CN105658673A - 新型的具有4个连接的ctl表位的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种癌症抗原肽，所述癌症抗原肽可以作为癌症的肽疫苗施用于广泛的癌症患者而不需要HLA分型检测，且不限定于具有特定的HLA分型的患者。通过将选自报道具有CTL诱导能力、且源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽组中的4个CTL表位肽经由接头连接而得到具有4个连接的CTL表位的肽。

Description

新型的具有4个连接的CTL表位的肽
技术领域
本发明涉及一种作为癌症抗原肽有用的新型肽。更详细而言，本发明涉及一种新型癌症抗原肽及利用其的药物组合物，所述新型癌症抗原肽为将具有HLA-A限制性的CTL诱导能力的4个肽连接而成。
背景技术
癌症占日本人的死亡原因的第1位，一年约35万人死亡，目前仍然为严重的疾病。作为已建立的癌症疗法，主要有手术切除术、抗癌药物治疗及放射治疗。但是，所述疗法存在复发、生活质量(QOL)的降低、以及在为不能接受前面叙述的治疗方法的中期癌症的情况下没有其他治疗方案等问题。
癌症免疫疗法(癌症疫苗疗法)长期以来被期待作为一种新的治疗方法，从可以鉴定人肿瘤抗原中的表位肽的1990年起，在全世界开始了癌症肽疫苗的临床研究。但是，根据利用肽单独施用或综合疗法的临床研究成果的分析结果，在1,000例以上的施用例中，成功率仅为2.7％(非专利文献1)，已经指出了实际应用的困难。
另一方面，在日本还继续长期进行使用特有的癌症肽疫苗的临床研究，其成果逐渐变得显著。近年来，作为以提高治疗效果为目标的方法之一，还开始采用施用多种癌症肽而不是施用1种癌症肽的战略。例如，通过预先检查患者的HLA分型及特异性免疫应答，实施了选择多种待施用的肽的特制(tailor-made)型的癌症肽疫苗疗法，且安全性及抗肿瘤效果得到确认。具体而言，通过特制型肽疫苗的单独施用或与抗癌药物的联用，在脑肿瘤、***、甚至***癌、以及胰腺癌方面实现了优异的临床效果以及安全性(非专利文献2、3、4)。
在癌症肽疫苗疗法中，被认为是主要的效应细胞的表位特异性细胞毒性T淋巴细胞(以下简称为CTL)引起的细胞性免疫是HLA限制性的，实施了具有特定的HLA分型、且具体而言仅以具有对象患者数多的HLA-A2或HLA-A24的患者为对象的癌症肽疫苗开发。
但是，这2种HLA分型持有比例在日本人中分别为约40％、60％(非专利文献5)，存在具有这2种以外的HLA分型的患者不能接受癌症肽疫苗的好处的问题。进而，在治疗开始前需要HLA分型检测成为使治疗的开始时期延迟、使患者负担增大的一个原因。由以上考虑，期望不需要HLA分型检测、可应用于全部癌症患者的癌症肽疫苗的开发及研究。
另外，已知在癌症肽疫苗疗法中，除了作为细胞免疫的CTL的激活之外，通过诱导作为体液免疫的免疫球蛋白产生，有助于延命的效果(非专利文献6)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:RosenbergSAetal.,NatureMed.2004,10(9):909-15
非专利文献2:TerasakiMetal.,JClinOncol.2011,29(3):337-44
非专利文献3:NoguchiMetal.,Cancerlmmunol.lmmunother.2010,59(7):1001-9
非专利文献4:YanagimotoHetal.，CancerSci.2007,98(4):605-11
非专利文献5:SetteAetal.,Immunogenetics.1999,50(3-4):201-12
非专利文献6:NoguchiMetal.,CancerBiol.Ther.2011,10(12):1266-79
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种癌抗原肽，所述癌抗原肽并不限定于具有特定的HLA分型的患者，可以作为癌症肽疫苗施用于广泛的癌症患者，且可以较强地诱导免疫球蛋白。
用于解决课题的技术方案
本发明人等发现了通过将选自报道具有HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26或HLA-A3超型的任一种、或具有上述的多种HLA-A限制性的CTL诱导能力的CTL表位肽中的4个肽经由接头连接而得到具有4个连接的CTL表位的肽。对该具有4个连接的CTL表位的肽，为了解决上述课题进行了潜心研究，结果发现：由选自公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽中的特定的13种的肽构成的具有4个连接的CTL表位的肽不需要HLA分型检测，且并不限定于具有特定的HLA分型的患者，可以施用于广泛的癌症患者。进而发现：通过施用该具有4个连接的CTL表位的肽，除对构成该肽的CTL表位肽特异性的CTL之外，还较强地诱导免疫球蛋白，从而完成了本发明。
即，本发明具有以下的特征。
[1]一种具有4个连接的表位的肽，其为从由以下的CTL表位肽：序列号1所示的肽“PEP1”、序列号2所示的肽“PEP2”、序列号4所示的肽“PEP4”、序列号5所示的肽“PEP5”、序列号6所示的肽“PEP6”、序列号7所示的肽“PEP7”、序列号8所示的肽“PEP8”、序列号9所示的肽“PEP9”、序列号10所示的肽“PEP10”、序列号13所示的肽“PEP13”、序列号15所示的肽“PEP15”、序列号17所示的肽“PEP17”、及序列号18所示的肽“PEP18”构成的组中可以重复地选择的4个肽经由接头分别连接而成，可以具有由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列，其中，
所述具有4个连接的表位的肽具有选自以下的(1)～(5)中的任一个特征：
(1)C末端为PEP2(其中，不包括N末端为PEP7和PEP8、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接的肽)；
(2)C末端为PEP4；
(3)C末端为PEP10；
(4)C末端为PEP6和PEP5，以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接；
(5)含有PEP5、PEP6、PEP9和PEP18。
[2]如[1]所述的具有4个连接的表位的肽，其是选自PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18中的不重复的4个肽经由接头分别连接而成的。
[3]如[1]或[2]所述的具有4个连接的表位的肽，其具有选自以下的(1)～(5)中的任一个特征：
(1)含有选自PEP1、PEP7、PEP8和PEP13中的3个CTL表位肽，且C末端为PEP2(其中，不包括N末端为PEP7和PEP8、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接的肽)；
(2)含有PEP5、PEP6和PEP9的3个CTL表位肽，且C末端为PEP4；
(3)含有选自PEP1、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18中的3个CTL表位肽，且C末端为PEP10；
(4)含有PEP1和PEP7的2个CTL表位肽，且C末端为PEP6和PEP5、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接；
(5)含有PEP5、PEP6和PEP18的3个CTL表位肽，且C末端为PEP9。
[4]如[1]～[3]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其含有选自以下的序列：
·PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
·PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
·PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
·PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
·PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
·PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
·PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2；
·PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10；
·PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10；
·PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9；
·PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9；
·PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5；或
·PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5，
式中，“-(L)-”表示接头。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，所述接头为氨基酸接头。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，所述氨基酸接头为连接2个或3个精氨酸的精氨酸二聚体或精氨酸三聚体。
[7]如[1]～[6]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列连接于N末端。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列包含连接3个精氨酸的精氨酸三聚体或连接4个精氨酸的精氨酸四聚体。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其包含序列号22、序列号23、序列号24、序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号43、序列号44、序列号45、序列号46、序列号47、序列号48、序列号49、序列号50、序列号51、序列号52、序列号53、序列号54、序列号55、序列号56、序列号57、序列号58、序列号59、序列号60、序列号61、序列号62、序列号63、序列号64、序列号65、或序列号66所示的氨基酸序列。
[10]一种CTL，其通过使用根据[1]～[9]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽刺激外周血淋巴细胞而得到。
[11]一种药物组合物，其含有根据[1]～[9]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽、或根据权利要求10所述的CTL作为有效成分。
[12]一种药物组合物，其含有2种以上的根据[1]～[9]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽。
[13]如[11]或[12]所述的药物组合物，其为免疫治疗剂。
[14]一种癌症的治疗方法，其包括：将根据[1]～[9]中任一项所述的具有4个连接的表位的肽、根据[10]所述的CTL、或根据[11]～[13]中任一项所述的药物组合物施用于癌症患者。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2013-218524号、2014-155132号的说明书和/或附图中所记载的内容。
发明效果
根据本发明，可以提供一种癌抗原肽，所述癌抗原肽并不限定于具有特定的HLA分型的患者，可以作为癌症肽疫苗施用于广泛的癌症患者，且可以较强地诱导免疫球蛋白。
本发明的具有4个连接的CTL表位的肽不需要HLA分型检测，可以施用于广泛的癌症患者，例如HLA-A2阳性患者群体、HLA-A24阳性患者群体、HLA-A26阳性患者群体、HLA-A3超型阳性患者群体，可以治疗和/或预防该患者中的癌症或起因于其的疾病。另外，可观察到构成本发明的具有4个连接的CTL表位的肽的肿瘤抗原在多个癌症类型中表达，因此，本发明的具有4个连接的CTL表位的肽可以作为用于治疗和/或预防多种癌症类型的药物组合物(更详细而言为免疫治疗剂)使用。进而，与将所构成的CTL表位肽进行混合而等量施用的情况相比，通过施用本发明的具有4个连接的表位的肽，可以更强地诱导CTL表位肽特异性CTL及免疫球蛋白，并且可以更有效地激活抗肿瘤免疫。
附图说明
图1-1表示实施例1中得到的4连接肽(TPV06、TPV10、TPV12、TPV21、TPV26、TPV30、TPV35、TPV37、TPV39、TPV40、TPV41、TPV43、TPV45)的各HPLC的结果。
图1-2是图1-1的接续。
图1-3是图1-2的接续。
图1-4是图1-3的接续。
图1-5是图1-4的接续。
图1-6是图1-5的接续。
图1-7是图1-6的接续。
图2-1表示实施例1中得到的4连接肽(TPV39、TPV40、TPV41、TPV43、TPV45)的MS的结果。
图2-2是图2-1的接续。
图2-3是图2-2的接续。
图3-1表示施用具有4个连接的表位的肽的小鼠模型中的表位特异性CTL诱导结果(*：表示未研究)。此外，显示将具有4个连接的表位的肽用人免疫蛋白酶体切割后，评价了表位肽的C末端有无切出确定的PEP2或PEP10的结果。
图3-2是图3-1的接续。
图3-3是图3-2的接续。
图3-4表示施用在N末端具有由精氨酸构成的肽序列的具有4个连接的表位的肽、或具有作为肽之间的接头的精氨酸三聚体的具有4个连接的表位的肽的小鼠模型中的表位特异性CTL诱导结果(*：表示未研究)。此外，显示将具有4个连接的表位的肽用人免疫蛋白酶体切割后，评价了表位肽的C末端有无切出确定的PEP2或PEP10的结果。
图4-1表示施用具有4个连接的表位的肽的小鼠模型中的血清中表位特异性IgG抗体滴度的测定结果。
图4-2是图4-1的接续。
图4-3表示施用在N末端具有由精氨酸构成的肽序列的具有4个连接的表位的肽、或具有作为肽之间的接头的精氨酸三聚体的具有4个连接的表位的肽的小鼠模型中的血清中表位特异性IgG抗体滴度的测定结果。
具体实施方式
以下，进一步对本发明进行具体说明。
1.具有4个连接的CTL表位的肽
本发明的“具有4个连接的CTL表位的肽”是指将选自源自相同和/或不同的肿瘤抗原分子的CTL表位肽中的4个肽经由接头以线性连接而成为1个分子的肽。
“源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽”为肿瘤抗原在肿瘤细胞内分解而产生的肽，其通过与HLAI类分子结合并递呈在细胞表面上，可以被肿瘤特异性CTL识别、以及/或者可以诱导和/或激活肿瘤特异性CTL。“诱导肿瘤特异性CTL”是指：在体外或体内，使特异性地识别源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽的CTL分化和/或增殖。另外，“激活肿瘤特异性CTL”是指：通过CTL识别由HLAI类分子所递呈的抗原，产生干扰素-γ(IFN-γ)和/或通过细胞毒性物质等的释放而显示细胞毒性活性。在本说明书中，有时将“源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽”简称为“CTL表位肽”。
作为源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽，已知有如下的CTL表位肽：
PEP1：KLVERLGAA(序列号1[WO200l/0l1044])；
PEP2：ASLDSDPWV(序列号2[WO2002/010369])；
PEP3：ALVEFEDVL(序列号3[WO2002/010369])；
PEP4：LLQAEAPRL(序列号4[WO2000/12701])；
PEP5：DYSARWNEI(序列号5[日本特开平11-318455号])；
PEP6：VYDYNCHVDL(序列号6[WO2000/12701])；
PEP7：LYAWEPSFL(序列号7[日本特开2000-000270号])；
PEP8：DYLRSVLEDF(序列号8[WO2001/011044])；
PEP9：QIRPIFSNR(序列号9[WO2008/007711])；
PEP10：ILEQSGEWWK(序列号10[WO2009/022652])；
PEP11：VIQNLERGYR(序列号11[WO2009/022652])；
PEP12：KLKHYGPGWV(序列号12[WO1999/067288])；
PEP13：RLQEWCSVI(序列号13[WO2002/010369])；
PEP14：ILGELREKV(序列号14[WO2002/010369])；
PEP15：DYVREHKDNI(序列号15[WO2005/071075])；
PEP16：HYTNASDGL(序列号16[WO2001/011044])；
PEP17：NYSVRYRPGL(序列号17[日本特开2000-000270号])；
PEP18：RYLTQETNKV(序列号18[日本特开2007-145715号])；
PEP19：TFDYLRSVL(序列号19[WO2001/011044])。
在此，PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP8、PEP10、PEP12、PEP13、PEP14和PEP15可以诱导和/或激活被HLA-A2限制的CTL。PEP2、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP12、PEP13、PEP15、PEP16、PEP17、PEP18和PEP19可以诱导和/或激活被HLA-A24限制的CTL。PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP9、PEP10、PEP11、PEP12、PEP13、PEP15、和PEP16可以诱导和/或激活被HLA-A3超型限制的CTL。以及PEP2和PEP6可以诱导和/或激活被HLA-A26限制的CTL。另外，编码这些CTL表位肽的基因被确认在多个癌症类型中表达(YangDetal.,CancerRes.1999,59:4056-63；HarashimaNetal.,Eur.J.Immunol.2001,31(2),323-32)。
本发明的“具有4个连接的CTL表位的肽”为将选自上述CTL表位肽中的特定的13种中的4种CTL表位肽经由接头以线性连接而成为1个分子的各种具有4个连接的CTL表位的肽，可以诱导和/或激活3种以上的各CTL表位肽特异性的CTL。予以说明，对于不能直接评价CTL表位肽特异性的诱导的肽(PEP2、PEP10)，可以通过利用免疫蛋白酶体的切割实验(后述的实施例3)，对该表位肽特异性CTL诱导的有无进行判断。一般而言，已知被抗原递呈细胞内吞的抗原蛋白经由蛋白酶体、免疫蛋白酶体被切割，而且已知为内吞的抗原蛋白经由HLA而进行抗原递呈而必须的途径(例如，RockKL,YorkIA,GoldbergAL,NatImmunol.2004；5(7):670-677)。另外，为了使这些表位肽与HLA的袋状结构结合，CTL表位肽在适当的部位被切割是必须的。这些表位肽需要通过利用蛋白酶体、免疫蛋白酶体的切割而确定CTL表位肽的C末端氨基酸(RockKL,YorkIA,GoldbergAL,NatImmunol.2004；5(7):670-677)。设想将具有4个连接的表位的肽施用于人时，由树突状细胞递呈CTL表位肽，并且使用在树突状细胞中大量表达的免疫蛋白酶体，在体外对具有4个连接的表位的肽的切割形式进行分析。在通过利用免疫蛋白酶体的切割而出现CTL表位肽的情况下，可以判断为诱导该表位肽特异性CTL。
选自特定的13种中的4种CTL表位肽为在本说明书中从序列号1所示的肽“PEP1”、序列号2所示的肽“PEP2”、序列号4所示的肽“PEP4”、序列号5所示的肽“PEP5”、序列号6所示的肽“PEP6”、序列号7所示的肽“PEP7”、序列号8所示的肽“PEP8”、序列号9所示的肽“PEP9”、序列号10所示的肽“PEP10”、序列号13所示的肽“PEP13”、序列号15所示的肽“PEP15”、序列号17所示的肽“PEP17”、序列号18所示的肽“PEP18”中可以重复地选择的4种CTL表位肽。
在本发明中，在PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18的各氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸被置换、***、缺失、和/或添加的氨基酸序列、且与原来的肽同等或具有其以上的CTL诱导能力、免疫球蛋白产生诱导能力的肽也可以作为“CTL表位肽”使用。在此，“多个”为1～3个、优选1～2个。作为这样的肽，可列举例如用具有与原来的氨基酸类似的特性的氨基酸置换(即，通过保守氨基酸置换而得到)的肽。
就本发明的具有4个连接的CTL表位的肽而言，从PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18中可以重复地选择的4个表位肽经由接头分别以线性连接。
接头只要可以在向生物体施用具有4个连接的CTL表位的肽时被切割，且能够使被连接的CTL表位肽彼此被分离即可，可列举例如：酯键、醚键、酰胺键、糖链接头、聚乙二醇接头、氨基酸接头等。作为用作氨基酸接头的氨基酸序列，可以例示：精氨酸二聚体、精氨酸三聚体、精氨酸四聚体、赖氨酸二聚体、赖氨酸三聚体、赖氨酸四聚体、甘氨酸二聚体、甘氨酸三聚体、甘氨酸四聚体、甘氨酸五聚体、甘氨酸六聚体、丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(AAY)、异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸(ILA)、精氨酸-缬氨酸-赖氨酸-精氨酸(RVKR)等，优选为精氨酸二聚体或精氨酸三聚体。
可以通过将以预定的组合及预定的连接顺序合成的具有4个连接的表位的肽施用于人HLA-A转基因小鼠，评价在活体内各CTL表位肽特异性CTL诱导的有无而确定所选择的CTL表位肽及其连接顺序。
优选本发明的具有4个连接的表位的肽具有选自以下的(1)～(5)中的一个或多个特征：
(1)C末端为PEP2(其中，不包括N末端为PEP7和PEP8、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接的肽)；
(2)C末端为PEP4；
(3)C末端为PEP10；
(4)C末端为PEP6和PEP5，以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接；
(5)含有PEP5、PEP6、PEP9和PEP18。
更优选本发明的具有4个连接的表位的肽为具有选自以下的(1)～(5)中的任一个特征的上述具有4个连接的表位的肽：
(1)含有选自PEP1、PEP7、PEP8和PEP13中的3个CTL表位肽，且C末端为PEP2(其中，不包括N末端为PEP7和PEP8、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接的肽)；
(2)含有PEP5、PEP6和PEP9的3个CTL表位肽，且C末端为PEP4；
(3)含有选自PEP1、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18中的3个CTL表位肽，且C末端为PEP10；
(4)含有PEP1和PEP7的2个CTL表位肽，且C末端为PEP6和PEP5、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接；
(5)含有PEP5、PEP6和PEP18的3个CTL表位肽，且C末端为PEP9。
进一步优选本发明的具有4个连接的表位的肽含有选自以下的序列、或由该序列构成(式中“-(L)-”表示接头)：
·PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4(TPV01)；
·PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4(TPV02)；
·PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4(TPV03)；
·PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4(TPV04)；
·PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4(TPV05)；
·PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4(TPV06)；
·PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV07)；
·PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV08)；
·PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV09)；
·PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2(TPV10)；
·PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV11)；
·PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV12)；
·PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV13)；
·PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2(TPV14)；
·PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2(TPV15)；
·PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2(TPV16)；
·PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV17)；
·PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV18)；
·PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV19)；
·PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV20)；
·PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV21)；
·PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV22)；
·PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV23)；
·PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV24)；
·PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10(TPV25)；
·PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10(TPV26)；
·PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV27)；
·PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10(TPV28)；
·PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV29)；
·PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10(TPV30)；
·PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10(TPV31)；
·PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV32)；
·PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10(TPV33)；
·PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10(TPV34)；
·PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9(TPV35)；
·PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9(TPV36)；
·PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5(TPV37)；或
·PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5(TPV38)。
本发明的具有4个连接的CTL表位的肽可以具有由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列。该肽序列可以添加至具有4个连接的CTL表位的肽的N末端和/或C末端，优选添加至N末端。该肽序列可以从选自由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸及谷氨酸构成的组中的由1～15个、优选2～10个、进一步优选3～5个亲水性氨基酸构成的肽序列中选择。例如，作为该肽序列，可以利用精氨酸三聚体(RRR)或精氨酸四聚体(RRRR)，作为添加有这样的肽序列的具有4个连接的CTL表位的肽，可例示：RRR-TPV06、RRRR-TPV06、TPV06-RRR、TPV06-RRRR、RRR-TPV10、RRRR-TPV10、TPV10-RRR、TPV10-RRRR、RRR-TPV12、RRRR-TPV12、TPV12-RRR、TPV12-RRRR、RRR-TPV21、RRRR-TPV21、TPV21-RRR、TPV21-RRRR、RRR-TPV26、RRRR-TPV26、TPV26-RRR、TPV26-RRRR、RRR-TPV30、RRRR-TPV30、TPV30-RRR、TPV30-RRRR、KKK-TPV06、KKKK-TPV06、TPV06-KKK、TPV06-KKKK、KKK-TPV10、KKKK-TPV10、TPV10-KKK、TPV10-KKKK、KKK-TPV12、KKKK-TPV12、TPV12-KKK、TPV12-KKKK、KKK-TPV21、KKKK-TPV21、TPV21-KKK、TPV21-KKKK、KKK-TPV26、KKKK-TPV26、TPV26-KKK、TPV26-KKKK、KKK-TPV30、KKKK-TPV30、TPV30-KKK、TPV30-KKKK、HHH-TPV06、HHHH-TPV06、TPV06-HHH、TPV06-HHHH、HHH-TPV10、HHHH-TPV10、TPV10-HHH、TPV10-HHHH、HHH-TPV12、HHHH-TPV12、TPV12-HHH、TPV12-HHHH、HHH-TPV21、HHHH-TPV21、TPV21-HHH、TPV21-HHHH、HHH-TPV26、HHHH-TPV26、TPV26-HHH、TPV26-HHHH、HHH-TPV30、HHHH-TPV30、TPV30-HHH、TPV30-HHHH、RRKK-TPV12、RKRK-TPV12、RHRH-TPV12、RRHH-TPV12、KKHH-TPV12、KHKH-TPV12等，优选列举：KKK-TPV06、KKKK-TPV06、KKK-TPV10、KKKK-TPV10、KKK-TPV12、KKKK-TPV12、KKK-TPV21、KKKK-TPV21、KKK-TPV26、KKKK-TPV26、KKK-TPV30、KKKK-TPV30、HHH-TPV06、HHHH-TPV06、HHH-TPV10、HHHH-TPV10、HHH-TPV12、HHHH-TPV12、HHH-TPV21、HHHH-TPV21、HHH-TPV26、HHHH-TPV26、HHH-TPV30、HHHH-TPV30、RRKK-TPV12、RKRK-TPV12、RHRH-TPV12、RRHH-TPV12、KKHH-TPV12、KHKH-TPV12，进一步优选列举：RRR-TPV06、RRRR-TPV06、RRR-TPV10、RRRR-TPV10、RRR-TPV12、RRRR-TPV12、TRRR-TPV21、RRRR-TPV21、RRR-TPV26、RRRR-TPV26、RRR-TPV30、RRRR-TPV30。已知添加有该肽序列的肽在含水溶剂中的溶解度得到了提高(AbdelkrimAlileche等、Peptides38(2012)302-311；日本特开2006-188507)。通过在本发明的具有4个连接的CTL表位的肽上添加该肽序列，可以提高具有4个连接的CTL表位的肽在含水溶剂中的溶解度。
本发明的具有4个连接的表位的肽不仅可以诱导和/或激活连接的4种CTL表位肽中的至少3种以上、优选4种CTL表位肽中的各CTL表位肽特异性CTL，而且还可以进一步诱导各CTL表位肽特异性免疫球蛋白的产生。予以说明，在此“免疫球蛋白”是指IgG、IgM、IgA、IgD。
本发明的具有4个连接的表位的肽可以为酸加成盐或碱加成盐。为了形成酸加成盐而通常使用的酸为盐酸、氢溴酸、氢碘酸、草酸、对溴苯基磺酸、羧酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸、三氟乙酸等有机酸。作为碱加成盐，可列举由氢氧化铵、或碱金属或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等无机碱衍生的盐。
2.具有4个连接的CTL表位的肽的制造
本发明的具有4个连接的CTL表位的肽可以通过常规的液相合成法、固相合成法等肽合成法、利用自动肽合成仪的肽合成法等来制造(Kelleyetal.,GeneticsEngineeringPrinciplesandMethods,Setlow,J.K.eds.,PlenumPressNY.(1990)Vol.12,p.1-19；Stewartetal.,Solid-PhasePeptideSynthesis(1989)W.H.FreemanCo.；Houghten,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:p.5132、《新生化学実験講座1タンパク質IV》(1992)日本生物化学会编，东京化学同人)。就肽合成而言，准备各氨基酸的、待被结合的α-氨基和α-羧基以外的官能团被保护的氨基酸类，以及在各氨基酸的α-氨基和α-羧基之间进行肽键形成反应。通常，将位于肽的C末端的氨基酸残基的羧基经由适当的间隔序列或接头与固相结合，将以上得到的二肽的氨基末端的保护基团选择性地除去，与下一个氨基酸的α-羧基之间形成肽键。连续进行这样的操作，制造具有保护的侧基的肽，最后除去全部的保护基团，并从固相中分离。保护基团的种类或保护方法、肽键形成方法的细节详细地记载于上述文献。
或者，可以通过使用编码本发明的具有4个连接的表位的肽的核酸的基因重组技术或噬菌体展示技术等制造肽。
基因重组技术包括：将编码本发明的具有4个连接的表位的肽的DNA***适当的表达载体中，将载体导入适当的宿主细胞，将细胞进行培养，从细胞内或细胞外液回收目的肽。作为载体，没有特别限定，例如为质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒等载体。用于导入载体的宿主细胞为大肠杆菌或枯草杆菌等细菌、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞)、植物细胞等，向这些细胞的转化或转染包括例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、基因枪法、PEG法等。将转化的细胞进行培养的方法按照用于培养宿主生物的常规方法进行。为了便于本发明的肽的回收，优选使通过表达而生成的肽分泌于细胞外。为此，将编码使肽能够从该细胞分泌的肽序列的DNA结合在编码目的肽的DNA的5’末端。或者，也可以回收积累在细胞内的目的肽。该情况下，将细胞进行物理或化学破坏，并使用蛋白质纯化技术回收目的肽。
所制造的肽可以通过常规方法，例如通过凝胶过滤色谱法、离子交换柱色谱法、亲和色谱法、反相柱色谱法、HPLC等色谱法、硫酸铵分级、超过滤、免疫吸附法等进行回收或纯化。
3.细胞毒性T淋巴细胞
使用本发明的具有4个连接的表位的肽，可以在体外和/或离体获得CTL表位肽特异性、破坏癌细胞的CTL。使用CTL表位肽在体外和/或离体诱导CTL的方法为公知的(例如日本特开2006-14637号公报)，且在本发明中也可以利用这些方法。例如，将源自健康人或癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)中的板粘附细胞在GM-CSF、IL-4等细胞因子的存在下进行培养，以诱导树突状细胞(DC)。将本发明的具有4个连接的表位的肽脉冲于该树突状细胞之后，进行X射线照射，由此制备抗原递呈细胞(刺激物)。在不能使用DC的情况下，可以使用将本发明的具有4个连接的表位的肽脉冲于源自健康人或相同的癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)之后，进行了X射线照射的物质。接着，加入源自健康人的外周血单核细胞细胞(PBMC)或源自癌症患者的外周血单核细胞(PBMC)或相关***淋巴细胞(应答物)，在IL-2、IL-4、IL-7等细胞因子存在下进行培养。其后，加入如上述那样将本发明的具有4个连接的表位的肽脉冲而得到的抗原递呈细胞并进行再刺激，并在IL-2等细胞因子存在下进一步培养。
作为用于CTL诱导的细胞培养用培养基，使用T淋巴细胞可以生存的任何培养基即可。例如，可以使用在RHAMα培养基(Kawai,K.,Sasaki,T.,Saijo-Kurita,K.,Akaza,H.,Koiso,K.,andOhno,T.,CancerImmunol.Immunother.35,225-229,1992中所记载的LAKmedium)、AIMV培养基(GIBCOBRL,LifeTechnologies,INC.)、或RPMI1640培养基等中添加了IL-2等各种细胞因子或胎牛血清(FCS)等的培养基。
培养条件按照本领域技术人员公知的条件即可。例如，将培养温度设为33℃～41℃、优选37℃。另外，可以将含有空气或适当浓度的氧和为了将培养基的pH保持在约7.4而含有适当浓度的二氧化碳(例如5％CO2)的惰性气体作为气相使用。优选培养4～10天，更优选7天或8天。通过进行这样的培养而诱导的CTL包含对构成具有4个连接的表位的肽的4个CTL表位肽中的至少3种、优选4种CTL表位肽中的各CTL表位肽特异性的CTL，可以特异性地破坏癌细胞。
4.药物组合物
本发明的具有4个连接的表位的肽可以用作用于癌症的免疫治疗的药物组合物的有效成分。
在本发明的药物组合物中，可以含有上述具有4个连接的表位的肽中的1种或多种作为有效成分。通过含有多种具有4个连接的表位的肽，可以得到更高的效果，并不限定于具有特定的HLA分型的患者，成为可以作为癌症肽疫苗进一步施用于广泛的癌症患者的、通用性更高的药物组合物。
观察到编码本发明的具有4个连接的表位的肽中包含的PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18的基因在多个实体癌及血液癌中表达。作为实体癌，可列举例如：脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、甲状腺癌、***、子宫体癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、***癌、肾癌、肝癌、胆道癌、头颈癌、膀胱癌、***癌、恶性黑色素瘤、皮肤癌、舌癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤等。作为血液癌，可列举例如：白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤等。因此，本发明的具有4个连接的表位的肽对这些癌症的治疗和/或预防是有用的。在此，“癌症的治疗和/或预防”是指预防癌症的发生/复发、抑制癌症的进展/恶化、改善癌症的症状。
本发明的药物组合物可以含有作为药学上可接受的制剂原料的常用的各种有机或无机载体物质等。作为可以利用的药物载体，可以例示根据制剂的施用形式通常所使用的稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH调节剂、表面活性剂(界面活性剤)、填充剂、增稠剂、粘结剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂(表面活性剤)、润滑剂、舒缓剂、稀释剂或者赋形剂等，优选制备这些物质作为利用常规方法添加的混合剂。
另外，本发明的药物组合物可以含有已知在疫苗的施用时使用的佐剂。作为佐剂，可以列举：完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、明矾、脂质A、单磷酰脂质A、BCG(Bacillus-Calmette-Guerrin)等细菌制剂、CpG-DNA、dsRNA等核酸、结核菌素等细菌成分制剂、钥孔虫戚血蓝蛋白和酵母甘露聚糖等天然高分子物质、胞壁酰三肽或胞壁酰二肽或它们的衍生物、矾(alum)、非离子嵌段共聚物、白细胞介素2(IL-2)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)等细胞因子等，可以单独使用或以两种以上组合使用这些物质。佐剂可以与本发明的药物组合物以混合物形式、或作为乳液同时进行施用。
进而，除上述具有4个连接的表位的肽之外，本发明的药物组合物可以含有以下的1种或多种组合：公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽或含有其的肽、或将它们连接而成的肽(以下，记载为“公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽等”)。作为公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽，可列举例如：WT-1p126-134、改性的(M236Y)WT-1p235-243、NY-ESO-1p157-165、改性的(T210M)gp100p209-217、存活素-2Bp80-88、Her-2/neup63-71、VEGFR2p169-177、MART-1p26-35、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3p298-306、SPARCp143-151等，但并不限定于这些。该情况下，本发明的具有4个连接的表位的肽和公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽等既可以为单一剂型的制剂形式，也可以是含有本发明的具有4个连接的表位的肽作为有效成分的制剂和含有公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽等作为有效成分的制剂为不同的制剂形式。
本发明的药物组合物可以根据施用形式而选择制剂形式。作为代表性的制剂形式，可以制作液体制剂、乳剂、脂质体制剂、脂肪乳剂、环糊精等包合物、悬浮剂、软膏剂、霜剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、粉末剂、颗粒剂、细粒剂、糖浆剂等，但并不限定于这些。这些制剂根据施用途径进一步分类为经口剂、非经口剂、经鼻剂、经***剂、栓剂、舌下剂、吸入剂、滴眼剂、点耳剂等，且可以分别按照常规的方法进行调制、成形或制备。另外，除可以作为液体制剂使用之外，也可以设为可进行冷冻干燥并保存的状态之后、在使用时用含有水或生理盐水等缓冲液等进行溶解而制备成适当的浓度后使用。
另外，本发明的药物组合物可以含有使用上述本发明的具有4个连接的表位的肽在体外和/或离体诱导的CTL作为有效成分。这样的药物组合物优选为非经口剂的形式。
5.治疗方法
本发明的药物组合物可以施用于广泛的癌症患者、例如选自由HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26及HLA-A3超型构成的组中的HLA分型阳性患者群体，可以在治疗开始前不需要HLA分型检测而开始治疗。
本发明的药物组合物通过对癌症患者进行施用，可以诱导和/或激活构成作为有效成分所含有的具有4个连接的表位的肽的至少3种、优选4种CTL表位肽特异性的CTL，进而可以诱导该CTL表位肽特异性免疫球蛋白的产生。作为有效成分所含有的具有4个连接的表位的肽的施用引起的免疫球蛋白的产生的诱导显著地高于没有连接具有4个连接的表位的肽中所含的CTL表位肽而彼此混合施用时所观察到的免疫球蛋白的产生的诱导。因此，本发明中的具有4个连接的表位的肽可以有效地治疗和/或预防癌症患者中的癌症。
本发明的药物组合物可以通过经口施用、静脉施用、动脉施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、舌下施用、腹腔内施用、直肠内施用、经皮施用、经粘膜施用、经鼻施用、经***施用、经眼施用、抽吸施用等进行施用。含有多种具有4个连接的表位的肽、或公知的源自肿瘤抗原分子的CTL表位肽等作为有效成分的制剂分别作为不同的药物组合物进行制备的情况下，各药物组合物可以通过相同或不同的施用途径同时或分别地进行施用。
本发明的药物组合物的施用量可以根据待治疗的癌症的状态/严重程度、个体患者的年龄、体重等因素而适当调整，但优选以0.0001mg～1000mg、优选0.001mg～100mg、更优选0.01mg～50mg的量含有具有4个连接的表位的肽的药物组合物、将其在每隔数日、数周或数个月重复施用1次。另外，在含有使用本发明的具有4个连接的表位的肽在体外和/或离体进行诱导的CTL作为本发明的药物组合物的有效成分的情况下，优选每天每1kg体重以1周～2周的间隔施用2×106～2×108个CTL。
本发明的药物组合物也可以与通常用于癌症化学治疗的药品联用而施用于癌症患者。可列举例如：环磷酰胺、替莫唑胺、苯达莫司汀等烷基化剂；替加氟-尿嘧啶混合剂、替加氟-吉莫斯特-氧嗪酸钾混合剂、甲氨蝶呤、吉西他滨等代谢拮抗剂；顺铂、奥沙利铂等含铂制剂；依立替康、艾日布林、紫杉醇、多西他塞、长春新碱等植物生物碱制剂；阿霉素、博来霉素、放射菌素D等抗癌抗生素；伊马替尼、舒尼替尼、吉非替尼、索拉非尼、依维莫司、曲妥单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、Mogamulizumab等分子靶向治疗剂；比卡鲁胺、雌莫司汀、依西美坦等激素治疗剂；香菇多糖、溶链菌、云芝多糖等免疫治疗剂等。这些药品可以通过与本发明的药物组合物相同或不同的施用途径、同时或分别地进行施用。
以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例限定。
实施例
实施例1肽的合成、纯化
CTL表位肽及具有4个连接的表位的肽使用市售的肽合成仪Prelude(ProteinTechnologies,Inc.)，用固相合成法(Fmoc法)合成。即，使具有活性基团保护的氨基酸吸附于Alko-PEG树脂，其中注入脱保护液而除去保护基团，注入具有活性基团保护的氨基酸，使两者反应，合成二肽。通过重复该操作，合成具有目的序列的肽。肽的保护基团通过在含有2.5％三异丙基硅烷、2.5％水、95％三氟乙酸的脱保护液中反应2小时而被除去，在得到的滤液中添加冷醚，由此可以将肽作为沉淀回收。将得到的各种合成肽用YMC-PackProC18柱(YMCCo.,Ltd.)及HPLC***(Gilson)使用0.1％TFA水溶液及乙腈作为溶剂体系纯化。最终的纯化的肽利用LC-MS***(WATERSACQUITYUPLC***、micromassZQ)确认纯度及分子量，冷冻干燥后在冷暗处保存，供于以下所示的实施例。表1-1～表1-8表示得到的4连接肽(TPV01～TPV45)的MS谱图数据。另外，将TPV06、TPV10、TPV12、TPV21、TPV26、TPV30、TPV35、TPV37、TPV39、TPV40、TPV41、TPV43及TPV45的LC数据示于图1-1～1-7。此外，将TPV39、TPV40、TPV41、TPV43及TPV45的MS数据示于图2-1～2-3。
表1-1
MS数据
表1-2
表1-3
表1-4
表1-5
表1-6
表1-7
表1-8
表中“ND”表示未检测出。
将合成的CTL表位肽的氨基酸序列示于表2，将具有4个连接的表位的肽的氨基酸序列示于表3及表4。表4中记载的具有4个连接的表位的肽为在表3中记载的TPV12、TPV06、TPV26在N末端进一步添加有由精氨酸构成的肽序列的肽，肽之间的接头为精氨酸三聚体。
予以说明，分别合成与HLA-A2结合的作为对照肽的WT1(序列号20)、与HLA-A24结合的作为对照肽的Her2(序列号21)。
表2
CTL表位肽
肽 来源 氨基酸序列 序列号
PEP1 Lck-246 KLVERLGAA 序列号1
PEP2 WHSC2-103 ASLDSDPWV 序列号2
PEP4 SART3-302 LLQAEAPRL 序列号4
PEP5 SART2-93 DYSARWNEI 序列号5
PEP6 SART3-109 VYDYNCHVDL 序列号6
PEP7 MRP3-503 LYAWEPSFL 序列号7
PEP8 Lck-488 DYLRSVLEDF 序列号8
PEP9 SART3-734 QIRPIFSNR 序列号9
PEP10 Lck-90 ILEQSGEWWK 序列号10
PEP13 UBE2V-43 RLQEWCSVI 序列号13
PEP15 EGFR-800 DYVREHKDNI 序列号15
PEP17 MRP3-I293 NYSVRYRPGL 序列号17
PEP18 PTH-102 RYLTQETNKV 序列号18
WT1 WT1-126 RMFPNAPYL 序列号20
Her2 Her2-63 TYLPTNASL 序列号21
表3
具有4个连接的表位的肽
肽 氨基酸序列 序列号
TPV01 PEP5-RR-PEP6-RR-PEP9-RR-PEP4 序列号22
TPV02 PEP9-RR-PEP5-RR-PEP6-RR-PEP4 序列号23
TPV03 PEP6-RR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP4 序列号24
TPV04 PEP6-RR-PEP9-RR-PEP5-RR-PEP4 序列号25
TPV05 PEP9-RR-PEP6-RR-PEP5-RR-PEP4 序列号26
TPV06 PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 序列号27
TPV07 PEP1-RR-PEP7-RR-PEP8-RR-PEP2 序列号28
TPV08 PEP1-RR-PEP8-RR-PEP7-RR-PEP2 序列号29
TPV09 PEP7-RR-PEP1-RR-PEP8-RR-PEP2 序列号30
TPV10 PEP8-RR-PEP7-RR-PEP1-RR-PEP2 序列号31
TPV11 PEP8-RR-PEP1-RR-PEP7-RR-PEP2 序列号32
TPV12 PEP7-RR-PEP13-RR-PEP8-RR-PEP2 序列号33
TPV13 PEP8-RR-PEP13-RR-PEP7-RR-PEP2 序列号34
TPV14 PEP13-RR-PEP7-RR-PEP8-RR-PEP2 序列号35
TPV15 PEP8-RR-PEP7-RR-PEP13-RR-PEP2 序列号36
TPV16 PEP13-RR-PEP8-RR-PEP7-RR-PEP2 序列号37
TPV17 PEP13-RR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP10 序列号38
TPV18 PEP13-RR-PEP18-RR-PEP15-RR-PEP10 序列号39
TPV19 PEP15-RR-PEP13-RR-PEP18-RR-PEP10 序列号40
TPV20 PEP15-RR-PEP18-RR-PEP13-RR-PEP10 序列号41
TPV21 PEP18-RR-PEP13-RR-PEP15-RR-PEP10 序列号42
TPV22 PEP18-RR-PEP15-RR-PEP13-RR-PEP10 序列号43
TPV23 PEP1-RR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP10 序列号44
TPV24 PEP1-RR-PEP18-RR-PEP15-RR-PEP10 序列号45
TPV25 PEP15-RR-PEP1-RR-PEP18-RR-PEP10 序列号46
TPV26 PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 序列号47
TPV27 PEP18-RR-PEP1-RR-PEP15-RR-PEP10 序列号48
TPV28 PEP18-RR-PEP15-RR-PEP1-RR-PEP10 序列号49
TPV29 PEP15-RR-PEP17-RR-PEP13-RR-PEP10 序列号50
TPV30 PEP15-RR-PEP13-RR-PEP17-RR-PEP10 序列号51
TPV31 PEP17-RR-PEP15-RR-PEP13-RR-PEP10 序列号52
TPV32 PEP17-RR-PEP13-RR-PEP15-RR-PEP10 序列号53
TPV33 PEP13-RR-PEP17-RR-PEP15-RR-PEP10 序列号54
TPV34 PEP13-RR-PEP15-RR-PEP17-RR-PEP10 序列号55
TPV35 PEP6-RR-PEP18-RR-PEP5-RR-PEP9 序列号56
TPV36 PEP6-RR-PEP5-RR-PEP18-RR-PEP9 序列号57
TPV37 PEP1-RR-PEP7-RR-PEP6-RR-PEP5 序列号58
TPV38 PEP7-RR-PEP1-RR-PEP6-RR-PEP5 序列号59
表中，“-PR-”表示精氨酸二聚体。
表4
肽 氨基酸序列 序列号
TPV39 RRR-PEP7-RR-PEPI3-RR-PEP8-RR-PEP2 序列号60
TPV40 RRRR-PEP7-RR-PEPI3-RR-PEP8-RR-PEP2 序列号61
TPV41 PEP7-RRR-PEP13-RRR-PEP8-RRR-PEP2 序列号62
TPV42 RRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 序列号63
TPV43 RRRR-PEP5-RR-PEP9-RR-PEP6-RR-PEP4 序列号64
TPV44 RRR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEP1-RR-PEP10 序列号65
TPV45 RRRR-PEP15-RR-PEP18-RR-PEPI-RR-PEP10 序列号66
“-RR-”表示精氨酸二聚体。
“-RRR-”表示精氨酸三聚体。
“RRR-”及“RRRR-”为添加至N末端的肽序列，分别表示添加3个精氨酸残基及添加4个精氨酸残基。
实施例2小鼠模型中的表位肽特异性CTL的诱导以及利用ELISPOT法的CTL的检测
将具有4个连接的表位的肽用蒸馏水(大冢制药工场)制备成2mg/mL或4mg/mL，填充于BBraunInjekt注射器。在其它注射器中填充等量的不完全弗氏佐剂(IFA)后，将两注射器用GP注射器连接器连接，通过使具有4个连接的表位的肽溶液和IFA充分混合而制备乳液。将其在小鼠(HLA-A2.1转基因的、HLA-A24转基因的(Taconic))的尾根部周围每周1次各100μL、总计施用2次。末次施用1周后，从小鼠中回收鼠腹股沟***。将***细胞悬浮液以完全培养基(RPMI-1640、10％热灭活的FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、50μM2-巯基乙醇)制备成5×106细胞/mL，分别加入靶标CTL表位肽(最终浓度10μg/mL)、重组小鼠IL-15(最终浓度100ng/mL)、重组小鼠IL-21(最终浓度100ng/mL)，以1mL/孔接种于24孔板之后，在37℃、5％CO2培养箱内培养8天。8天后，回收细胞，在包括在鼠IFN-γELISpot试剂盒(GEN-PROBE)中的抗IFN-γ抗体固定化板上以1×105细胞/孔接种。接着，将由同系小鼠脾脏制备并照射有30Gy的X射线的脾脏细胞以1×105细胞/孔接种于相同孔作为抗原递呈细胞后，加入靶标CTL表位肽、或阴性对照肽(最终浓度10μg/mL)，在37℃、5％CO2培养箱内培养一夜。第二天，按照试剂盒中包含的说明使产生IFN-γ的细胞斑点显色。产生IFN-γ的细胞斑点数用ELISPOT分析仪(ImmunospotS6,CellularTechnologyLtd.)进行定量。就CTL表位肽特异性CTL的诱导而言，通过该实验得到的靶标CTL表位肽添加孔的产生IFN-γ的细胞斑点数与阴性对照肽添加孔的产生IFN-γ的细胞斑点数相比显著地高(Student’st-test,p<0.05)的情况下，判断为阳性。予以说明，作为阴性对照肽，使用WT1或Her2。进而，为了将CTL诱导强度进行可视化，设为(靶标CTL表位肽添加孔的产生IFN-γ的细胞斑点的平均数)－(阴性对照肽添加孔的产生IFN-γ的细胞斑点的平均数)＝Δ时，将10≦Δ<100的情况作为阳性表示，将100≦Δ<200的情况作为中阳性表示，将200≦Δ的情况作为强阳性表示。
将CTL表位肽特异性CTL诱导的研究结果示于图3-1～图3-3及图3-4。如图3-1～图3-4所示，在本发明的具有4个连接的表位的肽具有选自以下的<1>～<3>中的任一个特征的情况下，显示被连接的4种CTL表位肽中的至少3种以上的CTL诱导。
<1>C末端为PEP4。
<2>C末端为PEP6和PEP5，以这样的顺序从N末端侧经由接头而邻接。
<3>含有PEP5、PEP6、PEP9和PEP18。
另外，如图3-4所示，即使在N末端进一步添加由精氨酸构成的肽序列的情况下，另外即使肽之间的接头为精氨酸三聚体，也与上述同样地，显示良好的CTL诱导。
另一方面，如图3-1～图3-3所示，在CPV01～CPV16那样的连接顺序的4连接体中，不显示3种以上的CTL诱导。
即，即使为由选自特定的13种(PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18)中的4种CTL表位肽构成的具有4个连接的表位的肽(CPV14、CPV15及CPV16)，也不显示被连接的4种CTL表位肽中的3种以上的CTL诱导。
实施例3利用人20S免疫蛋白酶体(i20S)的肽切割位置的推定
通过以下的步骤制备具有4个连接的表位的肽的切割样品。即，将具有4个连接的表位的肽用反应缓冲液(20mMHEPES-KOH、pH7.8、2mMMgAc2、2mM二硫苏糖醇)稀释成66.7μg/mL，在反应管中以成为300μL/管的方式分配。在此，以2μg/管添加人20S免疫蛋白酶体(R&Dsystems)并搅拌后，在振荡条件下，在37℃下培养1、2、4小时。经过培养时间后，加入30μL/管的乙酸，由此使酶反应停止，在－80℃冰箱中迅速地将样品冷冻保存。
接着，对得到的具有4个连接的表位的肽的切割样品，使用LC/MS-MS***(AcquityUPLC***(waters社制)、SynaptG2HDMS(waters社制))***地测定肽片段的分子量，使用分析软件(MassLynx,ver4.1,SCN712，waters社制)进行分析和肽片段的鉴定。就评价而言，利用免疫蛋白酶体的切割的结果，在表位肽本身被切割的肽、在表位肽的N末端添加有精氨酸的肽、以及在表位肽的N末端添加有精氨酸二聚体的肽的任一种出现的情况下，判断为可以切出。
图3-1～图3-4所示的使用免疫蛋白酶体的分析的结果显示：只要PEP2、PEP10的2种CTL表位肽分别不位于具有4个连接的表位的肽的最C末端，则不能确定所期待的CTL表位肽的C末端氨基酸。因此，本发明的具有4个连接的CTL表位的肽优选在肽的C末端连接PEP2或PEP10。
实施例4CTL表位肽固定化的珠的制备
按以下的步骤将肽固定化在xMAPMulti-AnalyteCOOHMicrospheres(Luminexcorporation、以下称为珠)上。用MES缓冲液(0.1MMES-NaOH,pH7.0)清洗珠之后，通过离心分离除去上清液。将其重复两次之后，将珠悬浮在75μL的MES缓冲液中。此时，加入制备的1mg/mL的CTL表位肽溶液100μL，进一步加入10mg/mLEDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)5μL并充分混合之后，在30℃、暗处反应一夜。第二天，通过离心分离而除去上清液之后，加入1MTris-HCl125μL，在30℃、暗处孵育30分钟。除去上清液后，用漂洗缓冲液(PBS(-),0.05％Tween20)清洗两次，其后悬浮于免疫封闭剂(DSPharmaBiomedical)，由此完成CTL表位肽的固定化。
实施例5CTL表位特异的IgG抗体滴度测定
用蒸馏水(大冢制药工场)以2mg/mL制备本发明的具有4个连接的表位的肽，填充于BBraunInjekt注射器。在其它注射器中填充等量的IFA之后，将两注射器用GP注射器连接器连接，使该具有4个连接的表位的肽溶液和IFA充分混合，由此制备乳液。将其在CBF1小鼠(C57BL/6×Balb/cF1)尾根部周围每周1次各100μL、总计施用3次。末次施用1周后，从小鼠采血，得到血清样品。作为对照组，使用选自PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15或PEP18中的4种肽混合物(各1mg/mL)制备乳液，按与具有4个连接的表位的肽相同的日程进行施用(混合物施用组)。
在96孔过滤板中分配以免疫封闭剂稀释的CTL表位肽固定化的珠，用漂洗缓冲液清洗后，以100μL/孔添加用免疫封闭剂稀释了200倍的小鼠血清样品。将板在30℃培养箱中以600rpm搅拌，培养90分钟。用漂洗缓冲液清洗3次后，以100μL/孔添加用免疫封闭剂稀释了500倍的生物素化的抗小鼠IgG(H+L)(Vector实验室)，在30℃、600rpm搅拌条件下培养60分钟。用漂洗缓冲液清洗3次后，以100μL/孔添加用免疫封闭剂稀释了500倍的链霉亲和素-R-藻红蛋白结合物(Invitrogen)，在30℃、600rpm搅拌条件下培养30分钟。用漂洗缓冲液清洗3次后，以100μL/孔添加漂洗缓冲液并将珠悬浮后，用Bio-PlexSuspensionArraySystem(BIO-RAD)测定各珠特异性结合的PE色素的平均荧光强度。
CTL表位特异性IgG抗体滴度测定结果如图4-1～图4-3所示。予以说明，图4-1～图4-3中表示：与制备将IFA和蒸馏水(大冢制药工场)进行了等量混合的乳液、按与CTL表位肽混合物(混合物)或具有4个连接的表位的肽相同的日程施用于小鼠的阴性对照组(以下，简称为IFA组)的血清中CTL表位特异性IgG抗体滴度测定结果相比，诱导了几倍的该IgG抗体的产生。
如图4-1～图4-3所示，在混合物施用组中，CTL表位特异性IgG抗体产生诱导强度低，且频率也低。另一方面，判明：在施用具有4个连接的表位的肽的情况下，以高频率观察到强的CTL表位特异性IgG抗体的产生诱导，进而该IgG产生量通过所施用的具有4个连接的表位的肽而显著地诱导为IFA组的数十倍至数百倍以上。
以上的结果显示：与将构成该具有4个连接的表位的肽的CTL表位肽进行混合而施用相比，通过施用具有4个连接的表位的肽将抗肿瘤免疫较强地激活。
接受了癌症肽疫苗治疗的癌症患者中的CTL表位肽特异性IgG产生的诱导与表位肽特异性CTL的诱导都有助于延长寿命的效果。因此，本发明与由已知的CTL表位肽或其混合物构成的癌症肽疫苗疗法相比，可以产生优异的延长寿命的效果。因此，本发明的具有4个连接的表位的肽可以作为癌症或起因于癌症的疾病的治疗剂和/或预防剂、癌症肽疫苗优选使用，其与由已知的CTL表位肽或其混合物构成的癌症肽疫苗疗法相比，可以提高治疗成绩。
将本说明书中所引用的全部的刊行物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (14)

1.一种具有4个连接的表位的肽，其为从由以下的CTL表位肽：序列号1所示的肽“PEP1”、序列号2所示的肽“PEP2”、序列号4所示的肽“PEP4”、序列号5所示的肽“PEP5”、序列号6所示的肽“PEP6”、序列号7所示的肽“PEP7”、序列号8所示的肽“PEP8”、序列号9所示的肽“PEP9”、序列号10所示的肽“PEP10”、序列号13所示的肽“PEP13”、序列号15所示的肽“PEP15”、序列号17所示的肽“PEP17”、及序列号18所示的肽“PEP18”构成的组中可以重复地选择的4个肽经由接头分别连接而成，可以具有由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列，其中，
所述具有4个连接的表位的肽具有选自以下的(1)～(5)中的任一个特征：
(1)C末端为PEP2，其中，不包括N末端为PEP7和PEP8、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接的肽；
(2)C末端为PEP4；
(3)C末端为PEP10；
(4)C末端为PEP6和PEP5，以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接；
(5)含有PEP5、PEP6、PEP9和PEP18。
2.根据权利要求1所述的具有4个连接的表位的肽，其是选自PEP1、PEP2、PEP4、PEP5、PEP6、PEP7、PEP8、PEP9、PEP10、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18中的不重复的4个肽经由接头分别连接而成的。
3.根据权利要求1或2所述的具有4个连接的表位的肽，其具有选自以下的(1)～(5)中的任一个特征：
(1)含有选自PEP1、PEP7、PEP8和PEP13中的3个CTL表位肽，且C末端为PEP2，其中，不包括N末端为PEP7和PEP8、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接的肽；
(2)含有PEP5、PEP6和PEP9的3个CTL表位肽，且C末端为PEP4；
(3)含有选自PEP1、PEP13、PEP15、PEP17和PEP18中的3个CTL表位肽，且C末端为PEP10；
(4)含有PEP1和PEP7的2个CTL表位肽，且C末端为PEP6和PEP5、以这样的顺序从N末端侧经由接头而彼此邻接；
(5)含有PEP5、PEP6和PEP18的3个CTL表位肽，且C末端为PEP9。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其含有选自以下的序列：
·PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
·PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
·PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4；
·PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
·PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4；
·PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4；
·PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2；
·PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2；
·PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2；
·PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10；
·PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10；
·PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10；
·PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10；
·PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9；
·PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9；
·PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5；或
·PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5，
式中，“-(L)-”表示接头。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，所述接头为氨基酸接头。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，所述氨基酸接头为连接2个或3个精氨酸的精氨酸二聚体或精氨酸三聚体。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列连接于N末端。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其中，由亲水性氨基酸构成的另一种肽序列包含连接3个精氨酸的精氨酸三聚体或连接4个精氨酸的精氨酸四聚体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的具有4个连接的表位的肽，其包含序列号22、序列号23、序列号24、序列号25、序列号26、序列号27、序列号28、序列号29、序列号30、序列号31、序列号32、序列号33、序列号34、序列号35、序列号36、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号43、序列号44、序列号45、序列号46、序列号47、序列号48、序列号49、序列号50、序列号51、序列号52、序列号53、序列号54、序列号55、序列号56、序列号57、序列号58、序列号59、序列号60、序列号61、序列号62、序列号63、序列号64、序列号65、或序列号66所示的氨基酸序列。
10.一种CTL，其通过使用根据权利要求1～9中任一项所述的具有4个连接的表位的肽刺激外周血淋巴细胞而得到。
11.一种药物组合物，其含有根据权利要求1～9中任一项所述的具有4个连接的表位的肽、或根据权利要求10所述的CTL作为有效成分。
12.一种药物组合物，其含有2种以上的根据权利要求1～9中任一项所述的具有4个连接的表位的肽。
13.根据权利要求11或12所述的药物组合物，其为免疫治疗剂。
14.一种癌症的治疗方法，其包括：将根据权利要求1～9中任一项所述的具有4个连接的表位的肽、根据权利要求10所述的CTL、或根据权利要求11～13中任一项所述的药物组合物施用于癌症患者。
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