JP6960641B2 - mRNAの安定化方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下のとおりである。
RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーであり、
少なくも2種のRNAオリゴマーは、mRNAの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズすることで形成される(すなわち、mRNA同士がRNAオリゴマーにより架橋された)、複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[1−2] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーである、上記[1−1]に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズする第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[1−3] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーである、上記[1−1]に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な17塩基の第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズする第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[1−4] 前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記[1−1]〜[1−3]のいずれか1項に記載の複合体。
[1−5] 前記少なくとも2種のRNAオリゴマーが、2〜8種のRNAオリゴマーである、上記[1−1]〜[1−4]のいずれか1項に記載の複合体。
[1−6] mRNAが1μg/mL〜10,000μg/mL、mRNAと少なくとも2種の各RNAオリゴマーとのモル比が1:0.05〜0.05:1となるようにmRNAと少なくとも2種のRNAオリゴマーを含む、上記[1−1]〜[1−5]のいずれか1項に記載の複合体。
[1−7] 上記[1−1]〜[1−6]のいずれか1項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
少なくも2種のRNAオリゴマーは、mRNAの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能なものであり、
複合体において、RNAオリゴマーの第1の配列は、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズする、
mRNAの安定化方法。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[2−2] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーである、上記[2−1]に記載の方法。
(a)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズする第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[2−3] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーである、上記[2−1]に記載の方法。
(a)mRNAの配列に相補的な17塩基の第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズする第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[2−4] 前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記[2−1]〜[2−3]のいずれか1項に記載の方法。
[2−5] 前記少なくとも2種のRNAオリゴマーが、2〜8種のRNAオリゴマーである、上記[2−1]〜[2−4]のいずれか1項に記載の方法。
[2−6] mRNAが1μg/mL〜10,000μg/mL、mRNAと少なくとも2種の各RNAオリゴマーとのモル比が1:0.05〜0.05:1となるようにmRNAと少なくとも2種のRNAオリゴマーを含む、上記[2−1]〜[2−5]のいずれか1項に記載の方法。
RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーであり、
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズすることで形成される(すなわち、mRNA同士がRNAオリゴマーにより架橋された)、複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[3−2] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーである、上記[3−1]に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[3−3] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーである、上記[3−1]に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な17塩基の第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な17塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[3−4] 前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記[3−1]〜[3−3]のいずれか1項に記載の複合体。
[3−5] 前記少なくとも1種のRNAオリゴマーが、2〜8種のRNAオリゴマーである、上記[3−1]〜[3−4]のいずれか1項に記載の複合体。
[3−6] mRNAが1μg/mL〜10,000μg/mL、mRNAと少なくとも1種の各RNAオリゴマーとのモル比が1:0.05〜0.05:1となるようにmRNAと少なくとも1種のRNAオリゴマーを含む、上記[3−1]〜[3−5]のいずれか1項に記載の複合体。
[3−7] 上記[3−1]〜[3−6]のいずれか1項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
複合体において、RNAオリゴマーの第1の配列は、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズする、
mRNAの安定化方法。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[4−2] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーである、上記[4−1]に記載の方法。
(a)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[4−3] 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーである、上記[4−1]に記載の方法。
(a)mRNAの配列に相補的な17塩基の第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な17塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
[4−4] 前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、上記[4−1]〜[4−3]のいずれか1項に記載の方法。
[4−5] 前記少なくとも1種のRNAオリゴマーが、2〜8種のRNAオリゴマーである、上記[4−1]〜[4−4]のいずれか1項に記載の方法。
[4−6] mRNAが1μg/mL〜10,000μg/mL、mRNAと少なくとも1種の各RNAオリゴマーとのモル比が1:0.05〜0.05:1となるようにmRNAと少なくとも1種のRNAオリゴマーを含む、上記[4−1]〜[4−5]のいずれか1項に記載の方法。
[5−2] 輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性mRNAキャリアである、上記[5−1]に記載のmRNAの輸送担体。
[5−3] 上記[5−1]又は[5−2]に記載のmRNAの輸送担体を含む、医薬組成物。
ここでは、目的遺伝子をコードするmRNAとRNAオリゴマーとの複合体(「mRNAナノアッセンブリ」という場合がある)が提供される(図1(A))。いくつかの態様ではRNAオリゴマーは、mRNAの配列に実質的に相補的な第1の配列と場合によりリンカー配列と第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列である(図1(B))。RNAオリゴマーは少なくとも2種用いる。1種のmRNAに対して少なくとも2種のRNAオリゴマーを用い、mRNAとRNAオリゴマーをハイブリダイズさせることで、mRNAナノアッセンブリを作製できる。mRNAナノアッセンブリにおいては、mRNA同士がRNAオリゴマーの作用によって、すなわち、mRNA同士がRNAオリゴマーによって架橋されることによって互いに近づく。mRNA同士が互いに近づくことによって、mRNA同士の間でも部分的にハイブリダイゼーションが形成される(図1(A))。
本発明は、目的遺伝子をコードするmRNAとRNAオリゴマーとの複合体であって、
RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーであり、
少なくも2種のRNAオリゴマーは、mRNAの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズすることで形成される(すなわち、mRNA同士がRNAオリゴマーにより架橋された)、複合体を提供する。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーであり、
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズすることで形成される(すなわち、mRNA同士がRNAオリゴマーにより架橋された)、複合体を提供する。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
成長因子としては、例えば、上皮成長因子(EGF)、インスリン様成長因子(IGF)、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、血小板由来成長因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF又はFGF−2)及び肝細胞増殖因子(HGF)が挙げられる。
細胞死抑制因子としては、例えば、抗アポトーシス因子(例えば、FLIP、Mcl−1、Xiap、crmA、Bcl−2及びBcl−xL)が挙げられる。
癌抑制遺伝子としては、例えば、p53、網膜芽細胞腫遺伝子(Rb)、大腸腺腫症遺伝子(APC)、神経線維腫症1型遺伝子(NF1)、神経線維腫症2型遺伝子(NF2)、WT1、VHL、BRCA1、BRCA2、CHEK2、マスピン、p73、Smad4、MSH2、MLH1、PMS2、DCC、ホスファターゼテンシンホモログ(PTEN)、SDHD、p16、p57Kip2、PTC、TSC1、TSC2、EXT1及びEXT2が挙げられる。
(1)5’Cap、5’UTR、コード領域、3’UTR、及びpoly Aをこの順に含むmRNA。
(2)5’Cap、5’UTR、コード領域、及びpoly Aをこの順に含むmRNA。
(3)5’UTR、コード領域、3’UTR、及びpoly Aをこの順に含むmRNA。
(4)5’UTR、コード領域、及びpoly Aをこの順に含むmRNA。
(5)5’Cap、5’UTR、コード領域、及び3’UTRをこの順に含むmRNA。
(6)5’Cap、5’UTR、コード領域をこの順に含むmRNA。
(7)5’UTR、コード領域、及び3’UTRをこの順に含むmRNA。
(8)5’UTR、コード領域をこの順に含むmRNA。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
少なくも2種のRNAオリゴマーは、mRNAの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能なものであり、
複合体において、RNAオリゴマーの第1の配列は、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズする、
mRNAの安定化方法を提供する。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズする、
mRNAの安定化方法を提供する。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
いくつかの態様では、mRNAを含む複合体は、ネイキッドの形態である。すなわち、mRNAを含む複合体は、輸送担体を伴わない。
いくつかの態様では、輸送担体に内包させるmRNAを含む複合体の量は、輸送担体中のカチオン電荷(+)とmRNAを含む複合体のアニオン電荷(−)の比(+/−比)において、例えば、0.5〜200であり、好ましくは1〜50であり、より好ましくは1〜10である。
本発明は、前記複合体を含有する医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、複合体は輸送担体に内包されている形態である。医薬組成物は、前記複合体を、対象の体内に送達することに用いられる。
本発明のmRNA送達用キットは、前記複合体を含むことを特徴とするものである。いくつかの態様では、複合体は輸送担体に内包されている形態である。当該キットは、例えば、前記複合体を用いた各種疾患の治療方法に好ましく用いることができる。
mRNAは鋳型DNAよりin vitro転写により調製するが、ここで鋳型DNAは以下のように作製した。まず、T7−Gluc plasmidは、pCMV−Gluc control plasmid(New England BioLabs,Ipswich,MA,USA)からGlucコード配列(図7;配列番号1)をpSP73ベクター(Promega)のHindIII,Xba1サイトに挿入することで作製した。その後、T7−Gluc poly A120 plasmidを、T7−Gluc plasmidのEcoR1−Bgl2サイトにA120−(BsmBI切断部位)を挿入することで作製した。その後、BsmBIで切断したのち、T4 DNA Polymerase(タカラバイオ)で末端の平滑化を用い、以下のin vitro転写に用いた。
作製したmRNAの配列(配列番号2)を、図6に示す。図6の配列において、下線部分がopen reading frame(ORF)であり、ORFの上流が5’UTR(54塩基)であり、ORFの下流に3’UTR(52塩基)があり、さらにその下流の120Aがpoly A配列である。
RNAオリゴマーを次のようにして設計し、調製した。RNA2次構造予測ソフトウエア(http://rtips.dna.bio.keio.ac.jp/ipknot/)にて、Gluc mRNAの2次構造を予測し、RNA鎖が2次構造を持たない部分に対してRNAオリゴマーを設計した。RNAオリゴマーは、5’末端又は3’末端のコレステロール修飾を含めて、北海道システムサイエンス社にて、依頼合成した。尚、下記RNAオリゴマーのうち「linker RNA oligomer」は、mRNAにハイブリダイズし得る17merの配列と、全てアデニン(A)である10merのリンカー配列と、17merの配列と同じ配列とを、この順に含むRNAオリゴマーである。「non−linker RNA oligomer」は、linker RNA oligomerを半分にしたような構造であり、mRNAにハイブリダイズし得る17merの配列と、全てアデニン(A)である5merのリンカー配列とを、この順に含むRNAオリゴマーである。
linker RNA oligomers
linker RNA oligomer 1:UCUUUGAGCACCUCCAGAAAAAAAAAAUCUUUGAGCACCUCCAG(配列番号3)
linker RNA oligomer 2:GCGGCAGCCACUUCUUGAAAAAAAAAAGCGGCAGCCACUUCUUG(配列番号4)
linker RNA oligomer 3:ACUCUUUGUCGCCUUCGAAAAAAAAAAACUCUUUGUCGCCUUCG(配列番号5)
linker RNA oligomer 4:CUCGGCCACAGCGAUGCAAAAAAAAAACUCGGCCACAGCGAUGC(配列番号6)
linker RNA oligomer 5:GUGGGACAGGCAGAUCAAAAAAAAAAAGUGGGACAGGCAGAUCA(配列番号7)
linker RNA oligomer 6:GCAGCCAGCUUUCCGGGAAAAAAAAAAGCAGCCAGCUUUCCGGG(配列番号8)
linker RNA oligomer 7:UUGAAGUCUUCGUUGUUAAAAAAAAAAUUGAAGUCUUCGUUGUU(配列番号9)
linker RNA oligomer 8:CUCUAGAUGCAUGCUCGAAAAAAAAAACUCUAGAUGCAUGCUCG(配列番号10)
non−linker RNA oligomer 1:UCUUUGAGCACCUCCAGAAAAA(配列番号11)
non−linker RNA oligomer 2:GCGGCAGCCACUUCUUGAAAAA(配列番号12)
non−linker RNA oligomer 3:ACUCUUUGUCGCCUUCGAAAAA(配列番号13)
non−linker RNA oligomer 4:CUCGGCCACAGCGAUGCAAAAA(配列番号14)
non−linker RNA oligomer 5:GUGGGACAGGCAGAUCAAAAAA(配列番号15)
non−linker RNA oligomer 6:GCAGCCAGCUUUCCGGGAAAAA(配列番号16)
non−linker RNA oligomer 7:UUGAAGUCUUCGUUGUUAAAAA(配列番号17)
non−linker RNA oligomer 8:CUCUAGAUGCAUGCUCGAAAAA(配列番号18)
(1)FCS(Fluorescence Correlation Spectroscopy、OLYMPUS社製、MF20)解析
mRNAナノアッセンブリの大きさをFCS解析により評価し、最適なLinker数を検討した。mRNAナノアッセンブリの作製方法は、実施例2に記載した通りである。
Linker数(すなわち、用いたRNAオリゴマーの種類)が2、4、6、8個の実験では、それぞれ、実施例2に記載の以下のRNAオリゴマーを用いた。
2個:linker RNA oligomer 3及び5
4個:linker RNA oligomer 2、4、6及び8
6個:linker RNA oligomer 1、2、4、5、6及び8
8個:linker RNA oligomer 1、2、3、4、5、6、7及び8
mRNA濃度を3ng/μL(10mM MgCl2溶液, (和光純薬))にして、基板上に添加し、乾かしたのちAFMにより測定した。
(1)酵素耐性試験
Fetal Bovine Serum(FBS、Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.,Osaka,Japan)中でのmRNAナノアッセンブリの酵素耐性を調べた。
ForwardのTarget sequence:TGAGATTCCTGGGTTCAAGG(配列番号19)
ReverseのTarget sequence:GTCAGAACACTGCACGTTGG(配列番号20)
Rabbit reticulocyte lysate(Promega)に添加し、37℃で4時間incubateした後のGluc発光強度を測定した。発光強度はRenilla luciferase assay kit(Promega)を用いて測定した。ルミノメーターはBerthold technologies社のMithras LB 940を用いた。
なお、統計学的解析は、Studentのt検定を行い、n.s.はno significanceを意味する。
96 well plateに10,000 cells/well蒔いたHuH-7細胞(Riken Cell Bank)に対して、24h後に無血清培地Opti−MEM(Thermo Fisher Scientific)に置換した上で、250ngのmRNAを添加した。その4h後に測定を行なった(図5(A))。
細胞内取り込み量に関しては、mRNAはLabel IT tracker Cy3 kit(Mirus)で蛍光標識化した。mRNA導入4h後にPBSで2回細胞表面を洗浄した後、Lysis buffer(Promega)で細胞を溶かし、Infinite M1000 PRO spectrophotometer(Tecan Group Ltd.,Mannedorf,Switzerland)にて励起波長543nm、検出波長568nmとして、蛍光強度を観察した。
細胞でのmRNA発現量については、mRNA導入の4時間後の培地を回収し、そこに含まれるGluc量をRenilla luciferase assay kit(Promega)を用いて測定した。
(1)ポリマー合成
PEG−PAsp(DET)とナノ集合体はそれぞれ独立して10mM HEPES buffer(pH7.4)に溶解させた。PEG−PAsp(DET)の濃度は、pH7.4において((PAsp(DET)の正電荷数)/(mRNAナノ集合体の負電荷数))(N+/P―比)が1.5となるように調整した。mRNA最終濃度が33.3μg/mLとなるようにPEG−PAsp(DET)溶液をmRNAナノ集合体溶液に添加し、高分子ミセルを調製した。PEG−PLysの場合は、pH7.4において((PLysの正電荷数)/(mRNAナノ集合体の負電荷数))(N+/P―比)が2となるように調整し、PEG−PAsp(DET)の場合と同様にPMを調製した。PMsの粒径はZetasizerNano(Malvern Instruments)によって評価した。結果を図8および図9に示す。集合体を形成していないmRNA(unhybridized mRNA)でも同様にPMを形成した。
ナノ集合体とブロック共重合体を形成させた場合でも、100nm以下の粒子が形成された。生体に投与した際、様々な細胞に効率的に取り込まれるサイズである。
ウシ胎児血清(FBS)を10mM HEPES buffer(pH7.4)で所定の濃度となるよう希釈し、そこにPM溶液を添加したのち、37℃で15分静置した。その後、RNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて溶液よりRNAを抽出した。抽出したRNAをコンプリメンタリーDNA(cDNA)に逆転写した後、qRT−PCRにより残存しているcDNAを定量評価した。FBS存在下で37℃静置を行わなかった場合のmRNA量を100%として、相対値を示した。以下の実験はN=4で行った(図10および11)。
尚、統計学的解析は、Studentのt検定を行い、n.s.はno significanceを意味する。
前述の実施例ではGLuc mRNAから調製したナノアッセンブリの解析結果を示したが、他のmRNAでも同様の戦略が有効であることを示すため、本実施例では、GFP mRNAから調製したナノアッセンブリの解析を行った。ここで、GFPのコード配列(配列番号21)を図12に示す。
「linker RNA oligomer」は、mRNAにハイブリダイズし得る17merの配列と、全てアデニン(A)である10merのリンカー配列と、17merの配列と同じ配列とを、この順に含むRNAオリゴマーである。
#17: CACCCCGGUGAACAGCUAAAAAAAAAACACCCCGGUGAACAGCU(配列番号22)
#18: CGCUGAACUUGUGGCCGAAAAAAAAAACGCUGAACUUGUGGCCG(配列番号23)
#19: CUUGCCGGUGGUGCAGAAAAAAAAAAACUUGCCGGUGGUGCAGA(配列番号24)
#20: GUGGUCGGGGUAGCGGCAAAAAAAAAAGUGGUCGGGGUAGCGGC(配列番号25)
#21: GCGCGGGUCUUGUAGUUAAAAAAAAAAGCGCGGGUCUUGUAGUU(配列番号26)
#22: GCCAUGAUAUAGACGUUAAAAAAAAAAGCCAUGAUAUAGACGUU(配列番号27)
#23: CUCGAUGUUGUGGCGGAAAAAAAAAAACUCGAUGUUGUGGCGGA(配列番号28)
#24: CUUCUCGUUGGGGUCUUAAAAAAAAAACUUCUCGUUGGGGUCUU(配列番号29)
実施例7で調製したmRNAナノアッセンブリについて解析を行ったが、各方法は前述の実施例のGLuc mRNAの場合と同様である。
実施例3(1)と同様の方法によりmRNAナノアッセンブリの大きさをFCS解析により評価した。
その結果を図13に示す。図13の縦軸(diffusion time(μsec))の数値が大きいほど、拡散が遅く、mRNAナノアッセンブリの粒子径が大きくなったことを意味する。GFP mRNAナノアッセンブリの粒子径は、GLuc mRNAナノアッセンブリの粒子径(図3(A))とほぼ同じであることが分かる。
実施例4(1)と同様の方法によりFetal Bovine Serum(FBS、Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.,Osaka,Japan)中でのmRNAナノアッセンブリの酵素耐性を調べた。ただし、FBS濃度は1%に固定した。
ここでqRT−PCRでは以下のプライマーを用いた。
ForwardのTarget sequence:AGAACGGCATCAAGGTGAAC(配列番号30)
ReverseのTarget sequence:TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG(配列番号31)
その結果を、図14に示す。「Nano−assembly」は、mRNAにRNAオリゴマーとして8つのlinker RNA oligomer(#17〜#24)を加えたものである。「Nano−assembly」ではmRNA(「Unhybridized」)よりも酵素安定性が向上した。
尚、統計学的解析は、Studentのt検定を行い、n.s.はno significanceを意味する。
実施例3(1)と同様の方法により、mRNAナノアッセンブリをAFMにより測定した。
その結果を図15(A)〜(D)に示す。図15(C)の右にカラースケールを示すが、色が白に近ければ近いほど高さが増していること、すなわちサイズが大きいことを示す。Linker数8個のmRNAナノアッセンブリは、白い部分が多く、かつ100nmを越える粒径のものが散見される(図15(C)および(D))。一方で、mRNA単体では白い部分は少なく、かつ100nmを越える粒径のものはほとんどない(図15(A)および(B))。これらのことから、mRNAナノアッセンブリの方が、mRNA単体と比較して粒径が大きいことが分かる。
FFFでは、mRNAナノアッセンブリの大きさに従った分離が可能であり、時間を経るに従い大きい粒子が分離される。
具体的には、実施例7で調製したGFP mRNAナノアッセンブリについて以下の条件にて解析を行った。
・機器名:Eclipse AF4(昭光サイエンティフィック(株))
・mRNA濃度:100ng/μL
・注入量:25μL
・流速は:detector flowを1mL/minとし、cross flowを28分かけて1mL/min〜0mL/minへ一定のペースで低下させた。
その結果を、図16に示す。Nanoassemblyでは、unhybridize(図16(B))と比較して右にシフトしており、大きな粒子形成が確認された(図16(A))。また、この方法ではnanoassemblyをサイズごとに分離することが可能である。
配列番号2〜18:合成RNA
配列番号19〜21:合成DNA
配列番号22〜29:合成RNA
配列番号30〜31:合成DNA
Claims (19)
- 目的遺伝子をコードするmRNAとRNAオリゴマーとの複合体であって、
RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーであり、
少なくも2種のRNAオリゴマーは、mRNAの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能であり、
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズすることで形成される、複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーである、請求項1に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズする第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーである、請求項1に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な17塩基の第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列をこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズする第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記少なくとも2種のRNAオリゴマーが、2〜8種のRNAオリゴマーである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の複合体。
- mRNAが1μg/mL〜10,000μg/mL、mRNAと少なくとも2種の各RNAオリゴマーとのモル比が1:0.05〜0.05:1となるようにmRNAと少なくとも2種のRNAオリゴマーを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
- 目的遺伝子をコードするmRNAと、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも2種のRNAオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
少なくも2種のRNAオリゴマーは、mRNAの配列中のそれぞれ異なる配列にハイブリダイズ可能なものであり、
複合体において、RNAオリゴマーの第1の配列は、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズする、
mRNAの安定化方法。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、前記第1の配列と同じ配列である第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 目的遺伝子をコードするmRNAとRNAオリゴマーとの複合体であって、
RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーであり、
RNAオリゴマーの第1の配列が、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズすることで形成される、複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーである、請求項9に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜30塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な15〜23塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 前記RNAオリゴマーが、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーである、請求項9に記載の複合体。
(a)mRNAの配列に相補的な17塩基の第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な17塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列
(b)mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、10塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な17塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 前記リンカー配列の塩基が全てアデニンである、請求項9〜11のいずれか1項に記載の複合体。
- 前記少なくとも1種のRNAオリゴマーが、2〜8種のRNAオリゴマーである、請求項9〜12のいずれか1項に記載の複合体。
- mRNAが1μg/mL〜10,000μg/mL、mRNAと少なくとも1種の各RNAオリゴマーとのモル比が1:0.05〜0.05:1となるようにmRNAと少なくとも1種のRNAオリゴマーを含む、請求項11〜13のいずれか1項に記載の複合体。
- 請求項11〜14のいずれか1項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
- 目的遺伝子をコードするmRNAと、以下の(a)又は(b)のRNA配列を含む少なくとも1種のRNAオリゴマーとの複合体を形成させることを含み、
複合体において、RNAオリゴマーの第1の配列は、RNAオリゴマーの第2の配列とは異なるmRNAにハイブリダイズする、
mRNAの安定化方法。
(a)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列;
(b)mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な第1の配列と、0〜100塩基のリンカー配列と、mRNAの配列に相補的な12〜40塩基の配列と90%以上の同一性を有し、かつmRNAにハイブリダイズ可能な配列であり、かつ第1の配列とは異なる第2の配列とをこの順に含むRNA配列 - 請求項1〜6及び11〜14のいずれか1項に記載の複合体を内包したmRNAの輸送担体。
- 輸送担体が、高分子ミセル又は脂質性mRNAキャリアである、請求項17に記載のmRNAの輸送担体。
- 請求項17または18に記載のmRNAの輸送担体を含む、医薬組成物。
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