绘用KLF45’和3’端靶向寡核苷酸处理的细胞中之KLF4mRNA表达水平的图。
图42是描绘用KLF45’和3’端靶向寡核苷酸处理的细胞中之KLF4蛋白表达水平的Western印迹图像。
图43是描绘用KLF45’和3’端靶向寡核苷酸处理的细胞中之KLF4mRNA表达水平的图，所述寡核苷酸包括靶向KLF45’端和3’端两者的环化寡核苷酸，以及靶向KLF45’端和3’端的单独寡核苷酸。
图44A和44B是描绘用PTEN寡核苷酸处理的细胞中第3天的PTENmRNA表达水平的图。用寡核苷酸转染GM04078成纤维细胞并在第3天收集裂解物。寡核苷酸序列提供于表9中。
图45是这样的Western印迹图像，其描绘来自用PTEN寡核苷酸PTEN-108和PTEN-113单独或组合处理的GM04078成纤维细胞的第1天和第2天PTEN蛋白表达水平。转染GM04078成纤维细胞并在第1天和第2天收集裂解物。寡核苷酸序列提供于表9中。
图46是描绘用KLF4寡核苷酸处理之细胞中第3天的小鼠KLF4mRNA表达水平的图。用寡核苷酸转染Hepa1-6细胞并在第3天收集裂解物。寡核苷酸序列提供于表9中。
图47是描绘用假环化寡核苷酸处理之细胞中第3天的小鼠KLF4蛋白表达水平的Western印迹图像。用寡核苷酸转染Hepa1-6细胞并在第3天收集裂解物。受试寡核苷酸为小鼠KLF4-8、KLF4-9、KLF4-11、KLF4-12、KLF4-13、KLF4-14和KLF4-15。寡核苷酸序列提供于表9中。
图48是描绘用稳定性组合寡核苷酸处理之细胞中第3天的小鼠KLF4蛋白表达水平的Western印迹图像。用寡核苷酸转染Hepa1-6细胞并在第3天收集裂解物。受试寡核苷酸为以多种组合的小鼠KLF4-1、KLF4-2、KLF4-3、KLF4-16、KLF4-17、KLF4-18和KLF4-19。寡核苷酸序列提供于表9中。
图49是示出了在单独或以组合(由“/”表示)使用的环化和单独稳定性寡核苷酸存在或不存在下的人KLF4稳定性测量结果的图。寡核苷酸序列提供于表7中。47＝KLF4-47m02、48＝KLF4-48m02、50＝KLF4-50m02、51＝KLF4-51m02、53＝KLF4-53m02。
图50是示出了5’/3’端寡核苷酸组合和环化寡核苷酸可用于提高β肌动蛋白mRNA的图，已知其具有长mRNA半衰期。
图51是示出了用FXN寡核苷酸单独或以多种组合处理的GM03816细胞中之人FXNmRNA上调的图。浓度表示为总寡核苷酸浓度(例如，20nM意指每种寡核苷酸为10nM)。
图52和53各自为示出了由多种FXN寡核苷酸诱导之成熟前(premature)和成熟FXN之蛋白质水平的Western印迹照片。
图54是示出了用FXN寡核苷酸单独或以多种组合处理的GM03816细胞中之FXNmRNA上调的一系列图。GAPDH缺口体(gapmer)值示出了相对于FXNmRNA水平的GAPDHmRNA水平。剩余的值示出了相对于GAPDHmRNA水平的FXNmRNA水平。
图55是示出了用FXN寡核苷酸单独或以多种组合处理之GM03816细胞中的FXNmRNA上调的图。GAPDH缺口体值示出了相对于FXNmRNA水平的GAPDHmRNA水平。剩余的值示出了相对于GAPDHmRNA水平的FXNmRNA水平。
图56提供了这样的一系列图，其示出了用多种FXN寡核苷酸单独或以组合处理的细胞中之PPARGC1和NFE2L2(候选FXN下游基因)的mRNA水平。
图57是示出了用FXN寡核苷酸单独或以多种组合处理的GM03816细胞中之FXNmRNA上调的图。
图58A至58C是这样的一系列图，其分别示出了用多种FXN寡核苷酸单独或以组合处理的FRDA小鼠模型成纤维细胞中第4天、第7天和第10天的FXNmRNA水平。
图59A和59B是这样的一系列图，其示出了剂量-响应研究中用多种FXN寡核苷酸处理的GM03816细胞中的FXNmRNA水平。对于图59A，在第3天和第5天进行测量。对于图59B，在第5天进行测量。
图60A和60B是这样的一系列图，其示出了用与FXN-532寡核苷酸组合之多种5’FXN寡核苷酸处理的GM03816细胞中的FXNmRNA水平。
图61是示出了用多种FXN寡核苷酸处理之GM03816细胞中的FXN蛋白水平的Western印迹照片。
图62是示出了由图64中之Western印迹量化的UTRN蛋白水平的图。
图63是这样的Western印迹照片，其示出了来自用多种UTRN寡核苷酸处理之细胞的上清液中的UTRN蛋白水平。
图64A是示出了由图64B和64C中之Western印迹量化的UTRN蛋白水平的图。图64B和64C各自是这样的Western印迹照片，其示出了来自用多种UTRN寡核苷酸处理之细胞的上清液或沉淀中的UTRN蛋白水平。
图65A至65C是这样的一系列图，其示出了用多种APOA1寡核苷酸处理的原代小鼠肝细胞中小鼠APOA1mNRA水平的程度。
图66是示出了用多种APOA1寡核苷酸处理之原代小鼠肝细胞中的APOA1蛋白水平的两个Western印迹照片。对于底部的照片，使用微管蛋白作为上样对照。
图67A至67G是这样的一系列图，其示出了弗里德赖希共济失调(Friedreich’sataxia)小鼠模型中之寡核苷酸处理短臂(shortarm，SA)或长臂(longarm，LA)研究中的人弗氏共济失调蛋白(A、B、E)或小鼠弗氏共济失调蛋白水平。图67A至67E示出了心脏数据。图67F和67G示出了肝数据。图67C和67E如下示出了相同长臂心脏人FXN值：在每组的5只小鼠之间求平均值(图67C)，并示出组中的每只单独小鼠的值(图67E)。该模型的心脏和肝中的人FXN和小鼠FXN用QPCR进行测量并以PBS组归一化。每个处理组具有5只小鼠(n＝5)。
图68示出了证明人FXN寡核苷酸对小鼠FXN潜在靶向的一系列示意图。左侧的示意图示出了对应于人FXN-375(顶部的图)和FXN-389(底部的图)潜在相互作用位置之小鼠FXN基因组区的USCS基因组视图。方框示出了寡核苷酸相对于小鼠基因组的图谱位置。右侧的图示出了人寡核苷酸序列与小鼠基因组的ClustalW比对。
图69是示出了相对于mRNA-Seq信号和核糖体定位的寡核苷酸位置的一系列图。每张图顶部的图中的信号示出了所有的核糖体定位数据(包括启动和延伸核糖体)。每张示意图底部的图中的信号示出了mRNA-Seq数据。方框中的黑色条表示指示的寡核苷酸位置。
图70A和70B是示出了用多种5’和3’端APOA1寡核苷酸处理之小鼠的肝中的APOA1mRNA水平的一系列图。对于图70A，在第5天收集肝，即在最后一个剂量的寡核苷酸或对照(PBS)后2天收集肝。对于图70B，在第7天收集肝，即在最后一个剂量的寡核苷酸或对照(PBS)后4天收集肝。
图70C和70D是示出了用多种5’和3’端APOA1寡核苷酸处理之小鼠中的APOA1蛋白水平的Western印迹照片。对于图70C，样品1至5是经PBS处理的动物，并且样品6至10来自经APOA1_mus-3+APOA1_mus-17寡核苷酸处理的动物。由星号表示的泳道10血液样品包含溶血作用，因此从分析中省略。对于图70D，样品1至5是经PBS处理的动物，并且样品6至10来自经APOA1_mus-7+APOA1_mus-20寡核苷酸处理的动物。图70D中顶部的印迹示出了来自所有10只动物的出血前数据。底部的图示出了在寡核苷酸处理之后的血浆APOA1水平。对照处理的样品4在研究期间死亡，因此从印迹中省略。
具体实施方式
本文中公开的方法和组合物可用于其中期望保护RNA免受降解(包括在细胞内或细胞外保护RNA)的多种不同情形。在一些实施方案中，提供了可用于以靶向方式在细胞中转录后改变蛋白质和/或RNA水平的方法和组合物。例如，提供了这样的方法，其涉及降低或防止所靶向RNA的降解或加工，从而升高所靶向RNA的稳态水平。在一些实施方案中，通过保护RNA的一端或两端(5’或3’端)免受核酸外切酶活性来提高RNA的稳定性，从而提高所述RNA的稳定性。
在一些实施方案中，提供了提高基因表达的方法。本文中使用的术语“基因表达”一般性地指基因产物在细胞、组织或对象中的水平或体现。应认识到，基因产物可以是例如RNA转录物或蛋白质。RNA转录物可以是编码蛋白质的RNA转录物。RNA转录物可以是非蛋白质编码的RNA转录物，例如，如长非编码RNA、长基因间非编码RNA、非编码RNA、miRNA、核小RNA(snRNA)或其他功能性RNA。在一些实施方案中，提高基因表达的方法可涉及在细胞中提高RNA转录物的稳定性，并由此提高RNA转录物的水平。提高基因表达的方法可替选地或另外地涉及提高RNA的转录或翻译。在一些实施方案中，本文中公开的方法可涉及操作基因表达的其他机制。
在一些实施方案中，本文中提供的方法涉及向细胞递送在或接近一端或两端与RNA转录物杂交的一种或更多种序列特异性寡核苷酸，从而保护RNA转录物免受核酸外切酶介导的降解。在其中所靶向的RNA转录物编码蛋白质的实施方案中，RNA的稳态水平提高通常导致所编码蛋白质的水平伴随地提高。在其中所靶向的RNA是非编码RNA的实施方案中，非编码RNA的稳态水平提高通常导致与非编码RNA相关的活性伴随地提高。
在一些实施方案中，基于通过提高RNA稳定性和/或翻译效率的机制使用靶向RNA转录物的寡核苷酸来调节RNA水平和/或蛋白质水平，本文中公开的方法可比其他类型的寡核苷酸或化合物(例如使用基于顺式或非编码的机制来改变靶RNA转录水平的寡核苷酸)具有若干优势。例如，在一些实施方案中，当靶向细胞质中的RNA转录物时，由于存在多个拷贝的靶分子，可使用较低浓度的寡核苷酸。相比之下，在一些实施方案中，靶向转录过程的寡核苷酸可能需要饱和细胞质并且在很多情况下发生在进入细胞核且与对应的基因组区相互作用之前，所述基因组区每个细胞仅有一个/两个拷贝。在一些实施方案中，由于RNA拷贝无需转录合成，因此对RNA转录物靶向的响应时间可更短。在一些实施方案中，可更容易实现连续的剂量响应。在一些实施方案中，明确的RNA转录物序列有利于设计靶向该转录物的寡核苷酸。在一些实施方案中，与其他类型的寡核苷酸(例如靶向转录过程的某些寡核苷酸)相比，本文中提供的寡核苷酸设计方法(例如，具有序列突出端、环以及其他特征的设计)有利于高寡核苷酸特异性和灵敏性。
在一些实施方案中，本文中提供的方法涉及使用通过在RNA的5’和/或3’区杂交来稳定RNA的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文中可将通过与RNA杂交来防止或抑制RNA降解的寡核苷酸称为“稳定化寡核苷酸(stabilizingoligonucleotide)”。在一些实例中，这样的寡核苷酸与RNA杂交并防止或抑制核酸外切酶介导的降解。抑制核酸外切酶介导的降解包括但不限于降低特定RNA被核酸外切酶降解的程度。例如，仅加工单链RNA的核酸外切酶由于该核酸外切酶不能有效地加工(例如，通过)双链体区而可切割直至寡核苷酸与RNA杂交之区域的RNA部分。因此，在一些实施方案中，使用靶向RNA之特定区域的寡核苷酸使得可将核酸外切酶降解所述RNA的程度控制为至该区域。例如，使用在RNA末端杂交的寡核苷酸可降低或消除仅加工单链RNA之核酸外切酶从该末端的降解。例如，使用在RNA5’端杂交的寡核苷酸可降低或消除加工单链RNA之核酸外切酶以5’至3’方向的降解。类似地，使用在RNA3’端杂交的寡核苷酸可降低或消除加工单链RNA之核酸外切酶以3’至5’方向的降解。在一些实施方案中，当寡核苷酸在RNA的5’和3’两个区均杂交时，可使用较低浓度的寡核苷酸。在一些实施方案中，在RNA之5’和3’两个区均杂交的寡核苷酸保护所述RNA的5’和3’区免受降解(例如，被核酸外切酶降解)。在一些实施方案中，在RNA的5’和3’两个区均杂交的寡核苷酸产生假环RNA(例如，具有从环突出的poly-A尾之区域的环化RNA，参见图3B)。在一些实施方案中，与非假环化RNA相比，假环RNA以更高的效率翻译。
在一些实施方案中，可使用这样的寡核苷酸，其包含多个与RNA互补的区域，以使得在一个区域寡核苷酸在或接近RNA的5’端杂交，并且在另一个区域，其在或接近RNA的3’端杂交，由此防止或抑制核酸外切酶在这两端降解RNA。在一些实施方案中，当寡核苷酸同时在或接近RNA的5’端并在或接近RNA的3’端杂交时，产生保护免受核酸外切酶介导之降解的环化复合物。在一些实施方案中，当寡核苷酸同时在或接近mRNA的5’端并在或接近mRNA的3’端杂交时，产生保护免受核酸外切酶介导之降解的环化复合物并且该复合物中的mRNA保留其翻译成蛋白质的能力。
本文中使用的术语“合成RNA”指通过体外转录反应或者通过人工(非天然)化学合成产生的RNA。在一些实施方案中，合成RNA是RNA转录物。在一些实施方案中，合成RNA编码蛋白质。在一些实施方案中，合成RNA是功能性RNA(例如，lncRNA、miRNA等)。在一些实施方案中，合成RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，合成RNA的长度为多至0.5千碱基(kb)、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb或更大。在一些实施方案中，合成RNA的长度为0.1kb至1kb、0.5kb至2kb、0.5kb至10kb、1kb至5kb、2kb至5kb、1kb至10kb、3kb至10kb、5kb至15kb，或1kb至30kb。
本文中使用的术语“RNA转录物”指已通过聚合酶由核酸转录的RNA。RNA转录物可在细胞内或细胞外产生。例如，可使用利用重组或经纯化聚合酶的体外转录反应由编码RNA转录物的DNA模板产生该RNA转录物。还可通过RNA聚合酶(例如，RNA聚合酶I、II或III)在细胞中由DNA模板(例如，染色体基因、表达载体)产生RNA转录物。在一些实施方案中，所述RNA转录物是编码蛋白质的mRNA。在一些实施方案中，所述RNA转录物是非编码RNA(例如，tRNA、rRNA、snoRNA、miRNA、ncRNA、长非编码RNA、shRNA)。在一些实施方案中，RNA转录物的长度为多至0.5千碱基(kb)、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb或更大。在一些实施方案中，RNA转录物的长度为0.1kb至1kb、0.5kb至2kb、0.5kb至10kb、1kb至5kb、2kb至5kb、1kb至10kb、3kb至10kb、5kb至15kb，或1kb至30kb。
在一些实施方案中，所述RNA转录物在转录后用例如7’-甲基鸟苷帽加帽。在一些实施方案中，在转录期间(例如，在RNA转录物的长度为20至50个核苷酸之前)通过鸟苷酸转移酶将7’-甲基鸟苷添加至RNA转录物。在一些实施方案中，7’-甲基鸟苷与第一转录的核苷酸通过5’-5’三磷酸桥连接。在一些实施方案中，紧接所述帽内侧的核苷酸为N6甲基化的腺苷。在一些实施方案中，紧接RNA转录物之所述帽内侧的第一和第二核苷酸不是2’-O-甲基化的核苷酸。在一些实施方案中，紧接RNA转录物之所述帽内侧的第一核苷酸是2’-O-甲基化的核苷酸。在一些实施方案中，紧接RNA转录物之所述帽内侧的第二核苷酸是2’-O-甲基化的核苷酸。在一些实施方案中，紧接RNA转录物之所述帽内侧的第一和第二核苷酸是2’-O-甲基化的核苷酸。
在一些实施方案中，RNA转录物是未加帽的转录物(例如，由线粒体基因产生的转录物)。在一些实施方案中，RNA转录物是经加帽但已去帽(decap)的核RNA。在一些实施方案中，RNA的去帽由去帽复合物催化，所述去帽复合物可由例如可与eIF-4E竞争结合帽的Dcp1和Dcp2构成。在一些实施方案中，RNA去帽的过程涉及水解RNA上的5’帽结构，从而使5’单磷酸暴露。在一些实施方案中，该5’单磷酸是核酸外切酶XRN1的底物。因此，在一些实施方案中，可使用靶向RNA之5’区的寡核苷酸来稳定(或恢复稳定性)经去帽的RNA，例如保护其免受核酸外切酶(例如XRN1)降解。
在一些实施方案中，可使用体外转录(例如，通过T7RNA聚合酶或其他合适的聚合酶来进行)来产生RNA转录物。在一些实施方案中，可在抗反向帽类似物(anti-reversecapanalog，ARCA)(TriLink目录.#N-7003)存在下进行转录。在一些实施方案中，用ARCA进行转录导致以期望方向在RNA上***帽(例如，帽类似物(mCAP))。
在一些实施方案中，在一个或更多个经修饰的核苷酸(例如，假尿苷、5-甲基胞嘧啶等)存在下进行转录，以使得所述经修饰的核苷酸并入到RNA转录物中。应认识到，可使用任何合适的经修饰核苷酸，其包括但不限于降低免疫刺激、增强翻译和提高核酸酶稳定性的经修饰核苷酸。可使用的经修饰核苷酸的非限制性实例包括：2’-氨基-2’-脱氧核苷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧核苷酸、2’-氟-2’-脱氧核苷酸、2’-O-甲基-核苷酸、2’糖超修饰剂(2’sugarsupermodifier)、2’-修饰的热稳定性增强剂、2’-氟-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2’-氟-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、2’-氟-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸、2’-氟-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基腺苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基胞苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基鸟苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基尿苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基肌苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基假尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2’-氟-胸苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸和N4-甲基胞苷-5’-三磷酸。在一个实施方案中，可降低/防止RNA降解或加工以升高稳态RNA和蛋白质水平(至少对编码蛋白质的转录物而言)。在一些实施方案中，RNA转录物的大部分降解由核酸外切酶来进行。在这样的实施方案中，这些酶从其3’或5’端开始破坏RNA。通过保护RNA转录物的末端免受核酸外切酶酶活性，例如通过具有用于在细胞内适当递送、杂交和稳定之合适化学性质的序列特异性阻断寡核苷酸的杂交，可提高RNA稳定性以及蛋白质水平(对编码蛋白质的转录物而言)。
在一些实施方案中，对于5’端，可使用完全/部分与RNA5’端的10-20nt互补的寡核苷酸。在一些实施方案中，这样的寡核苷酸可具有突出端以形成发夹来保护RNA5’帽的(例如，该寡核苷酸的3’核苷酸可以是但不限于与mRNA5’帽的G核苷相互作用的C)。在一些实施方案中，寡核苷酸的所有核苷酸均可与RNA转录物的5’端互补，无论是否有核苷酸突出端以产生平或凹5’RNA-寡核苷酸双链体。在一些实施方案中，对于3’端，寡核苷酸可部分地与RNA3’端的最后几个核苷酸互补，并且任选地可具有聚(T)段以保护poly(A)尾免于完全降解(对于具有poly(A)尾的转录物)。在一些实施方案中，类似的策略可用于具有不同5’和3’序列组成和结构的其他RNA种类(例如，包含3’聚(U)段的转录物或具有交替5’结构的转录物)。在一些实施方案中，与设计成与RNA序列完全(perfectly)互补的寡核苷酸相比，本文中所述的寡核苷酸(包括例如具有突出端的寡核苷酸)可对其靶RNA末端区域具有更高的特异性和灵敏性，因为突出端可对错配区域提供去稳定化作用并且优选在RNA5’或3’端的区域中结合。在一些实施方案中，寡核苷酸用成环机制(例如TTTTTTTTTTGGTTTTCC，SEQIDNO：458)来保护poly(A)尾的绝对(very)3’端。在一些实施方案中，这后一种方法可非特异性地靶向所有蛋白质编码转录物。然而，在一些实施方案中，这样的寡核苷酸可与其他靶特异性寡核苷酸组合使用。
在一些实施方案中，本文中提供的方法涉及使用包含互补区的寡核苷酸，所述互补区在或接近RNA转录物的第一个被转录核苷酸的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，稳定RNA转录物的寡核苷酸)包含互补区，所述互补区在开始于转录物5’端的100个核苷酸之内、50个核苷酸之内、30个核苷酸之内、20个核苷酸之内、10个核苷酸之内或5个核苷酸之内的位置处与RNA转录物(例如，具有至少5个连续核苷酸)互补。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，稳定RNA转录物的寡核苷酸)包含互补区，所述互补区在开始于转录物5’端的位置处与RNA转录物(例如，具有RNA转录物的至少5个连续核苷酸)互补。在一些实施方案中，寡核苷酸(例如，稳定RNA转录物的寡核苷酸)包含互补区，所述互补区在RNA转录物之5’非翻译区(5’UTR)的区域内与该RNA转录物互补，所述5’非翻译区的区域跨越转录起始位点至翻译起始位点(例如，起始密码子AUG，其出现于转录物的Kozak序列中)上游的50、100、150、200、250、500个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，RNA转录物是多腺苷酸化的。多腺苷酸化指向RNA转录物转录后添加聚腺苷(poly(A))尾。编码蛋白质的RNA转录物和非编码RNA转录物两者均可以被多腺苷酸化。poly(A)尾包含通过核苷间键连接在一起的多个腺苷。在一些实施方案中，poly(A)尾可包含10至50、25至100、50至200、150至250个或更多个腺苷。在一些实施方案中，多腺苷酸化的过程涉及在或接近RNA转录物3’端对其进行核酸内切切割，之后通过多腺苷酸聚合酶将多个腺苷逐一添加至转录物，所述腺苷中的第一个添加至转录物的3’切割位点处。因此，多腺苷酸化RNA转录物通常包含通过在3’端与poly(A)尾连接的核苷间键连接在一起的经转录核苷酸(和可能编辑的核苷酸)。本文中可将经转录核苷酸与poly(A)尾之间的键位置称为“多腺苷酸化接点”。在一些实施方案中，核酸内切切割可发生在RNA转录物中的几个可能位点中的任一个。在这样的实施方案中，所述位点可由RNA转录物中被核酸内切酶机制识别的序列基序确定，从而通过该机制引导切割位置。因此，在一些实施方案中，多腺苷酸化可由单一基因产生不同的RNA转录物，例如RNA转录物具有不同的多腺苷酸化接点。在一些实施方案中，poly(A)尾的长度可确定RNA转录物被具有3’-5’加工活性的核酸外切酶酶促降解的易感性。在一些实施方案中，在或接近RNA转录物3’端靶向其的寡核苷酸靶向与多腺苷酸化接点重叠的区域。在一些实施方案中，这样的寡核苷酸可具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸，其与转录物的转录部分(接点的5’)互补。在一些实施方案中，有利的具是与接点的polyA侧互补的有限数目的核苷酸(例如，T、U)。在一些实施方案中，具有与接点的polyA侧互补的有限数目的核苷酸是有利的，原因在于其降低了细胞中与寡核苷酸与非靶RNA的多腺苷酸化区之交叉杂交相关的毒性。在一些实施方案中，寡核苷酸具有仅1、2、3、4、5或6个与polyA区互补的核苷酸。
在一些实施方案中，本文中提供的方法涉及使用与靶RNA转录物在或接近其3’端杂交并防止或抑制RNA转录物被3’-5’核酸外切酶降解的寡核苷酸。例如，在一些实施方案中，本文中提供的RNA稳定化方法涉及使用包含互补区的寡核苷酸，所述互补区在RNA转录物之最后转录的核苷酸的100个核苷酸之内、50个核苷酸之内、30个核苷酸之内、20个核苷酸之内、10个核苷酸之内、5个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。在RNA转录物是多腺苷酸化转录物的情况下，RNA转录物之最后转录的核苷酸为多腺苷酸化接点上游的第一个核苷酸。在一些实施方案中，本文中提供的RNA稳定化方法涉及使用包含互补区的寡核苷酸，所述互补区在紧邻或重叠于RNA转录物之多腺苷酸化接点的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，本文中提供的RNA稳定化方法涉及使用包含互补区的寡核苷酸，所述互补区与在poly(A)尾内的RNA转录物互补。
用于鉴定转录物起始位点和多腺苷酸化接点的方法在本领域中是已知的，并且可用于选择与这些区域特异性结合以稳定RNA转录物的寡核苷酸。在一些实施方案中，3’端寡核苷酸可通过使用对poly-A尾进行定量末段分析鉴定RNA3’端来设计。在一些实施方案中，5’端寡核苷酸可通过使用帽分析基因表达(Capanalysisgeneexpression，CAGE)鉴定5’起始位点来设计。合适的方法在以下中进行了公开：例如，Ozsolak等ComprehensivePolyadenylationSiteMapsinYeastandHumanRevealPervasiveAlternativePolyadenylation.Cell.第143卷，第6期，2010，第1018-1029页；Shiraki，T，等，Capanalysisgeneexpressionforhigh-throughputanalysisoftranscriptionalstartingpointandidentificationofpromoterusage.ProcNatlAcadSciUSA.100(26)：15776-81.2003-12-23；和Zhao，X，等，(2011).SystematicClusteringofTranscriptionStartSiteLandscapes.PLoSONE(PublicLibraryofScience)6(8)：e23409，其内容各自通过引用并入本文。还可使用用于鉴定转录物起始位点和多腺苷酸化接点的其他合适方法，包括例如RNA配对末端标签(Paired-endtag，PET)(参见，例如RuanX，RuanY.MethodsMolBiol.2012；809：535-62)；使用标准EST数据库；与微阵列或测序(PAS-Seq)组合的RACE(参见，例如PeterJ.Shepard，等，RNA.2011年4月；17(4)：761-772)；和3P-Seq(参见，例如CalvinH.Jan，Nature.2011年1月6日；469(7328)：97-101)；等。
在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是真核生物细胞的RNA转录物。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是脊椎动物细胞的RNA转录物。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是哺乳动物细胞(例如，灵长类动物细胞、小鼠细胞、大鼠细胞或人细胞)的RNA转录物。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是心肌细胞的RNA转录物。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是在细胞核中转录的RNA。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是在细胞线粒体中转录的RNA。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是通过RNA聚合酶II酶转录的RNA转录物。
在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是由选自以下之基因表达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、PTEN、MECP2和FOXP3。在一些实施方案中，本文中公开的寡核苷酸靶向的RNA转录物是由选自以下之基因表达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYRPC3、NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。这些以及其他基因的RNA转录物可例如使用RNA测序(RNA-Seq)或其他合适的方法实验性地选择或鉴定。还可基于公共数据库(例如UCSC、Ensembl和NCBI基因组浏览器等)中的信息选择RNA转录物。某些基因的RNA转录物的非限制性实例列于表1中。
表1：某些基因的RNA转录物的非限制性实例
寡核苷酸
本文中提供的寡核苷酸可用于通过抑制或防止RNA降解(例如，由核酸外切酶介导的降解)来稳定RNA。可将这样的寡核苷酸称为“稳定化寡核苷酸”。在一些实施方案中，寡核苷酸在RNA的5’和/或3’区杂交，产生通过防止被具有单链加工活性的核酸外切酶降解来稳定RNA的双链体区。
在一些实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其具有与RNA转录物之5’区的至少5个连续核苷酸互补的区域。在一些实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其具有与RNA转录物之3’区的至少5个连续核苷酸互补的区域。在一些实施方案中，提供了具有第一区和第二区的寡核苷酸，所述第一区与RNA转录物的5’区的至少5个连续核苷酸互补，所述第二区与RNA转录物的3’区的至少5个连续核苷酸互补。
在一些实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其具有与mRNA转录物之5’-UTR的至少5个连续核苷酸互补的区域。在一些实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其具有与mRNA转录物之3’-UTR的至少5个连续核苷酸、mRNA转录物之poly(A)尾的至少5个连续核苷酸或重叠于mRNA转录物之多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补的区域。在一些实施方案中，提供了具有第一区和第二区的寡核苷酸，所述第一区与mRNA转录物的5’-UTR的至少5个连续核苷酸互补，所述第二区与mRNA转录物之3’-UTR的至少5个连续核苷酸、mRNA转录物之poly(A)尾的至少5个连续核苷酸或重叠于mRNA转录物之多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。
在一些实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其具有在接近RNA转录物5’端位置处与该RNA转录物互补的互补区。在这样的实施方案中，寡核苷酸之互补区3’端的核苷酸可在RNA转录物之转录起始位点的10个核苷酸之内、20个核苷酸之内、30个核苷酸之内、40个核苷酸之内、50个核苷酸之内、或100个核苷酸之内、200个核苷酸之内、300个核苷酸之内、400个核苷酸或更多之内的位置处与该RNA转录物互补。
在一些实施方案中，提供了这样的寡核苷酸，其具有在接近RNA转录物3’端位置处与该RNA转录物互补的互补区。在这样的实施方案中，互补区3’端和/或5’端的核苷酸可在RNA转录物3’端的10个核苷酸之内、20个核苷酸之内、30个核苷酸之内、40个核苷酸之内、50个核苷酸之内、100个核苷酸之内、200个核苷酸之内、300个核苷酸之内、400个核苷酸或更多之内的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，如果靶RNA转录物被多腺苷酸化，则寡核苷酸之互补区3’端的核苷酸可在多腺苷酸化接点的10个核苷酸之内、20个核苷酸之内、30个核苷酸之内、40个核苷酸之内、50个核苷酸之内、100个核苷酸之内、200个核苷酸之内、300个核苷酸之内、400个核苷酸或更多之内的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，靶向RNA之3’区的寡核苷酸包含这样的互补区，其为与腺嘌呤互补的嘧啶的段(例如，4至10或5至15个胸腺嘧啶核苷酸)。
在一些实施方案中，使5’靶向和3’靶向寡核苷酸的组合与靶RNA接触。在一些实施方案中，5’靶向和3’靶向寡核苷酸通过接头(例如，不与靶RNA互补的核苷酸段)连接在一起。在一些实施方案中，5’靶向寡核苷酸的互补区与靶RNA中这样的区域互补，所述区域为与3’端靶向寡核苷酸之互补区互补的靶RNA区上游的至少2、5、10、20、50、100、500、1000、5000、10000个核苷酸。
在一些实施方案中，提供了具有通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1具有与RNA转录物互补(例如，与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补)的互补区。在一些实施方案中，X1之互补区3’端的核苷酸可与接近RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补。在一些实施方案中，X1之互补区3’端的核苷酸可与存在于RNA转录物之转录起始位点的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸之内的核苷酸互补。在一些实施方案中，X1之互补区3’端的核苷酸可与RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补。
在一些实施方案中，X1包含5至10个核苷酸、5至15个核苷酸、5至25个核苷酸、10至25个核苷酸、5至20个核苷酸，或15至30个核苷酸。在一些实施方案中，X1包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，X1的互补区可与RNA转录物的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，X1的互补区可与RNA转录物的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个连续核苷酸互补。
在一些实施方案中，不存在X2。在一些实施方案中，X2包含1至10个核苷酸、1至20个核苷酸、1至25个核苷酸、5至20个核苷酸、5至30个核苷酸、5至40个核苷酸，或5至50个核苷酸。在一些实施方案中，X2包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，X2包含与RNA转录物的至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连续核苷酸互补的互补区。在一些实施方案中，X2包含与RNA转录物的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个连续核苷酸互补的互补区。
在一些实施方案中，RNA转录物在其5’端具有7-甲基鸟苷帽。在一些实施方案中，X1之互补区3’端的核苷酸与紧接7-甲基鸟苷帽内侧或接近所述帽的RNA转录物的核苷酸互补(例如与所述帽的10个核苷酸互补)。在一些实施方案中，X25’端的至少第一核苷酸为与鸟嘌呤互补的嘧啶(例如，胞嘧啶或其类似物)。在一些实施方案中，X25’端的第一和第二核苷酸为与鸟嘌呤互补的嘧啶。因此，在一些实施方案中，X25’端的至少1个核苷酸为可与所述帽的7-甲基鸟苷形成稳定氢键的嘧啶。
在一些实施方案中，X2形成茎-环结构。在一些实施方案中，X2包含式5’-Y1-Y2-Y3-3’，其中X2形成具有环区和茎区的茎-环结构，所述环区包含Y2的核苷酸，所述茎区包含与Y3的至少两个连续核苷酸杂交的Y1的至少两个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述茎区包含1至6、1至5、2至5、1至4、2至4或2至3个核苷酸。在一些实施方案中，所述茎区包含LNA核苷酸。在一些实施方案中，所述茎区包含1至6、1至5、2至5、1至4、2至4或2至3个LNA核苷酸。在一些实施方案中，Y1和Y3独立地包含2至10个核苷酸、2至20个核苷酸、2至25个核苷酸，或5至20个核苷酸。在一些实施方案中，Y1和Y3独立地包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，Y2包含3至10个核苷酸、3至15个核苷酸、3至25个核苷酸，或5至20个核苷酸。在一些实施方案中，Y2包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，Y2包含2至8、2至7、2至6、2至5、3至8、3至7、3至6、3至5或3至4个核苷酸。在一些实施方案中，Y2包含至少1个DNA核苷酸。在一些实施方案中，Y2的核苷酸包含至少1个(例如、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25个或更多个腺嘌呤)。在一些实施方案中，Y3在茎区3’端之后包含1至5、1至4、1至3或1至2个核苷酸。在一些实施方案中，Y3在茎区3，端之后的核苷酸是DNA核苷酸。在一些实施方案中，Y3包含与鸟嘌呤互补的嘧啶(例如，胞嘧啶或其类似物)。在一些实施方案中，Y3在茎区3’端之后的位置(例如，茎区3’端之后的1、2、3或更多个核苷酸)包含一个或更多个(例如，两个)与鸟嘌呤互补的嘧啶。因此，在RNA转录物是加帽的实施方案中，Y3可具有与帽的7-甲基鸟苷形成稳定化氢键的嘧啶。
在一些实施方案中，X1和X2与RNA转录物的非重叠区互补。在一些实施方案中，X1包含与RNA转录物的5’区互补的区域，而X2包含与RNA转录物的3’区互补的区域。例如，如果RNA转录物被多腺苷酸化，则X2可包含这样的互补区，其在RNA转录物之多腺苷酸化接点的100个核苷酸之内、50个核苷酸之内、25个核苷酸之内，或10个核苷酸之内的区域处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，X2包含这样的互补区，其在紧邻或重叠于RNA转录物之多腺苷酸化接点的位置处与该RNA转录物互补。在一些实施方案中，X2包含至少2个连续的嘧啶核苷酸(例如，5至15个嘧啶核苷酸)，其与RNA转录物的poly(A)尾的腺嘌呤核苷酸互补。
在一些实施方案中，提供了包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1包含至少2个与腺嘌呤形成碱基对的核苷酸(例如，胸苷或尿苷或其类似物)；并且X2包含与多腺苷酸化RNA转录物的至少3个连续核苷酸互补的互补区，其中X2之互补区5’端的核苷酸与RNA转录物中紧接RNA转录物之多腺苷酸化接点内侧的核苷酸互补。在这样的实施方案中，X1可包含2至10、2至20、5至15或5至25个核苷酸，并且X2可独立地包含2至10、2至20、5至15或5至25个核苷酸。
在一些实施方案中，提供了包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的组合物，所述第一寡核苷酸包含通过核苷间键连接的至少5个核苷酸(例如，5至25个核苷酸)，所述第二寡核苷酸包含通过核苷间键连接的至少5个核苷酸(例如，5至25个核苷酸)，其中第一寡核苷酸与接近RNA转录物5’端的至少5个连续核苷酸互补，并且第二寡核苷酸与接近RNA转录物3’端的至少5个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的5’端与第二寡核苷酸的3’端连接。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的3’端与第二寡核苷酸的5’端连接。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的5’端与第二寡核苷酸的5’端连接。在一些实施方案中，第一寡核苷酸的3’端与第二寡核苷酸的3’端连接。
在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸通过接头连接。术语“接头”一般性地指能够将两个或更多个寡核苷酸共价连接的化学部分。在一些实施方案中，在某些生物环境下(例如，在哺乳动物细胞提取物如内体提取物中)，接头对切割具有抗性。然而，在一些实施方案中，接头中包含或含有的至少一个键能够被切割(例如，在生物环境下，例如在哺乳动物提取物如内体提取物中)，以使得至少两个寡核苷酸在键切割之后不再彼此共价连接。在一些实施方案中，接头不是具有与RNA转录物互补之序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，接头是寡核苷酸(例如，2至8个胸腺嘧啶)。在一些实施方案中，接头是多肽。还可使用其他合适的接头，包括例如于2013年3月21日公开之标题为MULTIMERICANTISENSEOLIGONUCLEOTIDES的国际专利申请公开WO2013/040429A1中公开的接头。该公开涉及接头的内容通过引用以其整体并入本文。
寡核苷酸可具有与靶RNA转录物(例如，哺乳动物mRNA转录物)互补的区域，其与脱靶(off-target)RNA转录物之等效长度的每条核苷酸序列具有低于阈值水平的互补性。例如，寡核苷酸可设计成确保其不具有在细胞中靶向除靶RNA转录物之外的RNA转录物的序列。序列同一性的阈值水平可以是50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性。
寡核苷酸可与由不同物种(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、猴等)间的基因同源物编码的RNA转录物互补。在一些实施方案中，可体内或体外测试具有这些特征的寡核苷酸在多个物种(例如，人和小鼠)中的效力。该方法还有利于通过选择其中存在人疾病之合适动物的物种来开发治疗该疾病的临床候选物。
在一些实施方案中，寡核苷酸的互补区与靶RNA的至少8至15、8至30、8至40、或10至50、或5至50、或5至40个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，互补区与靶RNA的至少8个连续核苷酸互补。
互补(如该术语在本领域中使用)指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸某一位置的核苷酸能够与靶RNA对应位置的核苷酸氢键键合，则寡核苷酸的该核苷酸和靶RNA的该核苷酸在所述位置处彼此互补。当每个分子中足够数量的对应位置被可通过其碱基彼此氢键键合的核苷酸占据时，寡核苷酸和靶RNA彼此互补。因此，“互补”为这样的术语，其用于指示足以使得寡核苷酸和靶RNA之间发生稳定且特异性结合的互补性或精确配对的程度。例如，如果寡核苷酸一个位置的碱基能够与靶RNA对应位置的碱基氢键键合，则认为这些碱基在所述位置处彼此互补。不要求100％互补性。
寡核苷酸可与靶RNA的连续核苷酸至少80％互补(任选地至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一互补)。在一些实施方案中，与靶RNA的连续核苷酸部分相比，寡核苷酸可包含1、2或3个碱基错配。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有15个碱基至多3个错配，或者10个碱基至多2个错配。
在一些实施方案中，互补的核酸序列无需与其靶标的核酸序列100％互补以成为可特异性杂交的。在一些实施方案中，当寡核苷酸与靶RNA的杂交防止或抑制靶RNA降解时，并且当具有足够程度的互补性以在期望避免非特异性结合的条件下避免序列与非靶标序列非特异性结合时，用于本公开内容目的的寡核苷酸可与靶RNA特异性杂交，所述条件例如在生理条件下(在体内测定或治疗性治疗的情况下)和在于合适严格条件下进行测定的条件下(在体外测定的情况下)。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为8至50、10至30、9至20、15至30或8至80个核苷酸。
碱基配对可包括典型的Watson-Crick碱基配对和非Watson-Crick碱基配对(例如，Wobble碱基配对和Hoogsteen碱基配对)两者。应理解，对于互补的破基配对而言，腺苷型破基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，通用碱基(例如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚)可与任意A、C、U或T杂交，并且认为其与任意A、C、U或T互补。本领域中也已认为肌苷(I)为通用碱基并且认为其与任意A、C、U或T互补。
在一些实施方案中，本文中提供的序列(包括序列表中提供的序列)中的任意一个或更多个胸苷(T)核苷酸(或其经修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其经修饰的核苷酸)可被适于与腺苷核苷酸碱基配对(例如通过Watson-Crick碱基对)的任意其他核苷酸替换。在一些实施方案中，本文中提供的序列(包括序列表中提供的序列)中的任意一个或更多个胸苷(T)核苷酸(或其经修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其经修饰的核苷酸)可适当地被不同的嘧啶核苷酸替换，反之亦然。在一些实施方案中，本文中提供的序列(包括序列表中提供的序列)中的任意一个或更多个胸苷(T)核苷酸(或其经修饰的核苷酸)可适当地被尿苷(U)核苷酸(或其经修饰的核苷酸)替换，反之亦然。
在一些实施方案中，寡核苷酸可具有不含鸟苷核苷酸段(例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个连续鸟苷核苷酸)的序列。在一些实施方案中，与无鸟苷核苷酸段的寡核苷酸相比，具有鸟苷核苷酸段的寡核苷酸具有提高的非特异性结合和/或脱靶作用。在一些实施方案中，连续出现三个或更多个G或C可能不是优选的。因此，在一些实施方案中，寡核苷酸不包含三个或更多个鸟苷核苷酸的段。
寡核苷酸可具有这样的序列，其具有大于30％的G-C含量、大于40％的G-C含量、大于50％的G-C含量、大于60％G-C的G-C含量、大于70％的G-C含量，或大于80％的G-C含量。寡核苷酸可具有这样的序列，其具有至多100％的G-C含量、至多95％的G-C含量、至多90％的G-C含量，或至多80％的G-C含量。在一些实施方案中，寡核苷酸的GC含量优选为约30％至60％。
应理解，本文中提供的任何寡核苷酸均可排除在外。
在一些实施方案中，已发现本文中公开的寡核苷酸可使靶RNA的稳定性提高至少约50％(即，正常值的150％或1.5倍)或约2倍至约5倍。在一些实施方案中，稳定性(例如，在细胞中的稳定性)可提高至少约15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍，或前述任意数值之间的任何范围。在一些实施方案中，已显示mRNA稳定性提高与蛋白表达提高相关。类似地，在一些实施方案中，非编码RNA的稳定性提高与RNA的活性提高成正相关。
应理解，说明书通篇对寡核苷酸或其他分子之用途的任何提及均考虑寡核苷酸或其他分子在制备用于治疗与RNA转录物水平或活性降低相关之病症或疾病的药物组合物或药物中的用途。因此，作为一个非限制性实例，本发明的这一方面包括寡核苷酸或其他分子在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述治疗涉及以靶向方式转录后改变蛋白质和/或RNA水平。
寡核苷酸修饰
在一些实施方案中，提供了具有适于在细胞中递送、杂交和稳定以靶向并稳定RNA转录物的化学性质的寡核苷酸。另外，在一些实施方案中，提供了可用于控制寡核苷酸的药代动力学、生物分布、生物利用度和/或效力的寡核苷酸化学物质。因此，本文中所述的寡核苷酸可以是经修饰的，例如包含经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键、经修饰的核苷酸和/或其组合。另外，所述寡核苷酸可表现出以下一种或更多种特性：基本不诱导靶RNA的切割或降解；基本不导致靶RNA的完全切割或降解；不激活RNAaeH途径；不激活RISC；不募集任何Argonaute家族蛋白；不被Dicer切割；不介导选择性剪接；不具有免疫刺激性；具有核酸酶抗性；与未经修饰的寡核苷酸相比，细胞摄取改善；对细胞或哺乳动物没有毒性；和可具有改善的内体脱离(endosomalexit)。
设计成与RNA相互作用以调节基因表达的寡核苷酸是来自设计成结合DNA靶标(例如，与由其转录RNA的潜在基因组DNA序列互补)之那些的碱基序列的独特亚组。
本文中公开的任意寡核苷酸可与本文中公开的一种或更多种其他寡核苷酸通过接头(例如，可切割的接头)连接。
可例如通过引入修饰(例如核苷酸修饰)对抗核溶解降解来稳定化本发明的寡核苷酸。例如，本发明的核酸序列在核苷酸序列5’或3’端的至少第一、第二或第三核苷酸间键包含硫代磷酸酯(phosphorothioate)。作为另一个实例，核酸序列可包含2’-修饰的核苷酸，例如2’-脱氧、2’-脱氧-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O--N-甲基乙酰胺基(2’-O--NMA)。作为另一个实例，核酸序列可包含至少一个2’-O-甲基-修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，所有核苷酸均包含2’-O-甲基修饰。在一些实施方案中，核酸是“锁定的”，即，包含这样的核酸类似物，其中核糖环被连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥“锁定”。
本文中所述之寡核苷酸的任意经修饰的化学性质或形式可彼此组合，并且同一分子中可包含1、2、3、4、5种或更多种不同类型的修饰。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸可包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个桥连核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸可包含桥连核苷酸，例如锁核酸(lockednucleicacid，LNA)核苷酸、约束乙基(constrainedethyl，cEt)核苷酸或亚乙基桥连核酸(ethylenebridgednucleicacid，ENA)核苷酸。这样的核苷酸的实例在本文中进行了公开并且是本领域中已知的。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含以下美国专利或专利申请公开之一中公开的核苷酸类似物：US7,399,845、US7,741,457、US8,022,193、US7,569,686、US7,335,765、US7,314,923、US7,335,765和US7,816,333、US20110009471，其全部内容各自出于所有目的而通过引用并入本文。寡核苷酸可具有一个或多个2’O-甲基核苷酸。寡核苷酸可完全由2’O-甲基核苷酸组成。
寡核苷酸通常具有一个或多个核苷酸类似物。例如，与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比，寡核苷酸可以具有导致所述寡核苷酸的Tm升高1℃、2℃、3℃、4℃或5℃范围的至少一个核苷酸类似物。与不具有核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，寡核苷酸可以具有导致所述寡核苷酸的Tm总共升高2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或更大的多个核苷酸类似物。
寡核苷酸的长度可为至多50个核苷酸，其中所述寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30、2至40、2至45个或更多个核苷酸为核苷酸类似物。寡核苷酸的长度可为8至30个核苷酸，其中所述寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30个核苷酸为核苷酸类似物。
寡核苷酸的长度可为8至15个核苷酸，其中所述寡核苷酸的2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至11、2至12、2至13、2至14个核苷酸为核苷酸类似物。任选地，所述寡核苷酸可具有除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰核苷酸之外的每个核苷酸。
所述寡核苷酸可完全由桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)组成。所述寡核苷酸可包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-氟-脱氧核糖核苷酸。所述寡核苷酸可包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。所述寡核苷酸可包含交替的脱氧核糖核苷酸和ENA核苷酸类似物。所述寡核苷酸可包含交替的脱氧核糖核苷酸和LNA核苷酸。所述寡核苷酸可包含交替的LNA核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。所述寡核苷酸可具有为桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸，cEt核苷酸，ENA核苷酸)的5’核苷酸。所述寡核苷酸可具有为脱氧核糖核苷酸的5’核苷酸。
所述寡核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸的5’和3’端上各自以至少一个桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)为侧翼的脱氧核糖核苷酸。所述寡核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸的5’和3’端上各自以1、2、3、4、5、6、7、8或更多个桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)为侧翼的脱氧核糖核苷酸。所述寡核苷酸的3’位可具有3’羟基。所述寡核苷酸的3’位可具有3’硫代磷酸酯(thiophosphate)。
所述寡核苷酸可缀合有标签。例如，所述寡核苷酸可在其5’或3’端缀合有生物素部分、胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适配体、肽(例如CPP)、疏水性分子(例如脂质)、脱唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor，ASGPR)配体(例如GalNac)，或动态多缀合物及其变体。
优选地，寡核苷酸包含一种或更多种修饰，所述修改包括：经修饰的糖部分，和/或经修饰的核苷间键，和/或经修饰的核苷酸和/或其组合。并非给定寡核苷酸中的所有位置必需是均匀修饰的，并且实际上可在单一寡核苷酸中或者甚至在寡核苷酸的单个核苷中引入本文中所述的一种以上修饰。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸是嵌合寡核苷酸，其包含两个或更多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸通常包含赋予一种或更多种有益特性(例如，如核酸酶抗性提高、细胞摄取提高、对靶标的结合亲和力提高)之经修饰核苷酸的至少一个区域，和为能够切割RNA：DNA或RNA：RNA杂交体之酶的底物的区域。本发明的嵌合寡核苷酸可形成为上述两种或更多种寡核苷酸、经修饰寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。本领域中还已将这样的化合物称为杂交体或缺口体(gapmer)。教导制备这样的杂交体结构的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个在糖的2’位进行了修饰的核苷酸，最优选2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟修饰的核苷酸。在另一些优选实施方案中，RNA修饰包括嘧啶核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’O-甲基修饰，无碱基残基或RNA3’端的倒置碱基。这样的修饰常规地引入到寡核苷酸中并且已表明：针对给定靶标，这些寡核苷酸比2’-脱氧寡核苷酸具有更高的Tm(即，较高的靶标结合亲和力)。
已表明，很多核苷酸和核苷修饰使得引入其的寡核苷酸比天然寡脱氧核苷酸具有更大的核酸酶消化抗性；与未经修饰的寡核苷酸相比，这些经修饰的寡核苷酸完整存活更长的时间。经修饰寡核苷酸的特定实例包括包含经修饰的骨架的那些，例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或者短链杂原子或杂环糖间键。在一些实施方案中，寡核苷酸可具有硫代磷酸酯骨架；杂原子骨架，例如亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架；酰胺骨架(参见DeMesmaeker等Ace.Chem.Res.1995，28：366-374)；吗啉代骨架(参见Summerton和Weller，美国专利No.5,034,506)；或肽核酸(peptidenucleicacid，PNA)骨架(其中寡核苷酸的磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架取代，核苷酸与聚酰胺骨架的氮杂氮原子直接或间接结合，参见Nielsen等，Science1991，254,1497)。含磷键包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基及其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，和具有常规3’-5’键的硼烷磷酸酯(boranophosphate)、这些的2’-5’连接类似物，以及其中相邻对的核苷单元以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接的具有反向极性的那些；参见美国专利no.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455，233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
基于吗啉代的寡聚化合物在以下中进行了描述：DwaineA.Braasch和DavidR.Corey，Biochemistry，2002，41(14)，4503-4510)；Genesis，第30卷，第3期，2001；Heasman，J.，Dev.Biol.，2002，243，209-214；Nasevicius等，Nat.Genet.，2000，26，216-220；Lacerra等，Proc.Natl.Acad.Sci.，2000，97,9591-9596；和美国专利No.5,034,506，授权于1991年7月23日。在一些实施方案中，基于吗啉代的寡聚化合物是二氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(phosphorodiamidatemorpholinooligomer，PMO)(例如，如Iverson，Curr.Opin.Mol.Ther.，3：235-238，2001；和Wang等，J.GeneMed.，12：354-364，2010中所述，其公开内容通过引用整体并入本文)。
Wang等，J.Am.Chem.Soc.，2000，122，8595-8602中对环己烯基核酸寡核苷酸模拟物进行了描述。
其中不含磷原子的经修饰寡核苷酸骨架具有由以下形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或者一个或更多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜及砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他骨架；参见美国专利no.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其各自通过引用并入本文。
还已知的是这样的经修饰寡核苷酸，其包括基于***糖核苷酸(arabinonucleotide)或经修饰的***糖核苷酸残基或者由***糖核苷酸或经修饰的***糖核苷酸残基构建的寡核苷酸。***糖核苷是核糖核苷的立体异构体，不同之处仅在于糖环2’位的构型。在一些实施方案中，2’-***糖修饰是2’-F***糖。在一些实施方案中，经修饰的寡核苷酸是2’-氟-D-***糖核酸(FANA)(如例如Lon等，Biochem.，41：3457-3467，2002和Min等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，12：2651-2654，2002中所述的；其公开内容通过引用整体并入本文)。类似的修饰还可发生在糖上的其他位置，特别是3’端核苷上糖的3’位或2’-5’连接的寡核苷酸中和5’端核苷酸的5’位。
PCT公开No.WO99/67378公开了用于通过与互补的信使RNA缔合来提高基因表达的序列特异性抑制的***糖核酸(ANA)寡聚体及其类似物。
其他优选的修饰包括亚乙基桥连核酸(ENA)(例如，国际专利公开No.WO2005/042777，Morita等，NucleicAcidRes.，Suppl1：241-242，2001；Surono等，Hum.GeneTher.，15：749-757，2004；Koizumi，Curr.Opin.Mol.Ther.，8：144-149，2006和Horie等，NucleicAcidsSymp.Ser(Oxf)，49：171-172，2005；其公开内容通过引用整体并入本文)。优选的ENA包括但不限于2’-O，4’-C-亚乙基-桥连核酸。
LNA的实例在WO/2008/043753中进行了描述并且包括以下通式的化合物：
其中X和Y独立地选自基团-O-，
-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是双键的一部分)，
-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是双键的一部分)，
-CH＝CH-，其中R选自氢和C1-4烷基；Z和Z＊独立地选自核苷间键、端基或保护基团；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分；并且不对称基团可以以任意方向存在。
优选地，用于本文中所述的寡核苷酸的LNA包含至少一个根据任意下式的LNA单元：
其中Y是-O-、-S-、-NH-或N(RH)；Z和Z＊独立地选自核苷间键、端基或保护基团；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分；并且RH选自氢和C1-4烷基。
在一些实施方案中，用于本文中所述的寡核苷酸的锁核酸(LNA)包含至少一个根据PCT/DK2006/000512之方案2中所示的任意式的锁核酸(LNA)单元。
在一些实施方案中，用于本发明寡聚体的LNA包含选自以下的核苷间键：-0-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-0-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-0-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-0-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-，其中RH选自氢和C1-4烷基。
LNA单元的另一些实例如下所示：
术语“硫代-LNA”包含其中上述通式中的X或Y中的至少一个选自S或-CH2-S-的锁核苷酸。硫代-LNA可呈β-D和α-L两种构型。
术语“氨基-LNA”包含其中上述通式中的X或Y中的至少一个选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-的锁核苷酸，其中R选自氢和C1-4烷基。氨基-LNA可呈β-D和α-L两种构型。
术语“氧基-LNA”包含其中上述通式中的X或Y中的至少一个表示-O-或-CH2-O-的锁核苷酸。氧基-LNA可呈β-D和α-L两种构型。
术语“ena-LNA”包含其中上述通式中的Y是-CH2-O-的锁核苷酸(其中-CH2-O-的氧原子与相对于碱基B的2’位连接)。
在本文中对LNA进行了另外的详细描述。
还可包含一个或更多个经取代的糖部分，例如在2’位的以下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n是1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、经取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；经取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告子基团；***物(intercalator)；用于提高寡核苷酸的药代动力学特性的基团；或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。优选的修饰包括2’-甲氧基乙氧基[2’-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)](Martin等，HeIv.Chim.Acta，1995，78，486)。其他优选的修饰包括2’-甲氧基(2’-O-CH3)，2’-丙氧基(2’-OCH2CH2CH3)和2’-氟(2’-F)。类似的修饰还可发生在寡核苷酸上的其他位置处，特别是3’端核苷酸上糖的3’位和5’端核苷酸的5’位。寡核苷酸还可具有糖模拟物(例如环丁基类)来取代戊呋喃糖基。
寡核苷酸还可另外地或可替选地包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。本文中使用的“未经修饰”或“天然”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括仅罕见或短暂地存在于天然核酸中的核碱基，例如次黄嘌呤；6-甲基腺嘌呤；5-Me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2’脱氧胞嘧啶并且在本领域中通常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC及龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC、异胞嘧啶、假异胞嘧啶，以及合成核碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤和2，6-二氨基嘌呤或其他二氨基嘌呤。参见，例如Kornberg，“DNAReplication，”W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco，1980，第75-77页；和Gebeyehu，G.，等Nucl.AcidsRes.，15：4513(1987))。还可包括本领域中已知的“通用”碱基，例如肌苷。已表明，5-Me-C取代使核酸双链体的稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi，inCrooke，和Lebleu，编辑，AntisenseResearchandApplications，CRCPress，BocaRaton，1993，第276-278页)并且可用作碱基取代。
并非给定寡核苷酸中的所有位置必需是均匀修饰的，并且实际上可在单一寡核苷酸中或者甚至在寡核苷酸的单个核苷中引入本文中所述的一种以上修饰。
在一些实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即，骨架)两者均用新基团取代。保留碱基单元以用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物(即已表明具有优异杂交特性的寡核苷酸模拟物)称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架(例如氨基乙基甘氨酸骨架)取代。保留核碱基并且与骨架酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利no.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自通过应用并入本文。PNA化合物的更多教导可见于Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500中。
寡核苷酸还可包含一种或更多种核碱基(在本领域中通常称为“碱基”)修饰或取代。本文中使用的“未经修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤，以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。
此外，核碱基包括美国专利No.3,687,808中公开的那些；“TheConciseEncyclopediaofPolymerScienceAndEngineering”，第858-859页，Kroschwitz，编辑JohnWiley&Sons，1990中公开的那些；Englisch等，AngewandleChemie，InternationalEdition，1991，30，第613页公开的那些，以及Sanghvi，第15章，AntisenseResearchandApplications，”第289-302页，Crooke，和Lebleu，编辑，CRCPress，1993公开的那些。这些核碱基中的某些特别地可用于提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明，5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体的稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi，等，编辑，“AntisenseResearchandApplications，”CRCPress，BocaRaton，1993，第276-278页)，并且是目前优选碱基取代，甚至更特别地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。经修饰的核碱基在以下中进行了描述：美国专利no.3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692和5,681,941，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，寡核苷酸与增强所述寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或更多个部分或缀合物化学连接。例如，相同或不同类型的一种或更多种寡核苷酸可彼此缀合；或者寡核苷酸可与增强对细胞类型或组织类型的特异性的靶向部分缀合。这样的部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)，胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)，硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.，1992，20，533-538)，脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Kabanov等，FEBSLett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75，49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995，36，3651-3654；Shea等，Nucl.AcidsRes.，1990，18，3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Mancharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14，969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995，36，3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或十八胺或己基氨基-羰基-t氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。还参见美国专利no.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082，830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，其各自通过引用并入本文。
这些部分或缀合物可包括与官能团(例如伯或仲羟基)共价结合的缀合物基团。本发明的缀合物基团可包括***物、报告子分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体的药效学特性的基团以及增强寡聚体的药代动力学特性的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的情形下增强药效学特性的基团包括提高摄取、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸序列特异性杂交的基团。在本发明的情形下增强药代动力学特性的基团包括提高本发明化合物的摄取、分布、代谢或分泌的基团。代表性的缀合物基团公开在于1992年10月23日提交的国际专利公开No.PCT/US92/09196，和美国专利No.6,287,860中，其通过引用并入本文。缀合物部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分，胆酸，硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醇，硫代胆固醇，脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯，聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸，棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见，例如美国专利No.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,37l；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941。
在一些实施方案中，寡核苷酸修饰包括对寡核苷酸5’或3’端的修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸的3’端包含羟基或硫代磷酸酯。应认识到，寡核苷酸的5’或3’端可与另外的分子(例如，生物素部分或荧光体)缀合。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与5’核苷酸缀合的生物素部分。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含锁核酸(LNA)、ENA修饰的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和ENA修饰的核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和锁核酸核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含交替的锁核酸核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的5’核苷酸为锁核酸核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的核苷酸包括脱氧核糖核苷酸的5’和3’端上各自以至少一个锁核酸核苷酸为侧翼的脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸3’位的核苷酸具有3’羟基或3’硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，寡核苷酸在至少两个核苷酸之间包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方案中，寡核苷酸在所有核苷酸之间都包含硫代磷酸酯核苷酸间键。
应认识到，寡核苷酸可具有如本文中所述的修饰的任意组合。
所述寡核苷酸可包含具有以下一种或更多种修饰模式的核苷酸序列。
(a)(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx和(X)xxxxxX，
(b)(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX和(X)xxxxXX，
(c)(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX和(X)XxXxXx，
(d)(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx和(X)XXXXxx，
(e)(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX和(X)XXXXXx，以及
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX和XXXXXXx，其中“X”指核苷酸类似物，(X)指任选的核苷酸类似物并且“x”指DNA或RNA核苷酸单元。上列模式各自可单独地或与其他公开的修饰模式组合地在寡核苷酸中出现一次或更多次。
用于调节基因表达的方法
在一个方面，本发明涉及用于调节(例如，提高)细胞中RNA转录物稳定性的方法。细胞可以是体外的、离体的或体内的。细胞可以在患有由于RNA转录物的表达或活性或者在mRNA的情况下其相应的蛋白质产物降低而引起的疾病的对象中。在一些实施方案中，用于调节细胞中RNA转录物稳定性的方法包括向细胞递送靶向RNA的寡核苷酸并且防止或抑制其被核酸外切酶降解。在一些实施方案中，向细胞递送寡核苷酸导致靶RNA的稳定性比对照细胞中靶RNA的稳定性水平提高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高。合适的对照细胞可以是没有向其递送寡核苷酸的细胞或向其递送阴性对照(例如，乱序的寡核苷酸、载体等)的细胞。
本发明的另一个方面提供了治疗与对象中低水平的特定RNA相关的疾病或病症的方法。因此，在一些实施方案中，提供的方法包括向对象(例如，人)施用包含如本文所述寡核苷酸的组合物以出于提高蛋白质水平的目的来提高所述对象细胞中的mRNA稳定性。在一些实施方案中，蛋白质水平的提高比施用前对象中(例如，对象的细胞或组织中)或未施用寡核苷酸或已施用阴性对照(例如，乱序的寡核苷酸、载体等)的对照对象中的蛋白质的量高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更多。在一些实施方案中，提供的方法包括向对象(例如，人)施用包含如本文所述的寡核苷酸的组合物以出于提高那些非编码RNA的活性的目的来提高所述对象细胞中非编码RNA的稳定性。
对象可包括非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、山羊、牛或马。在一些优选的实施方案中，对象是人。在治疗动物(包括人)的疾病状态中，可将寡核苷酸用作治疗部分。寡核苷酸可以为有用的治疗方式，其可被配置为在用于治疗细胞、组织和动物(尤其是人)的治疗方案中有用。
对于治疗，根据本发明通过施用寡核苷酸来治疗疑似患有与低水平的RNA或蛋白质相关之疾病的动物(优选人)。例如，在一个非限制性实施方案中，所述方法包括向需要治疗的动物施用治疗有效量的如本文所述的寡核苷酸的步骤。表1列出了可通过用稳定化寡核苷酸靶向mRNA转录物治疗的疾病或病症的示例性实例。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用的细胞可以是，例如，从患有表1中列出的一种或更多种病症的对象获得的细胞，或者从是表1中列出的一种或更多种病症的疾病模型的对象获得的细胞。
表1：用靶向相关mRNA的寡核苷酸可治疗的疾病或病症的实例。
制剂、递送和给药
可将本文所述的寡核苷酸配制成用于向对象施用以治疗与基因表达水平降低或者导致基因表达水平降低的RNA转录物不稳定性或低稳定性(例如，蛋白质水平降低或功能性RNA(例如mRNA、snoRNA、lncRNA等)水平降低)相关的病症。应理解，可用本文公开的任何寡核苷酸来实现制剂、组合物和方法。
制剂可方便地以单位剂型的形式存在并且可通过药学领域公知的任何方法来制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分(例如，本发明的寡核苷酸或化合物)的量将根据所治疗的宿主、具体的施用方式(例如，皮内或吸入)而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果(例如，肿瘤消退)的化合物的那个量。
根据本领域已知的用于制备药物的任何方法来制备本发明的药物制剂。这样的制剂可包含甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂。制剂可与适合用于制备的无毒可药用赋形剂混合。制剂可包括一种或更多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，并可以以如液体剂、散剂、乳剂、冻干粉、喷雾剂、霜剂、洗剂、控释制剂、片剂、丸剂、凝胶剂、贴剂上、植入物中、等形式提供。
配制的寡核苷酸组合物可呈现多种状态。在一些实例中，组合物是至少部分结晶的、均匀结晶的和/或无水的(例如，小于80％、50％、30％、20％或10％的水)。在另一个实例中，寡核苷酸在水相中，例如，在包含水的溶液中。水相或结晶的组合物可以例如被并入到递送载剂中，例如，脂质体(特别是对于水相)或颗粒(例如，对于结晶组合物可能适合的微颗粒)。通常，以与预期的施用方法兼容的方式配制寡核苷酸组合物。
在一些实施方案中，通过以下方法中的至少一种制备组合物：喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的组合；或者用脂质超声、冷冻干燥、冷凝及其他自组装。
可以与另一种药剂(例如，另一种治疗剂或稳定寡核苷酸的药剂，例如，与寡核苷酸复合的蛋白质)组合来配制或施用(一起或单独)寡核苷酸制剂。其他药剂还包括螯合剂，例如EDTA(例如，为了除去二价阳离子例如Mg2+)、盐、RNAse抑制剂(例如，广谱特异性RNAse抑制剂，例如RNAsin)等。
在一个实施方案中，寡核苷酸制剂包含另一种寡核苷酸，例如，调节第二基因表达的第二寡核苷酸或调节第一基因表达的第二寡核苷酸。其他制剂还可包含至少3、5、10、20、50或100或更多种不同的寡核苷酸种类。这样的寡核苷酸可介导关于相似数目的不同基因的基因表达。在一个实施方案中，寡核苷酸制剂包含至少第二治疗剂(例如，除寡核苷酸之外的药剂)。
本文公开的任何制剂、赋形剂、载剂等可适于或用于帮助向细胞递送合成RNA(例如，环化的合成RNA)。本文公开的制剂、赋形剂、载剂等可适于或用于帮助在体外或体内向细胞递送合成RNA。例如，合成RNA(例如，环化的合成RNA)可与纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球体、lipidoid、脂质体复合物(lipoplex)、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖(simplesugar))、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血酶、迅速消除的脂质纳米颗粒(rapidlyeliminatedlipidnanoparticle，reLNP)及其组合一起配制。在一些实施方案中，合成RNA可裸(gymnotically)递送至细胞。在一些实施方案中，寡核苷酸或合成RNA可与帮助递送至细胞的因子缀合。在一些实施方案中，合成RNA或用于环化合成RNA的寡核苷酸与碳水化合物(例如GalNac)或其他靶向部分缀合。
递送途径
可以通过多种途径向对象递送包含寡核苷酸的组合物。示例性的途径包括：静脉内、皮内、表面、直肠、肠胃外、***、***内、鼻内、肺、眼。术语“治疗有效量”是在待治疗的对象中提供期望的基因表达水平(例如，通过稳定RNA转录物)以得到预期的生理响应所需的组合物中存在的寡核苷酸的量。术语“生理有效量”是递送至对象以产生所需的减轻或疗效的量。术语“可药用载体”意指可向对象施用而对所述对象没有显著不利的毒理学作用的载体。
本发明的寡核苷酸分子可以并入适于施用的药物组合物中。这样的组合物通常包含一种或更多种寡核苷酸物质和可药用载体。如本文所使用的词语“可药用载体”旨在包含与药物施用兼容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这样的介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域中公知的。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑它们在组合物中的用途。补充的活性化合物也可并入组合物中。
根据期望的是局部治疗还是全身治疗以及根据待治疗的区域，可以以许多方式施用本发明的药物组合物。施用可以是表面(包括眼部、***、直肠、鼻内、经皮)、经口或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、或鞘内或心室内施用。
可以选择施用途径和部位以增强靶向性。例如，为了靶向肌细胞，肌内注射到目的肌肉将是合理的选择。可通过以气雾剂形式施用寡核苷酸来靶向肺细胞。可通过用寡核苷酸涂覆球囊导管并机械地引入寡核苷酸来靶向血管内皮细胞。
表面施用指的是通过将制剂与对象的表面直接接触而向所述对象进行递送。最常见的表面递送形式是向皮肤进行递送，但是本文公开的组合物还可直接施加至身体的其他表面，例如眼睛、粘膜、体腔表面或内表面。如上所述，最常见的表面递送是向皮肤递送。该术语涵盖多种施用途径，包括但不限于：表面和经皮。这些施用方式通常包括渗透经皮肤渗透性屏障并有效递送至靶组织或层。表面施用可用作渗透表皮和真皮并最终实现组合物的全身递送的手段。表面施用也可用作向对象的表皮或真皮，或至其特定层，或至下面的组织选择性地递送寡核苷酸的手段。
用于表面施用的制剂可包括经皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂和散剂。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可能是必要的或期望的。涂覆的避孕套、手套等也可能是有用的。
经皮递送是用于施用脂溶性治疗剂的重要途径。真皮比表皮渗透性更大，因而通过擦伤、烧伤或剥蚀皮肤吸收更加迅速。提高血液流向皮肤的炎症和其他生理病症也增加了经皮吸收。可通过使用油性载剂(涂擦剂)或通过使用一种或更多种渗透增强剂来增强通过该途径的吸收。通过经皮途径递送本文所公开组合物的其他有效方式包括水化皮肤和使用控制释放的表面贴剂。经皮途径提供了递送本文公开的组合物以用于全身和/或局部治疗的潜在有效手段。此外，离子电渗疗法(在电场的影响下通过生物膜转移离子溶质)、超声透入疗法(phonophoresis)或超声促渗疗法(sonophoresis)(使用超声来增强多种治疗剂穿过生物膜，尤其是皮肤和角膜的吸收)，以及相对于给药位置和施用部位的保持优化载剂特性可以是用于增强表面施加的组合物穿过皮肤和粘膜部位运输的有用方法。
口和鼻粘膜两者相对于其他施用途径具有优势。例如，通过这些膜施用的寡核苷酸可以迅速起作用、提供治疗性血浆水平、避免肝代谢的首过效应、并且避免寡核苷酸暴露于恶劣的胃肠(GI)环境。另外的优点包括容易进入膜部位，以使得可以局部施加寡核苷酸并容易除去。
在经口递送中，可将组合物靶向口腔的表面，例如舌下粘膜，其包括舌腹侧表面的膜与口腔底或构成面颊衬里的颊粘膜。舌下粘膜相对可渗透，因而产生迅速吸收并对许多药剂具有可接受的生物利用度。此外，舌下粘膜是方便的，可接受的和容易进入的。
还可通过从定量的喷雾分配器(如上所述的混合胶束药物制剂和推进剂)喷入口腔内(而不用吸入)将寡核苷酸的药物组合物施用至人的口腔。在一个实施方案中，将药物制剂和推进剂喷入口腔中之前先摇动分配器。
用于经口施用的组合物包括散剂或颗粒剂、混悬剂或在水中的溶液剂、糖浆剂、浆剂(slurry)、乳剂、酏剂或无水介质、片剂、胶囊剂、锭剂或糖锭。在片剂的情况下，可以使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸的盐。在片剂中常用多种崩解剂(例如淀粉)和润滑剂(例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石等)。对于胶囊剂形式的经口施用，有用的稀释剂是乳糖和高分子量聚乙二醇。当需要用于经口使用的水混悬剂时，核酸组合物可与乳化剂和混悬剂组合。如果需要的话，可添加某些甜味剂和/或矫味剂。
肠胃外施用包括静脉内滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、鞘内或心室内施用。在一些实施方案中，肠胃外施用涉及向疾病部位直接施用(例如，注射进肿瘤中)。
用于肠胃外施用的制剂可包括无菌的水溶液，其还可含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可通过心室内导管(例如，连接至储存器)帮助心室内注射。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
本文所述的任何寡核苷酸可施用至眼组织。例如，组合物可施加于眼的表面或附近的组织，例如，眼睑内。对于眼部施用，可通过本领域已知的眼递送***(例如涂药器或滴眼管)来递送软膏剂或可滴液体。这样的组合物可包含拟粘膜剂(mucomimetic)(例如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇))，防腐剂(例如山梨酸、EDTA或苄基铬氯化物(benzylchroniumchloride))，以及通常量的稀释剂和/或载体。寡核苷酸也可施用至眼的内部，并且可通过针或可将其引入至选定区域或结构的其他递送装置来引入。
可通过由患者吸入分散体来递送经肺递送的组合物以使得分散体中的组合物(优选寡核苷酸)可达到肺部，在那里其可通过肺泡区容易地直接吸收到血液循环中。肺递送对于全身递送和局部递送二者都可有效地治疗肺的疾病。
可通过不同的方法(包括使用雾化、喷雾、胶束和基于干粉的制剂)来实现肺递送。可用液体喷雾器、基于气雾剂的吸入器和干粉分散装置来实现递送。优选定量的装置。使用雾化器或吸入器的好处之一是可将污染的可能性最小化，因为这些装置是独立的。干粉分散装置，例如，递送易于将配制成干粉的药剂。寡核苷酸组合物可以冻干的或喷雾干燥的粉末单独，或与合适的粉末载体组合稳定地储存。可通过给药定时元件来介导用于吸入的组合物的递送，所述元件可包含计时器、剂量计数器、时间测量装置或者时间指示器，当将其并入装置时能够使得在施用气雾剂药物期间对患者进行剂量跟踪、顺从性监测和/或剂量触发。
术语“散剂”意指由细分散固体颗粒组成的组合物，其自由流动且能够被容易地分散在吸入装置中并随后由对象吸入以使得颗粒到达肺部以允许渗透进入肺泡中。因此，散剂被认为是“可呼吸性的”。优选的平均粒径小于约10μm直径，优选具有相对均匀的球体形状分布。更优选直径小于约7.5μm，且最优选小于约5.0μm。通常粒径分布为约0.1μm至约5μm直径，特别地为约0.3μm至约5μm。
术语“干”意指组合物的水分含量按重量计低于约10％(％w)水，通常低于约5％w，优选小于约3％w。干组合物可能是这样的，以使得颗粒易于分散在吸入装置中形成气雾剂。
可用作载体的药用赋形剂的类型包括稳定剂例如人血清白蛋白(HSA)；填充剂例如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐例如氯化钠；等。这些载体可以是结晶的或无定形形式，或者可以是这两者的混合物。
合适的pH调节剂或缓冲剂包括由有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；优选柠檬酸钠。可通过具有推进剂(例如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚以及其他非CFC和CFC推进剂)的定量喷雾装置来实现胶束寡核苷酸制剂的肺施用。
示例性的装置包括被引入到血管***中的装置，例如，***血管组织内腔中的装置，或者本身形成血管***一部分的装置，包括支架、导管、心脏瓣膜和其他血管装置。可将这些装置(例如，导管或支架)放置在肺、心脏或腿的血管***中。
其他装置包括非血管装置，例如，植入腹膜或器官或腺体组织的装置，例如，人造器官。除了寡核苷酸，该装置还可释放治疗物质，例如，装置可以释放胰岛素。
在一个实施方案中，通过植入装置分配包含寡核苷酸之组合物的单位剂量或经测量的剂量。该装置可包含监控对象中参数的传感器。例如，装置可包含泵，例如，和任选地相关电子设备。
可以用寡核苷酸离体处理组织(例如，细胞)或器官，然后在对象中施用或植入对象中。所述组织可以是自体、同种异体或异种组织。例如，可治疗组织以减少移植物抗宿主病。在另一些实施方案中，组织是同种异体的并且处理组织以治疗特征在于在该组织中有不期望的基因表达的病症。例如，可以处理组织(例如，造血细胞(例如，骨髓造血细胞))以抑制不期望的细胞增殖。可将经处理的组织(无论自体的或移植的)的引入与其他疗法组合。在一些实施中，将经寡核苷酸处理的细胞与其他细胞隔离，例如，通过半渗透性多孔屏障，其防止细胞离开植入物，但能够使得来自身体的分子达到细胞以及细胞产生分子进入身体。在一个实施方案中，多孔屏障由藻酸盐形成。
在一个实施方案中，避孕装置涂覆有或含有寡核苷酸。示例性的装置包括避孕套、隔膜、IUD(可植入的子宫装置)、海绵、***鞘和节育装置。
剂量
在一个方面，本发明的特征在于向对象(例如，人对象)施用寡核苷酸(例如，以化合物或作为组合物的组分)的方法。在一个实施方案中，单位剂量为约10mg/kg体重至25mg/kg体重。在一个实施方案中，单位剂量为约1mg/kg体重至100mg/kg体重。在一个实施方案中，单位剂量为约0.1mg/kg体重至500mg/kg体重。在一些实施方案中，单位剂量为高于0.001mg/kg、0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或100mg/kg体重。
所定义的量可以是有效治疗或预防疾病或病症(例如，与低水平RNA或蛋白质相关的疾病或病症)的量。例如，可通过注射(例如，静脉内或肌内)、吸入给药或表面施加来施用单位剂量。
在一些实施方案中，每日施用单位剂量。在一些实施方案中，频率少于每天一次，例如，小于每2天、4天、8天或30天一次。在另一个实施方案中，不按频率(例如，不按规律的频率)施用单位剂量。例如，可以单次施用单位剂量。在一些实施方案中，多于每天一次地施用单位剂量，例如，1小时、2小时、4小时、8小时、12小时一次等。
在一个实施方案中，向对象施用初始剂量和一个或更多个维持剂量的寡核苷酸。维持剂量通常低于初始剂量，例如，为初始剂量的一半。维持方案可包括以每天0.0001mg/kg体重至100mg/kg体重，例如每天100mg/kg、10mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg、0.01mg/kg、0.001mg/kg或0.0001mg/kg体重的剂量范围来治疗对象。可不超过每1、5、10或30天一次来施用维持剂量。此外，治疗方案可以持续一段时间，其将取决于特定疾病的性质、疾病严重程度和患者的总体状况来进行变化。在一些实施方案中，不超过每天一次，例如，不超过每24小时、36小时、48小时或更多小时一次，例如不超过每5天或8天一次来递送剂量。治疗后，可监测患者情况的变化以及疾病状态之症状的减轻。在患者没有对当前剂量水平作出明显响应的情况下可以提高寡核苷酸的剂量；或者如果观察到疾病状态的症状减轻，如果该疾病状态已经被消除，或者如果观察到不期望的副作用，则可以降低剂量。
如期望的或在具体情况下认为适当时，可以以单剂量或以两个或更多个剂量施用有效剂量。如果需要帮助重复或频繁的输注，可取的是植入输送装置，例如，泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储存器。
在一些情况下，用寡核苷酸与其他治疗模式联合治疗患者。
成功治疗后，可期望使患者经受维持治疗以防止疾病状态的复发，其中以0.0001mg/kg体重至100mg/kg体重的维持剂量施用本发明的化合物。
寡核苷酸组合物的浓度是足以有效地治疗或预防病症或调节人的生理状况的量。施用的寡核苷酸的浓度或量将取决于对于药剂所确定的参数和施用的方法(例如经鼻、口、肺)。例如，经鼻制剂可倾向于需要更低浓度的一些成分以避免鼻通道的刺激或烧灼。有时候需要将经口制剂稀释至10至100倍以提供合适的鼻制剂。
某些因素可能影响有效治疗对象所需的剂量，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的一般健康和/或年龄、以及存在的其他疾病。而且，用治疗有效量的寡核苷酸对对象进行治疗可包括单一治疗，或优选地，可包括一系列的治疗。还应理解，在特定治疗的过程中，用于治疗的寡核苷酸的有效剂量可提高或减低。例如，在施用寡核苷酸组合物之后可监测对象。基于来自监测的信息，可以施用额外量的寡核苷酸组合物。
给药取决于待治疗的疾病状况的严重性和响应性，治疗过程持续数天至数月，或直至达到痊愈或实现疾病状态的减轻。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳剂量可根据各个化合物的相对效力而变化，并且通常可基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50进行估计。
在一个实施方案中，寡核苷酸组合物的施用是肠胃外的，例如，静脉内(例如，以快速推注或以可扩散的输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经粘膜、口腔、舌下、内窥镜、直肠、经口、***、表面、肺、鼻内、尿道或眼。可以通过对象或通过另一人(例如，医疗服务人员)来提供施用。可以以测定的剂量或递送测量剂量的分配器的形式来提供组合物。在下文中更加详细地讨论了所选的递送模式。
药盒
在本发明的某些方面，提供了药盒，其包含装有包含寡核苷酸之组合物的容器。在一些实施方案中，组合物是包含寡核苷酸和可药用载体的药物组合物。在一些实施方案中，可以在一个容器中提供所述药物组合物的各个组分。或者，可以期望在两个或更多个容器中分别提供所述药物组合物的组分，例如，一个容器用于寡核苷酸，而至少另一个容器用于载体化合物。所述药盒可包装在许多不同的结构中，例如在一个盒子中的一个或更多个容器中。例如，根据药盒提供的说明书可将不同的组分进行组合。可以根据本文所述的方法将这些组分进行组合，以例如制备和施用药物组合物。药盒还可包含递送装置。
通过以下实施例进一步举例说明本发明，其不应被解释为以任何方式进一步的限制。在整个本申请中引用的所有参考文献的全部内容(包括文献参考、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1.用于靶向RNA5’和3’端的寡核苷酸
本文构想了几个示例性的寡核苷酸设计方案以用于提高mRNA的稳定性。关于靶向RNA3’端的寡核苷酸，构想了至少两个示例性设计方案。作为第一方案，将寡核苷酸设计为在poly-A尾之前与RNA3’端互补(图1)。作为第二方案，将寡核苷酸被设计为与RNA3’端互补且具有与polyA尾杂交的5’poly-T区(图1)。
关于靶向RNA5’端的寡核苷酸，构想了至少三个示例性的设计方案。对于方案一，将寡核苷酸设计为与RNA5’端互补(图2)。对于方案二，将寡核苷酸设计为与RNA5’端互补，并具有3’突出端以产生具有凹缺末端的RNA-寡核苷酸双链体。在该实施例中，所述突出端是一个或更多个C核苷酸(例如，两个C)，其可潜在地与5’甲基鸟苷帽相互作用并进一步稳定该帽(图2)。所述突出端也可潜在地是另一种类型的核苷酸，并且不限于C。对于方案3，将寡核苷酸设计为包含环区以稳定5’RNA帽。
使用实施例2中概述的方法测试如实施例1所述设计的寡核苷酸通过提高mRNA的稳定性来上调RNA的能力。
实施例2：靶向弗氏共济失调蛋白5’和3’端的寡核苷酸
材料和方法：
实时PCR
用LifeTechnologiesCells-to-Ct试剂盒和StepOnePlus仪器完成RNA分析、cDNA合成和QRT-PCR。还测定了多种组成型表达的管家基因之mRNA的基准水平。出于比较目的，选择具有近似相同基准表达水平的“对照”管家基因作为靶基因。
Western印迹
如先前所述进行Western印迹。以1∶1000稀释度使用KLF4抗体(CellSignaling4038S)。使用荧光标记的抗-兔抗体在UVPChemicDoc-It仪器上获取图像。
ELISA
根据制造商的说明，使用AbcamFrataxinELISA试剂盒(ab115346)进行ELISA测定。
细胞系
使用本领域已知的条件培养细胞。在表2中提供了本文所述的实验中使用的细胞系的详细说明。
表2：细胞
放线菌素D处理
向细胞培养基添加10微克/ml浓度的放线菌素D(LifeTechnologies)并进行孵育。根据制造商的说明使用Trizol(Sigma)进行RNA分离。FXN和c-Myc探针均购自LifeTechnologies。
寡核苷酸设计
将寡核苷酸设计为靶向FXNmRNA的5’和3’端。使用如前所述的poly-A尾的定量末端分析通过鉴定推定的mRNA3’端来设计3’端寡核苷酸(参见，例如，Ozsolak等，ComprehensivePolyadenylationSiteMapsinYeastandHumanRevealPervasiveAlternativePolyadenylation.Cell.第143卷，第6期，2010，第1018-1029页)。图4示出了所鉴定的poly-A位点。通过使用如前所述的帽分析基因表达(CAGE)鉴定可能的5’起始位点来设计5’端寡核苷酸(参见，例如，Capanalysisgeneexpressionforhigh-throughputanalysisoftranscriptionalstartingpointandidentificationofpromoterusage.ProcNatlAcadSciUSA.100(26)：15776-81.2003-12-23和Zhao，Xiaobei(2011)“SystematicClusteringofTranscriptionStartSiteLandscapes”.PLoSONE(PublicLibraryofScience)6(8)：e23409)。图5示出了所鉴定的5’起始位点。图6提供了设计的5’和3’端寡核苷酸的位置。
还使用公共数据集计算了某些设计的寡核苷酸相对于mRNA-Seq信号和核糖体定位的寡核苷酸位置(Guo，H.，Ingolia，N.T.，Weissman，J.S.，&Bartel，D.P.(2010).MammalianmicroRNAspredominantlyacttodecreasetargetmRNAlevels.Nature，466(7308)，835-40.doi：10.1038/nature09267)。相对于这些数据集的寡核苷酸位置示于图69中。
在表3中示出了各个寡核苷酸的序列和结构。表5提供了用于表3、7、8、9、10、11和12中测试和描述的某些寡核苷酸的核苷酸类似物、修饰和核苷酸内键的描述。在表3和表4中的某些寡核苷酸具有两个寡核苷酸名称：“寡核苷酸名称”和“替代的寡核苷酸名称”，其在本文中可互换使用，并且应理解为指相同的寡核苷酸。
表3：靶向FXN5’和3’端的寡核苷酸
表4：靶向FXN的另一些寡核苷酸
表5：寡核苷酸修饰
用寡核苷酸体外转染细胞
以25,000个细胞/500μl的密度将细胞接种到24孔板的每个孔中，并用Lipofectamine和单链寡核苷酸进行转染。对照孔只含有Lipofectamine。在转染后的不同时间点将约200μL的细胞培养物上清液储存在-80℃以用于ELISA或Western印迹分析，并且从另一等分试样的细胞收获RNA并如上所述进行定量PCR。通过以存在对照(只含Lipofectamine)的mRNA水平归一化存在寡核苷酸的mRNA水平来测定各寡核苷酸对靶mRNA表达的诱导百分比。
作为对照，测试了寡核苷酸的细胞毒性作用。经测定，转染有寡核苷酸的细胞在100nM或400nM的寡核苷酸浓度下没有表现出细胞毒性(图15)。
结果：
靶向FXNmRNA5’和3’端的单链寡核苷酸的体外递送上调了FXN表达
选择FXN作为用于RNA稳定化的示例性靶标，原因是FXN是对上调具有挑战性的管家基因。使用上述方法针对FXNmRNA推定的5’和3’端来设计寡核苷酸。首先分别测试然后以组合的形式测试3’和5’寡核苷酸。
最初在来自患有弗里德赖希共济失调的患者的细胞系(细胞系GM03816)中筛选出3’和5’寡核苷酸。图7和8示出了转染有FXN3’端靶向寡核苷酸的细胞系的结果，证明若干种3’寡核苷酸能够上调FXNmRNA。示出显示oligo73、75、76和77最大程度地上调FXNmRNA。在对这四个寡核苷酸的序列进行检查后，确定oligo73、75、76和77含有poly-T序列(图9)。推测这些寡核苷酸与poly-A尾之前的3’最末端结合，从而保护3’端免于降解。这些结果证明了设计为靶向3’端的寡核苷酸可上调FXN表达。这些结果还表明靶向直接邻近poly-A尾或与其重叠的3’-最末端的寡核苷酸可上调mRNA水平。
图10示出了转染有FXN5’端靶向寡核苷酸的GM03816细胞系的结果，证明了若干种5’寡核苷酸能够上调FXNmRNA表达。图11和12示出了在GM03816细胞系中筛选FXN5’端寡核苷酸与FXN3’寡核苷酸75组合的结果。寡核苷酸51和75、52和75、57和75以及62和75的组合示出FXNmRNA表达的最高上调。在对5’寡核苷酸的序列进行检查后，确定了oligo51、52、57和62均包含基序CGCCCTCCAG，其作图为FXNmRNA同工型的推定5’起始位点(图13)。推测寡核苷酸结合在FXNmRNA的5’-最末端，从而保护5’端免于降解。Oligo62包含超出该基序的非常长的突出端序列，推测其可形成环结构，所述环结构通过与5’甲基鸟苷帽相互作用进一步保护5’端(图14)。这些结果表明靶向mRNA5’最末端(其可以邻近5’-甲基鸟苷帽)对于上调mRNA是有效的。
然后，在GM03816FRDA患者细胞系中筛选来自先前的5’和3’实验的阳性寡核苷酸命中的组合。确定了所测试的若干种寡核苷酸组合的FXNmRNA水平接近于GM0321B正常成纤维细胞中的FXNmRNA的水平，表明这些寡核苷酸组合都能够上调FXNmRNA(图16)。然后测量了转染后2天和3天的FXNmRNA水平并证实了在转染后2天和3天观察到的稳态FXNmRNA水平的提高(图17)。然后验证了阳性命中并示出在第二细胞系(GM04078FRDA患者的成纤维细胞)中是有效的(图18)。最后，在“正常的”细胞系(GM0321B成纤维细胞)中验证了命中。发现即使在正常的细胞系中寡核苷酸也可上调FXNmRNA(图19)。总之，这些结果表明5’和3’靶向寡核苷酸的组合能够上调FXN表达，并且在一些情况下，这些组合可以比单独使用5’或3’寡核苷酸更有效。
选择一个示例性5’和3’寡核苷酸组合，oligo62和oligo77以用于进一步优化。示出所有浓度均上调GM03816FRDA患者细胞系中的FXN，并在转染后2至3天示出稳态FXNmRNA水平的提高(图20)。这些结果表明，寡核苷酸在很宽的浓度范围内(10nM至400nM)有效。
然后研究了单独寡核苷酸和寡核苷酸的组合对FXN之蛋白质水平的作用。用100nM的单独寡核苷酸或200nM终浓度的2种寡核苷酸处理GM03816FRDA患者成纤维细胞，并测量FXN蛋白的水平。示出若干种单独寡核苷酸和寡核苷酸的组合将FXN蛋白的表达上调了一定程度。用寡核苷酸52和75、寡核苷酸64和52、寡核苷酸51和76、寡核苷酸52和76、寡核苷酸62和77、以及寡核苷酸62和76的组合进行处理在转染后第3天引起FXN蛋白的显著上调(图21和22)。这些结果表明5’和3’靶向寡核苷酸能够上调FXN蛋白水平。
然后，测量不同寡核苷酸存在下FXNmRNA的稳定性。推测寡核苷酸提高FXNmRNA稳定性，而不提高FXNmRNA的转录。为了测试该推测，在转录抑制剂放线菌素D(ActD)存在下用寡核苷酸转染细胞。在ActD存在下，寡核苷酸组合62和75、52和75以及57和75具有更高水平的FXNmRNA，表明与未经处理的细胞相比，FXNmRNA在经寡核苷酸组合处理的细胞中更稳定(图23和24)。
最后，在另外的细胞系中测试了若干种寡核苷酸的组合。从弗里德赖希共济失调的患者获得一组细胞系(细胞系GM15850)，以及从其未受影响的同胞获得一组细胞系(细胞系GM15851)。从弗里德赖希共济失调的患者获得另一些细胞系(细胞系GM16209)以及从其未受影响的半同胞获得另一些细胞系(细胞系GM16222)。发现，用寡核苷酸52和76的组合、寡核苷酸57和76的组合、以及寡核苷酸62和76的组合进行处理显著上调了FXNmRNA水平(图25)。在GM15850细胞系中，用寡核苷酸52和76或寡核苷酸57和76处理的细胞中之FXNmRNA的水平接近未受影响的同胞的细胞中之FXNmRNA的水平。这些结果进一步表明5’和3’端靶向寡核苷酸在上调FXNmRNA中的功效。
总的来说，这些结果表明5’和3’端靶向寡核苷酸对于上调mRNA和蛋白质表达是有效的，而且这种表达的上调很可能是通过mRNA的稳定化来实现的。
作为另一个实验，将5’和3’端靶向寡核苷酸进一步与对FXN基因中的序列具有特异性的另一些寡核苷酸组合(表6)。在添加这些寡核苷酸的亚组后，进一步增强了5’和3’寡核苷酸的上调，表明提供靶向RNA或基因基因座的多个区域的寡核苷酸(例如，5’靶向寡核苷酸、3’靶向寡核苷酸和内侧靶向寡核苷酸)可能是用于上调mRNA表达水平的另一种方法(图26)。
表6：其他靶向FXN
实施例3.与FXN有关的另一些寡核苷酸实验
实施例3中进行的实验使用了与实施例2相同的方法，不同之处在于所使用的寡核苷酸浓度为10nM和40nM。发现转染10nM或40nM寡核苷酸在转染后第2天和第3天对细胞没有细胞毒性(图38)。
在10nM和40nM浓度下筛选3’和5’端靶向寡核苷酸并在转染后第2天和第3天测量FXNmRNA。发现一个亚组的寡核苷酸在10nM或40nM剂量下能够上调FXNmRNA(图27-29)。
在10nM和40nM浓度下筛选5’和3’端寡核苷酸的组合并在转染后第2天和第3天测量FXNmRNA。发现一个亚组的寡核苷酸组合在10nM或40nM剂量下能够上调FXNmRNA(图30-33)。
还发现靶向FXN(例如，内侧、接近poly-A尾或横跨外显子)的另一些寡核苷酸在10nM或40nM的剂量下能够上调FXNmRNA(图34)。
进行另外的实验来进一步证明在10nM和40nM的浓度下，使用单一寡核苷酸或寡核苷酸的组合可提高FXNmRNA水平(图35-37)。
然后，在10nM和40nM的浓度下，单独地测试5’和3’端靶向寡核苷酸上调FXN蛋白水平的能力。确定了在10nM和40nM的浓度下，在转染后第2天和第3天一个亚组的寡核苷酸能够上调FXN蛋白水平(图39和40)。该结果表明，即使在低至10nM的浓度下，5’和3’靶向寡核苷酸及其组合也能够上调FXNmRNA和蛋白质。
实施例4.用于提高mRNA稳定性的另一些寡核苷酸
设计了若干种另外的寡核苷酸来靶向RNA的5’端、RNA的3’端或靶向RNA的5’端和3’端二者(“桥接寡核苷酸”)。这些寡核苷酸示于表7中。
通过用每种寡核苷酸处理细胞来测试对KLF4具有特异性的寡核苷酸。若干种KLF4寡核苷酸能够上调经处理的细胞中的KLF4mRNA水平(图41)。一个亚组的KLF4寡核苷酸也能够上调经处理的细胞中的KLF4蛋白质水平(图42)。这些结果表明，5’和3’靶向寡核苷酸能够上调KLF4的mRNA和蛋白质水平，证明了5’和3’靶向寡核苷酸通常用于上调RNA(以及相应的蛋白质)的表达。
此外，在用KLF45’和3’端靶向寡核苷酸(包括靶向KLF45’和3’端二者的环化寡核苷酸以及靶向KLF45’和3’端的单独寡核苷酸)处理的细胞中评估了KLF4mRNA的表达水平。结果示于图43中。
使用RNAimax在30nM的浓度下将KLF45’和3’端寡核苷酸转染到Hep3B细胞中。使用购自LifeTechnologies的KLF4和肌动蛋白(管家对照)引物，用Cells-to-Ct试剂盒(LifeTechnologies)进行RNA分析。用KLF4兔抗(CellSignaling4038S)完成KLF4蛋白的Western。
表7：设计为靶向RNA5’和3’端的寡核苷酸
实施例5.用于提高RNA稳定性的另一些寡核苷酸
表8提供了用于靶向非编码RNA(HOTAIR和ANRIL)5’和3’端的示例性寡核苷酸。
表8：靶向非编码RNA的寡核苷酸
实施例6.另一些稳定性寡核苷酸
表9提供了多个人和小鼠基因的另一些示例性RNA稳定性寡核苷酸。
实施例7.PTEN和KLF4寡核苷酸
方法
蛋白质测量：以每孔150000个细胞铺板Hepa1-6和GM04078细胞。使用Lipofectamine2000用PTEN或KLF4寡核苷酸转染细胞。使用30nM的每种寡核苷酸进行转染。如果在实验中组合两种oligo寡核苷酸，则使用30nM的每种PTEN寡核苷酸进行转染。使用50nM的每种KLF4寡核苷酸进行转染。如果在实验中组合两种寡核苷酸，则使用50nM的每种PTEN寡核苷酸进行转染。在转染后的第1天或第2天(对于PTEN寡核苷酸)或在转染后的第3天(对于KLF4寡核苷酸)从细胞中收获裂解物。用于检测的抗体是CellSignalingKLF44038和CellSignalingPTEN9552。
RNA测量：以每孔4000个细胞铺板Hepa1-6和GM04078。使用Lipofectamine2000用寡核苷酸转染细胞。使用30nM的每种PTEN寡核苷酸进行转染。如果在实验中组合两种oligo寡核苷酸，则使用30nM的每种PTEN寡核苷酸进行转染。使用50nM的每种KLF4寡核苷酸进行转染。如果在实验中组合两种寡核苷酸，则使用50nM的每种PTEN寡核苷酸进行转染。在转染后3天从收集的裂解物中提取RNA。根据制造商的方案，使用Cells-to-Ct(LifeTechnologies)程序来分析RNA水平。使用的探针来自LifeTechnologies：
KLF4Mm00516104_m1
PTENHs02621230_s1
肌动蛋白Hs01060665_g1
GapdhHs02758991_g1
放线菌素D处理：向细胞培养基添加10微克/ml浓度的放线菌素D(LifeTechnologies)并进行孵育。根据制造商的说明使用Trizol(Sigma)进行RNA分离。KLF4探针购自LifeTechnologies。
测试的寡核苷酸序列：在图44-48中测试的寡核苷酸对应于表9中提供的相同的寡核苷酸序列。例如，图44A中的PTEN101与表9中的PTEN-101相同，图46中的mKLF4-1M02与表9中的mKLF4-1M02相同，等。
结果
通过用每种寡核苷酸处理细胞来测试对PTEN具有特异性的寡核苷酸。若干种PTEN寡核苷酸能够上调经处理细胞中的PTENmRNA水平(图44A和44B)。当组合PTEN寡核苷酸108和113时也能够上调经处理细胞中PTEN蛋白水平，其超过分别使用的任一寡核苷酸(图45)。
通过用每种寡核苷酸处理细胞来测试对KLF4具有特异性的寡核苷酸。若干种KLF4寡核苷酸能够上调经处理细胞中的KLF4mRNA水平(图46)。若干种KLF4寡核苷酸(单独或组合使用)，也能够上调经处理细胞中的KLF4蛋白水平(图47和48)。
在另一个实验中，用放线菌素D和环化的或其他类型稳定性寡核苷酸处理细胞并测量KLF4的稳定性。发现“环化”和单独的5’/3’端寡核苷酸之间的RNA稳定性提高水平(约2小时相对于约4-8小时)可比较，表明这两种类型的寡核苷酸都是有效的(图49)。
这些结果证明使用能够提高RNA稳定性的寡核苷酸可以上调mRNA和蛋白质两者的水平。
实施例8.在具有长mRNA半衰期的基因中提高的mRNA稳定性
方法
RNA测量：用LifeTechnologiesCells-to-Ct试剂盒和StepOnePlus仪器进行RNA分析、cDNA合成和QRT-PCR。使用RNAimax(LifeTechnologies)以30nM的浓度将ACTB寡核苷酸转染到Hep3B细胞中。对于组合，以30nM的浓度转染每种寡核苷酸。使用购自LifeTechnologies的肌动蛋白(Hs01060665_g1)和GAPDH(Hs02758991_g1，管家对照)引物，用Cells-to-Ct试剂盒(LifeTechnologies)进行RNA分析。
测试的寡核苷酸序列：在图50中测试的寡核苷酸相当于表7中提供的相同寡核苷酸序列。例如，图50中的ACTB-8与表7中的ACTB-8相同，图50中的ACTB-9与表7中的ACTB-9相同，等。
结果
肌动蛋白-β是具有高度稳定mRNA的管家基因。通过用每个寡核苷酸或其组合处理细胞来测试对肌动蛋白-βmRNA具有特异性的寡核苷酸。若干种寡核苷酸(5’和3’靶向两者以及环化寡寡核苷酸)能够上调肌动蛋白-βmRNA水平(图50)。这些数据表明稳定性寡核苷酸可以提高即使是已经-高度稳定的mRNA的稳定性。
认为前述书面说明足以使本领域的技术人员能够实践本发明。本发明并不限制在所提供的实施例的范围内，因为实施例旨在作为本发明的一个方面的单个示例且其他功能上等同的实施方案也在本发明的范围内。除了本文中示出和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的多种修改对本领域技术人员来说是明显的，并在所附权利要求的范围内。本发明的每一个实施方案并不需要均涵盖本发明的优点和目的。
实施例9.另一些5’和3’端靶向寡核苷酸
表10提供了用于多个人和小鼠基因的另一些示例性RNA5’和3’端靶向寡核苷酸。
表10.设计为靶向RNA5’和3’端的寡核苷酸
实施例10.FXN寡核苷酸的另一些数据
使用FXN-374和FXN-375作为5’寡核苷酸，在20nM、50nM和100nM的浓度下通过转染，针对GM03816细胞中人FXN的RNA上调筛选表3中可用的所有3’寡核苷酸(图51)。浓度是总寡核苷酸浓度(例如，20nM意味着每种寡核苷酸10nM)。一般而言，与未处理的细胞相比，用寡核苷酸组合(其包括375寡核苷酸)处理的细胞上调了人FXN。375和390组合产生最高水平的人FXN的剂量响应上调(图51)。
将来自表3、表6、表7和表10的多种FXN寡核苷酸转染到GM03816细胞系(10nM或30nM的FXN-375/FXN-398组合、10nM或30nM的FXN-429、10nM的511、10nM的FXN-456、10nM或30nM的FXN-485、10nM的FXN-458、10nM或30nM的FXN-461m02)。使用Abcamab48281抗体来测量成熟前和成熟FXN蛋白水平。Oligo456、458、485和461是假环化寡核苷酸。Oligo461是包含375(5’)和390(3’)寡核苷酸之序列的假环化寡核苷酸。使用肌动蛋白作为上样对照(Cellsignaling，8457)。一般而言，在所有寡核苷酸处理的细胞中成熟前和成熟FXN的水平均上调(图52)。通过FXN-458和FXN-461以剂量响应的方式明显上调成熟前和成熟FXN(图52)。
用FXN-461m02寡核苷酸进行了进一步研究。通过以指定浓度转染到GM03816细胞系测量了FXN-461m02剂量响应。使用Abcamab48281抗体来测量成熟前和成熟FXN蛋白水平。使用肌动蛋白作为上样对照(Cellsignaling，8457)。在跟踪研究中FXN蛋白水平也被强烈地上调(图53)。
然后，基于公共的polyA-seq数据设计了另一些3’-靶向FXN寡核苷酸(表10中所示)来检查潜在的替代3’位置。将FXN-375寡核苷酸用作5’寡核苷酸并与其他3’靶向FXN寡核苷酸组合。以30nM的浓度转染到GM03816细胞中。在若干种寡核苷酸组合中观察到FXNmRNA上调且上调最高的是3’寡核苷酸FXN-527和FXN-532(图54)。
用交替(alternate)的5’寡核苷酸(FXN-675)代替375寡核苷酸来筛选另一些3’-靶向FXN寡核苷酸的亚组以检查3’寡核苷酸介导的FXNmRNA的再现性。然而观察到了差异，用两种5’寡核苷酸均鉴定到了作为先导化合物的类似3’寡核苷酸，例如，FXN-654、FXN-663、FXN-666、FXN-668和FXN-670(图55)。
在3’寡核苷酸研究中评估了候选FXN下游基因(PPARGC1和NFE2L2)的表达变化。观察到PPARGC1基因的变化最大(图56)。
然后，设计另一些5’-靶向FXN寡核苷酸来检查潜在的替代5’位置，并检查长度较短的寡核苷酸。以30nM浓度转染到GM03816细胞中。将FXN-390寡核苷酸用作3’寡核苷酸。5’寡核苷酸FXN-673的FXNmRNA上调最高(图57)。寡核苷酸671-673分别为FXN-375(15mer)的13mer、11mer和9mer形式。
随后，体外在FRDA小鼠模型(Sarsero)成纤维细胞中对若干种5’(FXN-374、FXN-375)、3’(FXN-390)和假环化(483，484，487)FXN寡核苷酸进行了4、7和10天裸测。FXN-374+390和FXN-375+390组合的FXNmRNA水平最高(图58A-C)。
然后，通过在GM03816细胞中转染来检查多个3’和5’FXN寡核苷酸(FXN-527、FXN-528、FXN-532、FXN-533、FXN-553、FXN-674和FXN-675)对于FXNmRNA水平的剂量响应模式(图59A和B)。寡核苷酸FXN-527、FXN-532、FXN-674和FXN-675示出FXNmRNA的剂量依赖性提高。
随后，将多种5’FXN寡核苷酸与先导3’寡核苷酸FXN-532组合。在GM03816细胞中用转染测量了FXNmRNA的剂量响应模式。所有测试的寡核苷酸示出FXNmRNA的剂量依赖性提高。在第5天进行测量。FXN-674是与FXN-375重叠11个核苷酸的15mer。FXN-675、FXN-676和FXN-677分别是FXN-674的13mer、11mer和9-mer形式。FXN-671、FXN-672和FXN-673分别是FXN-375的13mer、11mer和9mer形式(图60A和B)。
然后，单独测试5’寡核苷酸(FXN-375、FXN-671、FXN-672、FXN-673、FXN-674、FXN-675、FXN-676和FXN-677)或与3’寡核苷酸FXN-532FXN组合测试FXN蛋白的上调。以30nM和10nM浓度将寡核苷酸单独或组合转染到GM03816细胞中。在第5天进行测量。用Abcam(ab110328)抗体进行Western印迹来检测成熟前和成熟FXN蛋白。一般而言，在用寡核苷酸(单独或组合)处理的所有细胞中FXN蛋白水平均上调(图61)。在FXN-672+532组合中观察到最高的蛋白质上调(图61)。
在正常人心肌细胞中，裸测了若干种先导5’(FXN-374、FXN-375)、3’(FXN-390)、假环化寡核苷酸(FXN-460：FXN-374+390；FXN-461：FXN-375+390)和多靶向寡核苷酸(FXN-460MTO和FXN-461MTO)的人FXNmRNA上调。多靶向寡核苷酸(MTO)包含通过可切割的接头(例如，寡核苷酸-dT接头(例如，dTdTdTdTdT))连接的5’和3’靶向寡核苷酸。在多种浓度下将寡核苷酸孵育8天，在第4天更换培养基和寡核苷酸。
实施例11.UTRN寡核苷酸的数据
在分化的人患者迪谢纳肌营养不良症(DMD)肌管中裸筛选如表7中示出的Utrophin(UTRN-211-220)的假环化寡核苷酸。用Mancho5抗体进行Western。将UTRN蛋白质Western信号相对于β-肌动蛋白水平与未处理的样品归一化。与阴性对照寡核苷酸293LM以及与仅细胞相比，示出寡核苷酸UTRN-217上调了UTRN蛋白的水平(图62和63)。
然后，在分化的人患者DMD肌管中单独并且裸筛选UTRN5’和3’寡核苷酸。通过离心将样品分离为沉淀和上清液以用于Western分析。将样品在SDS溶液中裂解，保持在冰上，然后旋转沉降以分离沉淀和上清液级分。用Mancho5抗体进行Western。将UTRN蛋白Western信号相对于β-肌动蛋白水平与未处理的样品归一化。在用UTRN-202、208、209、210和217寡核苷酸处理的细胞的沉淀中观察到UTRN蛋白的阳性上调(图64A-C)。
实施例12.APOA1寡核苷酸的数据
以20μM和5μM的浓度在原代小鼠肝细胞中以一式两份裸筛选小鼠APOA15’(APOA1_mus-1-13)和3’(APOA1_mus-21)寡核苷酸组合。测量APOA1mRNA，并相对于水对照孔归一化。与水相比，若干种所测试的寡核苷酸引起APOA1的上调(图65)。
然后，在原代小鼠肝细胞中裸筛选小鼠APOA15’和3’寡核苷酸组合以测量APOA1蛋白质水平。在第2天进行测量。使用Abcamab20453作为APOA1抗体。使用微管蛋白(ab125267)作为上样对照。在细胞培养基和细胞裂解物两者中寡核苷酸APOA1_mus-3+17、APOA1_mus-6+17和APOA1_mus-7+20示出剂量依赖性的APOA1蛋白上调(图66)。
随后，在小鼠中体内测试两个小鼠APOA15’和3’寡核苷酸组合(APOA1_mus-3+APOA1_mus-17或APOA1_mus-7+APOA1_mus-20)。在第1、2和3天以所测试的组合中每种寡核苷酸50mg/kg经皮下注射寡核苷酸组合。将载剂(PBS)处理用作对照。在第一项研究(图70A)中，在第5天(最后一次给药后2天)进行收集。在第二项研究(图70B)中，在第7天(最后一次给药后4天)进行收集。在这两项研究中肝中的RNA测量(图70A和B)表明用7+20和3+20APOAA1寡核苷酸组合将APOA1mRNA上调了达80％。接近APOA1的5个基因(APOC3、APOA4、APOA5、APOB、Sik3)均没有受到寡核苷酸处理的显著影响。
在两项体内研究中也测量了APOA1蛋白水平。图70C示出了来自对寡核苷酸组合3+17的第一项研究的APOA1蛋白数据。在所有4只经处理的动物的血浆中看到APOA1蛋白上调。图70D示出了来自对寡核苷酸组合7+20的第二项研究的APOA1蛋白数据。来自所有10只动物的出血前数据示出与处理开始之前在所有动物中血浆APOA1相对相等的水平(上图，图70D)。样品5和10示出了用寡核苷酸组合7+20处理后血浆中小鼠APOA1蛋白的上调。
在存在蛋白质上调(图70C)的情况下，寡核苷酸组合3+17缺乏RNA的改变(图70A)，以及用寡核苷酸组合7+20处理的5只动物中2只的APOA1上调(图70D)，这可能是由于寡核苷酸处理方案和选择的收集点。
实施例13.另一些非编码RNA靶向寡核苷酸
表11提供了另一些示例性非编码RNA5’和3’端靶向寡核苷酸。
表11.设计为靶向非编码RNA5’和3’端的寡核苷酸
实施例14.来自弗里德赖希共济失调(FRDA)小鼠模型的数据
将指定的5’(FXN-375、380、385)、3’(FXN-398)和多靶向寡核苷酸(FXN-434：375+398，FXN-436：385+398)经皮下注射到SarseroFRDA小鼠模型中。注射载剂(PBS)作为对照。FXN-434和436的序列示于下表12中。
表12.FXN-434和FXN-436的序列
对于短臂(SA)研究，在第0天和第4天注射25mg/kg的寡核苷酸和对照。在第7天收集组织。对于长臂(LA)研究，在第0天、第4天、第7天注射相同的剂量，并在第14天进行收集。用QPCR测量该模型的心脏和肝中的人FXN和小鼠FXN并且以PBS组归一化。每个处理组有5只小鼠(n＝5)。
发现在短臂研究中，人FXN靶向寡核苷酸上调心脏中的小鼠弗氏共济失调蛋白mRNA(图67)。在长臂研究中肝脏和心脏中的人FXN也出现轻微但统计学不显著的上调趋势(图67)。两种寡核苷酸，FXN-375和389，与小鼠FXN转录物重叠，有一些错配(图68)。主要的小鼠FXN3’位点在chr19：24261501。主要的小鼠FXN5’位点在chr19：24280595。EST以及RefSeq注解表明这些寡核苷酸可能与小鼠转录物结合。这些数据表明含有与FXNRNA转录物错配的寡核苷酸仍然可导致FXN的上调，表明可以容忍错配。
虽然本文描述并举例说明了本发明的几个实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行功能和/或获得本文所述的结果和/或一个或更多个优点的多种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修改都被视为在本发明的范围之内。更一般性地，本领域技术人员将容易理解，本文所描述的所有参数、尺寸、材料和构造意为示例性的且实际的参数、尺寸、材料和/或构造将取决于具体的应用或使用本发明的教导的应用。本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验以确定许多与本文所描述的本发明的具体实施方案等同的方案。因此，可以理解的是，前述的实施方案仅通过示例的方式给出，且在所附权利要求书及其等同方案的范围之内，可以用除了具体描述和要求保护的其他方式来实施本发明。本发明是针对本文所述的每个单独的特征、***、制品、材料、和/或方法。此外，如果这类特征、***、制品、材料、和/或方法相互不矛盾，则两个或更多个这类特征、***、制品、材料、和/或方法的任意组合也包括在本发明的范围内。
除非明确指出相反，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个/种”，应被理解为是指“至少一个/种”。
如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应当被理解为是指如此结合起来的要素的“任一或两者”，即，在一些情况下联合存在而其他情况下分开存在的要素。除非明确有相反的指示，否则除了通过由“和/或”分句所具体确定的元素之外，其他要素也可任选地存在，无论具体确定的那些要素是否相关。因此，作为一个非限制性实例，当与开放式语言如“包含”联合使用时，提及“A和/或B”在一个实施方案中指的是A但没有B(任选地包括除了B之外的元素)；在另一个实施方案中，指的是B但没有A(任选地包括除了A之外的元素)；在另一个实施方案中，指的是A和B两者(任选地包括其他元素)；等。
如本文在说明书和权利要求书中使用的“或”应被理解为具有与如上所定义“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或者“和/或”应被解释为包括性的，即包括数字或要素列表中的至少一个，但还包括了多于一个，并且任选地包括其他未列出的项目。只有明确表示相反的术语，例如“仅仅之一”或“正好之一”，或者，在权利要求书中使用“由......组成”时，才指仅包括数字或要素的列表中的一个要素。一般而言，当前面有排他性的术语(例如“任一”，“之一”，“仅有之一”或“恰好之一”)时，本文所使用的术语“或”应该仅解释为表示排他性的替代选择(即“一个/种或另一个/种而不是两者”)。当在权利要求书中使用“基本由......组成”时，应具有其在专利法领域中所使用的通常含义。
关于一个或更多个要素的列表，如本文在说明书和权利要求书中使用的短语“至少一个”应理解为是指选自要素列表中任意一个或更多个要素中的至少一个要素，但是不一定包括要素列表内具体列出的各个要素和每个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中的要素的任意组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所指的要素列表内的明确指出的要素之外，可任选存在的要素，不论与明确指出的那些要素是否相关。因此，作为非限制性的一个实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”或等同地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指，任选地包括至少一个A(任选地包括多于一个A)，而不存在B(并任选地包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，指的是任选地包括至少一个B(任选地包括多于一个B)，而不存在A(且任选地包括除了A之外的要素)；在另一个实施方案中，指的是任选地包括至少一个A(任选地包括多于一个A)，和至少一个B(任选地包括多于一个B)(且任选地包括其他要素)；等。
在权利要求书以及在上述说明书中，所有的过渡性词语例如“包含”，“包括”，“带有”，“具有”，“含有”，“涉及”，“持有”等应理解为开放式的，即意指包括但不限制于。仅过渡短语“由......组成”和“基本上由...组成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册2111.03部分所述。
权利要求书中为了修饰权利要求要素而使用的顺序术语例如“第一”、“第二”、“第三”等本身并不意味着任何优先级、先后顺序或一个权利要求要素相对于另一个的次序或执行方法的动作的时间顺序，而是仅用作标号将具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称(除序数术语的使用之外)的另一个要素区分开以便区分权利要求要素。

Claims (140)

1.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括：
向细胞递送包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1包含具有互补区的5至20个核苷酸，所述互补区与由所述基因编码的RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中X1之所述互补区3’端的核苷酸与所述RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补；并且X2包含1至20个核苷酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述RNA转录物在其5’端具有7-甲基鸟苷帽。
3.权利要求1所述的方法，其中所述RNA转录物具有7-甲基鸟苷帽，并且其中X1之所述互补区3’端的核苷酸与紧接所述7-甲基鸟苷帽内侧的RNA转录物的核苷酸互补。
4.权利要求1所述的方法，其中X25’端的至少第一核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
5.权利要求2所述的方法，其中X25’端的第二核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
6.权利要求1所述的方法，其中X2包含式5’-Y1-Y2-Y3-3’，其中X2形成具有环区和茎区的茎环结构，所述环区包含Y2的核苷酸，所述茎区包含与Y3的至少两个连续核苷酸杂交的Y1的至少两个连续核苷酸。
7.权利要求6所述的方法，其中Y1、Y2和Y3独立地包含1至10个核苷酸。
8.权利要求6或7所述的方法，其中Y3在紧接所述茎区3’端之后的位置包含与鸟嘌呤互补的嘧啶。
9.权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述与鸟嘌呤互补的嘧啶是胞嘧啶。
10.权利要求1所述的方法，其中X2包含与所述RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的互补区，所述至少5个连续核苷酸不重叠于与X1的所述互补区互补的RNA转录物区。
11.权利要求10所述的方法，其中X2的所述互补区在所述RNA转录物之多腺苷酸化接点的100个核苷酸之内。
12.权利要求11所述的方法，其中X2的所述互补区在紧邻或重叠于所述RNA转录物之所述多腺苷酸化接点的位置处与该RNA转录物互补。
13.权利要求11或12所述的方法，其中X2还包含至少2个连续的嘧啶核苷酸，所述嘧啶核苷酸与所述RNA转录物的poly(A)尾的腺嘌呤核苷酸互补。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA、miRNA、或snoRNA、或任何其他合适的RNA。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA转录物，并且其中X2包含与所述转录物之3’-UTR中的至少5个连续核苷酸互补的互补区。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA，并且所述递送导致由所述mRNA编码的蛋白质水平的提高。
17.权利要求16所述的方法，其中与未递送该寡核苷酸的合适对照细胞相比，由所述mRNA编码之蛋白质水平的提高至少提高50％。
18.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、PTEN、MECP2和FOXP3。
19.权利要求1所述的方法，其中X1包含序列5’-CGCCCTCCAG-3’。
20.权利要求19所述的方法，其中X2包含序列CC。
21.权利要求20所述的方法，其中X2包含序列5’-CCAAAGGTC-3’。
22.权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包含序列5’-CGCCCTCCAGCCAAAGGTC-3’。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
24.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向细胞递送具有第一区和第二区的长度为10至50个核苷酸的寡核苷酸，所述第一区与由所述基因编码之mRNA转录物的5’-UTR的至少5个连续核苷酸互补，所述第二区与所述mRNA转录物之3’-UTR的至少5个连续核苷酸、所述mRNA转录物之poly(A)尾的至少5个连续核苷酸或重叠于所述mRNA转录物之多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。
25.权利要求24所述的方法，其中所述5’-UTR的所述至少5个连续核苷酸中的第一个在所述mRNA转录物之5’-甲基鸟苷帽的10个核苷酸之内。
26.权利要求24或25所述的方法，其中所述第二区与重叠于所述多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。
27.权利要求24至26中任一项所述的方法，其还包含将所述第一区的5’端与所述第二区的3’端连接的2至20个核苷酸。
28.权利要求24至26中任一项所述的方法，其还包含将所述第一区的3’端与所述第二区的5’端连接的2至20个核苷酸。
29.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度为10至50个核苷酸。
30.权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的长度为9至20个核苷酸。
31.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向细胞递送包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中X1包含2至20个与腺嘌呤形成碱基对的嘧啶核苷酸；并且X2包含与由所述基因编码之多腺苷酸化RNA转录物的至少3个连续核苷酸互补的互补区，其中X2之所述互补区5’端的核苷酸与所述RNA转录物中紧接所述RNA转录物之多腺苷酸化接点内侧的核苷酸互补。
32.权利要求31所述的方法，其中X1包含2至20个胸苷或尿苷。
33.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键。
34.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
35.权利要求1至34中任一项所述的方法，其中至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸、至少一个2’-氟-脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
37.权利要求36所述的方法，其中所述桥连核苷酸是LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
38.权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸的每个核苷酸均为LNA核苷酸。
39.权利要求1至38中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-氟-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或桥连核苷酸。
40.权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是混合体。
41.权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸是吗啉代寡核苷酸。
42.权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
43.权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。
44.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向表达所述基因之RNA转录物的细胞递送长度为8至50个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中所述互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的10个核苷酸之内的核苷酸互补，其中所述寡核苷酸包含通过至少一个经修饰的核苷间键连接的核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
45.在细胞中提高基因表达的方法，所述方法包括向表达所述基因之RNA转录物的细胞递送包含两个互补区的寡核苷酸，所述互补区各自与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中第一互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的100个核苷酸之内的核苷酸互补，并且其中第二互补区与末端在所述RNA转录物3’端的300个核苷酸之内的RNA转录物区互补。
46.在细胞中提高RNA转录物之稳定性的方法，所述方法包括向所述细胞递送第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述RNA转录物的5’区，所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述RNA转录物的3’区。
47.权利要求46所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸与所述第二稳定化寡核苷酸共价连接。
48.权利要求46或47所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述RNA转录物5’端之第一个被转录核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
49.权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物包含5’-甲基鸟苷帽，并且其中所述第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在紧接所述5’-甲基鸟苷帽内侧之核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
50.权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述RNA转录物3’端的250个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
51.权利要求46至50中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物包含3’-poly(A)尾，并且其中所述第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述RNA转录物之多腺苷酸化接点的100个核苷酸之内的位置处与该RNA转录物互补。
52.权利要求46至51中任一项所述的方法，其中所述第二稳定化寡核苷酸的所述互补区与所述RNA转录物的多腺苷酸化接点紧邻或重叠。
53.在细胞中提高RNA转录物之稳定性的方法，所述方法包括向表达所述RNA转录物的细胞递送靶向所述RNA转录物之权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸，从而提高所述RNA转录物的稳定性。
54.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述细胞在体外。
55.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述细胞在体内。
56.在对象中治疗与RNA转录物水平降低相关的病症或疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸。
57.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA、miRNA、snoRNA、tRNA、snRNA、胞外RNA或任何其他合适的RNA。
58.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是mRNA。
59.权利要求46至56中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是长非编码RNA。
60.权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、PTEN、MECP2和FOXP3。
61.权利要求46至58中任一项所述的方法，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
62.长度为8至50个核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中所述互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的10个核苷酸之内的核苷酸互补，其中所述寡核苷酸包含通过至少一个经修饰的核苷间键连接的核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
63.包含两个互补区的寡核苷酸，所述互补区各自与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中第一互补区3’端的核苷酸与在所述RNA转录物之转录起始位点的100个核苷酸之内的核苷酸互补，并且其中第二互补区与末端在所述RNA转录物3’端的300个核苷酸之内的RNA转录物区互补。
64.包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中
X1包含具有互补区的5至20个核苷酸，所述互补区与RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补，其中X1之所述互补区3’端的核苷酸与所述RNA转录物的转录起始位点的核苷酸互补；并且X2包含1至20个核苷酸。
65.权利要求62至64中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物在其5’端具有7-甲基鸟苷帽。
66.权利要求64所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物具有7-甲基鸟苷帽，并且其中X1之所述互补区3’端的核苷酸与紧接所述7-甲基鸟苷帽内侧的RNA转录物的核苷酸互补。
67.权利要求64所述的寡核苷酸，其中X25’端的至少第一核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
68.权利要求67所述的寡核苷酸，其中X25’端的第二核苷酸是与鸟嘌呤互补的嘧啶。
69.权利要求64所述的寡核苷酸，其中X2包含式5’-Y1-Y2-Y3-3’，其中X2形成具有环区和茎区的茎环结构，所述环区包含Y2的核苷酸，所述茎区包含与Y3的至少两个连续核苷酸杂交的Y1的至少两个连续核苷酸。
70.权利要求69所述的寡核苷酸，其中Y1、Y2和Y3独立地包含1至10个核苷酸。
71.权利要求69或70所述的寡核苷酸，其中Y3在紧接所述茎区3’端之后的位置包含与鸟嘌呤互补的嘧啶。
72.权利要求67至71中任一项所述的寡核苷酸，其中所述与鸟嘌呤互补的嘧啶是胞嘧啶。
73.权利要求64所述的寡核苷酸，其中X2包含与所述RNA转录物的至少5个连续核苷酸互补的互补区，所述至少5个连续核苷酸不重叠于与X1的所述互补区互补的RNA转录物区。
74.权利要求73所述的寡核苷酸，其中X2的所述互补区在所述RNA转录物之多腺苷酸化接点的100个核苷酸之内。
75.权利要求74所述的寡核苷酸，其中X2的所述互补区在紧邻或重叠于所述RNA转录物之多腺苷酸化接点的位置处与该RNA转录物互补。
76.权利要求74或75所述的寡核苷酸，其中X2还包含至少2个连续嘧啶核苷酸，所述连续嘧啶核苷酸与所述RNA转录物的poly(A)尾的腺嘌呤核苷酸互补。
77.权利要求62至76中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物是mRNA、非编码RNA、长非编码RNA、miRNA、或snoRNA、或任何其他合适的RNA。
78.权利要求64至77中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物是mRNA转录物，并且其中X2包含与所述转录物之3’-UTR中的至少5个连续核苷酸互补的互补区。
79.权利要求62至78中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA1、APOA1、ATP2A2、BDNF、FXN、HBA2、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、SMN、UTRN、PTEN、MECP2和FOXP3。
80.权利要求64所述的寡核苷酸，其中X1包含序列5’-CGCCCTCCAG-3’。
81.权利要求79所述的寡核苷酸，其中X2包含序列CC。
82.权利要求79所述的寡核苷酸，其中X2包含序列5’-CCAAAGGTC-3’。
83.权利要求64所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含序列5’-CGCCCTCCAGCCAAAGGTC-3’。
84.权利要求62至78中任一项所述的寡核苷酸，其中所述RNA转录物是由选自以下的基因表达的mRNA：ABCA4、ABCB11、ABCB4、ABCG5、ABCG8、ADIPOQ、ALB、APOE、BCL2L11、BRCA1、CD274、CEP290、CFTR、EPO、F7、F8、FLI1、FMR1、FNDC5、GCH1、GCK、GLP1R、GRN、HAMP、HPRT1、IDO1、IGF1、IL10、IL6、KCNMA1、KCNMB1、KCNMB2、KCNMB3、KCNMB4、KLF1、KLF4、LDLR、MSX2、MYBPC3、NANOG、NF1、NKX2-1、NKX2-1-AS1、PAH、PTGS2、RB1、RPS14、RPS19、SCARB1、SERPINF1、SIRT1、SIRT6、SMAD7、ST7、STAT3、TSIX和XIST。
85.长度为10至50个核苷酸的寡核苷酸，其具有第一区和第二区，所述第一区与mRNA转录物之5’-UTR的至少5个连续核苷酸互补，所述第二区与所述mRNA转录物之3’-UTR的至少5个连续核苷酸、所述mRNA转录物之poly(A)尾的至少5个连续核苷酸或重叠于所述mRNA转录物之多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。
86.权利要求85所述的寡核苷酸，其中所述5’-UTR的所述至少5个连续核苷酸中的第一个在所述mRNA转录物之5’-甲基鸟苷帽的10个核苷酸之内。
87.权利要求85或86所述的寡核苷酸，其中所述第二区与重叠于所述多腺苷酸化接点的至少5个连续核苷酸互补。
88.权利要求85至87中任一项所述的寡核苷酸，其还包含将所述第一区的5’端与所述第二区的3’端连接的2至20个核苷酸。
89.权利要求85至87中任一项所述的寡核苷酸，其还包含将所述第一区的3’端与所述第二区的5’端连接的2至20个核苷酸。
90.权利要求85至87中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为10至50个核苷酸。
91.权利要求85至87中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的长度为9至20个核苷酸。
92.包含通式5’-X1-X2-3’的寡核苷酸，其中
X1包含2至20个与腺嘌呤形成碱基对的嘧啶核苷酸；并且X2包含与多腺苷酸化RNA转录物的至少3个连续核苷酸互补的互补区，其中X2之所述互补区5’端的核苷酸与所述RMA转录物中紧接所述RNA转录物之多腺苷酸化接点内侧的核苷酸互补。
93.权利要求80所述的寡核苷酸，其中X1包含2至20个胸苷或尿苷。
94.权利要求62至93中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键。
95.权利要求62至93中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
96.权利要求62至95中任一项所述的寡核苷酸，其中至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
97.权利要求62至93中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸、至少一个2’-氟-脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
98.权利要求97所述的寡核苷酸，其中所述桥连核苷酸是LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
99.权利要求64至98中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的每个核苷酸均为LNA核苷酸。
100.权利要求64至99中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸和2’-氟-脱氧核糖核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或桥连核苷酸。
101.权利要求64至94中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是混合体。
102.权利要求64至94中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是吗啉代寡核苷酸。
103.寡核苷酸，其包含如表3、7、8或9中所示的核苷酸序列。
104.寡核苷酸，其包含如表3、7、8或9中所示之核苷酸序列的至少8个核苷酸的片段。
105.组合物，其包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸具有通过核苷间键连接的5至25个核苷酸，所述第二寡核苷酸具有通过核苷间键连接的5至25个核苷酸，其中所述第一寡核苷酸与在RNA转录物5’端的100个核苷酸之内的至少5个连续核苷酸互补，并且其中所述第二寡核苷酸与在RNA转录物3’端的100个核苷酸之内的至少5个连续核苷酸互补。
106.权利要求105所述的组合物，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸通过接头连接，所述接头不是具有与所述RNA转录物互补之序列的寡核苷酸。
107.权利要求106所述的组合物，其中所述接头是寡核苷酸。
108.权利要求106所述的组合物，其中所述接头是多肽。
109.包含多个寡核苷酸的组合物，其中至少75％的所述寡核苷酸各自是选自权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸。
110.权利要求109所述的组合物，其中所述寡核苷酸与单价阳离子络合。
111.权利要求109或110所述的组合物，其中所述寡核苷酸为冻干形式。
112.权利要求109或110所述的组合物，其中所述寡核苷酸在水溶液中。
113.组合物，其包含权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸、和载体。
114.组合物，其包含在缓冲溶液中的权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸。
115.组合物，其包含与载体缀合的权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸。
116.权利要求115所述的组合物，其中所述载体是肽。
117.权利要求115所述的组合物，其中所述载体是类固醇。
118.药物组合物，其包含权利要求64至104中任一项所述的寡核苷酸、和可药用载体。
119.药盒，其包含装有权利要求109至118中任一项所述的组合物的容器。
120.用于在细胞中提高蛋白质表达的方法，所述方法包括向细胞递送编码所述蛋白质的环化的合成RNA，其中在向所述细胞递送所述环化的合成RNA之后，所述蛋白质在所述细胞中的合成增加。
121.权利要求120所述的方法，其中所述环化的合成RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。
122.使合成RNA稳定的方法，所述方法包括在第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸与合成RNA上的靶序列杂交的条件下使所述合成RNA与所述第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸接触，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的5’区，所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的3’区，其中所述第一稳定化寡核苷酸与所述第二稳定化寡核苷酸共价连接以使得所述合成RNA在与所述第一和第二稳定化寡核苷酸杂交时能够形成环化产物。
123.权利要求122所述的方法，其中使所述合成RNA与所述第一和第二稳定化寡核苷酸在细胞外接触。
124.向细胞递送合成RNA的方法，所述方法包括：
在第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸与合成RNA上的靶序列杂交的条件下使所述合成RNA与所述第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸接触，所述第一稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的5’区，所述第二稳定化寡核苷酸靶向所述合成RNA的3’区，其中所述第一稳定化寡核苷酸与所述第二稳定化寡核苷酸共价连接以使得所述合成RNA在与所述第一和第二稳定化寡核苷酸杂交时能够形成环化产物；以及
向所述细胞递送所述环化产物。
125.权利要求122至124中任一项所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸通过核苷间键共价连接。
126.权利要求124或125所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸通过寡核苷酸共价连接。
127.权利要求126所述的组合物，其中所述第一稳定化寡核苷酸和第二稳定化寡核苷酸通过本文中公开的任何合适的接头共价连接。
128.权利要求122至127中任一项所述的方法，其中所述第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述合成RNA5’端之第一核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该合成RNA互补。
129.权利要求122至128中任一项所述的方法，其中所述合成RNA包含5’-甲基鸟苷帽，并且其中所述第一稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在紧接所述5’-甲基鸟苷帽内侧之核苷酸的10个核苷酸之内的位置处与该合成RNA互补。
130.权利要求122至129中任一项所述的方法，其中所述第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述合成RNA3’端的250个核苷酸之内的位置处与该合成RNA互补。
131.权利要求122至130中任一项所述的方法，其中所述合成RNA包含3’-poly(A)尾，并且其中所述第二稳定化寡核苷酸包含互补区，所述互补区在所述合成RNA之多腺苷酸化接点的100个核苷酸之内的位置处与该合成RNA互补。
132.权利要求122至131中任一项所述的方法，其中所述第二稳定化寡核苷酸的所述互补区紧邻或重叠于所述合成RNA的所述多腺苷酸化接点。
133.权利要求120至132中任一项所述的方法，其中所述合成RNA包含一个或更多个经修饰的核苷酸。
134.权利要求133所述的方法，其中所述一个或更多个经修饰的核苷酸选自：2’-氨基-2’-脱氧核苷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧核苷酸、2’-氟-2’-脱氧核苷酸、2’-O-甲基-核苷酸、2’糖超修饰剂、2’-修饰的热稳定性增强剂、2’-氟-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2’-氟-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、2’-氟-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸、2’-氟-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基腺苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基胞苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基鸟苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基尿苷-5’-三磷酸、假尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基肌苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基假尿苷-5’-三磷酸、2’-O-甲基-5-甲基尿苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2’-氟-胸苷-5’-三磷酸、2’-叠氮基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸、2’-氨基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸和N4-甲基胞苷-5’-三磷酸。
135.环化的合成RNA，其包含一个或更多个经修饰的核苷酸。
136.权利要求135所述的环化的合成RNA，其包含：
与合成RNA的5’区杂交的第一稳定化寡核苷酸，和
与所述合成的3’区杂交的第二稳定化寡核苷酸，其中所述第一稳定化寡核苷酸与所述第二稳定化寡核苷酸共价连接并且与所述合成RNA形成环化产物。
137.药物组合物，其包含权利要求135或136所述的环化的合成RNA、和可药用载体或赋形剂。
138.组合物，其包含权利要求135或136所述的环化的合成RNA和以下中的一种或更多种：纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球体、lipidoid、脂质体复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血酶和迅速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)。
139.权利要求135所述的环化的合成RNA，其中所述环化的合成RNA与碳水化合物例如GalNac、或其他靶向部分缀合。
140.权利要求135所述的环化的合成RNA，其中所述第一或第二稳定化寡核苷酸与碳水化合物例如GalNac、或其他靶向部分缀合。
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