CN1056580A

CN1056580A - 测定热原含量的方法

Info

Publication number: CN1056580A
Application number: CN91103188A
Authority: CN
Inventors: 土佐哲也; 佐藤忠司; 渡边泰三; 美浓部敏; 绳田雅裕; 永松信二
Original assignee: Carrying Searle Chemical Industries Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Carrying Searle Chemical Industries Ltd; Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1991-05-11
Publication date: 1991-11-27
Also published as: DK0456252T3; EP0456252A2; EP0456252B1; ATE137333T1; DE69118959T2; KR910020426A; ES2089053T3; GR3019761T3; JPH0472571A; EP0456252A3; CA2041505A1; DE69118959D1

Abstract

本发明披露了一种用离心式过滤装置进行离心过滤测定热原含量的方法。将试样与在过滤装置中的具有热原吸附能力的吸附剂相接触，将未被吸附的物质经离心分离而去除，从而使热原被吸附剂特异性地吸附，然后将吸附在吸附剂上的热原和检测试剂反应以测定热原含量。

Description

本发明述及测定热原含量的方法。更明确地说，它述及测定热原含量的方法，其具有良好的灵敏度及操作特性，可用于因有干扰物质等而至今为止很难测定的试样。

热原是一种能致热的物质，少量这种物质能使恒温动物的体温不正常地增高。当热原进入人体后，例如静脉注射含有热原污染的药物，这时除了药物的主要效果外，热原可导致发高烧。当热原的作用严重时，能导致发高烧，伴有发冷发抖，有时还会因休克造成死亡。很多物质如细菌性物质，炎症物质，植物多糖，血液类物质等都可成为热原。它们中间，细菌性物质对发烧影响最大，而被称为细菌毒素，一般来说，细菌毒素可分类为外毒素和内毒素。特别是一种称作O-抗原的内毒素，它的主要组分是革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（LPS）具最强的致热性。

因此，测定热原含量就很重要，如在制造药物时可以此来避免热原的污染。

作为测定热原含量的方法，已知的有家兔发热试验，或使用鲎血细胞萃取物的鲎试验。特别是鲎试验由于方法灵敏、简单及定量性质等而经常采用。

但鲎试验很易受测定***中很多物质的干扰或活化，因此须进行复杂的预处理，或有时很难根据一个试样来测定热原含量。此外，有些不是热原的物质亦对鲎试验呈阳性反应，它们干扰了对热原含量的精确测定。要解决这问题，需用高纯度的试剂，但这些试剂的价格就很高昂。此外，在溶解度很小的物质中测定极少量热原是极困难的。

最近为了测定内毒素（它是一种热原），提出一种方法即采用以酸处理的不含热原的活性炭，使与试样接触，然后将活性炭与鲎细胞溶解产物反应，这样作鲎试验比前方便快速（日本专利公布号152425/1981）但此方法从特异性，灵敏度及定量测定热原等方面来看，仍不能满意。以后美国专利4，491，660揭示了用一种某高分子化合物吸附内毒素，用以富集及检测内毒素。但从特异性，灵敏度及定量性质等来看，仍不能令人满意。

本发明者作了深入研究，以发展一种具有很好特异性、灵敏度，及定量性质的测定热原的方法。结果发现使用了一种对热原有吸附性的吸附剂及一个离心式过滤装置，以鲎法测定热原可很简单地进行，且具有很高特异性及灵敏度，甚至可在很多干扰物质或其他对鲎试验呈阳性的物质存在时也能测定，而且使用了某种固体吸附剂，实现了一种定量测定热原的方法，它能解决通常采用活性炭吸收剂等时存在的问题。

当然，本发明的主要目的是提供了一个测定热原含量的方法，该方法具有高度特异性，灵敏度及能定量测定热原，可用于测定过去因有干扰物质等很难用通常的鲎试验测定的试样。

本发明的此目的及其他目的和优点，在下述内容及参考附图中，有经验的人员可很清楚地了解。

图1至图3是用于本发明中离心式过滤装置的剖面图。

图4至图8是用于本发明方法的标准曲线实例。

按照本发明，测定热原含量的方法具有离心式过滤装置进行离心过滤，有一滤液杯及一试样杯，试样杯置于滤液杯开口处，可以取下，此试样杯与滤液杯间有过滤膜。将试样与能吸收热原的吸附剂置于试样杯内，不被吸附的物质在加速渗透条件下经过过滤膜进入滤液杯而被去除，然后留在试样杯中吸附在吸附剂上的热原与检测试剂反应，以测定热原含量，下文中称此为过滤装置法。

本发明也提供下列测定热原含量的方法，即使试样溶液中的热原与特异性吸附剂相接触，然后经固相与液相分离，将吸附剂与检测试剂反应以测定热原含量。下文中此法称为PS法。

在过滤装置法中，渗透一般是以离心力作为驱动力进行加速（离心过滤）、加速渗透还可采用其他方法如压力法（如加压过滤，诚压过滤等）。此外当试样溶液在疏水薄膜上与吸附剂接触时，也可采用加入醇类进行加速渗透。因此文中所谓“在加速经过过滤膜的条件下”是意味着这些操作。

文中如“离心式过滤装置进行离心过滤，有一滤液杯及一试样杯，试样杯置于滤液杯开口处，可以取下”，仅仅意味着这方法适用于离心法，但本发明并不限于离心法。其他不是离心过滤的过滤方法在本发明中也可采用。

甚至不用过滤装置，测定热原含量也能进行。但使用了过滤装置后，不被吸附的物质可更容易，更快，更完全，及更精确地被去除，和检测试剂如鲎试剂的反应在试样杯中同时发生。这样与不采用过滤装置的测定方法比较，就大大改善了测定的操作性能及精确性。

本发明中的离心式过滤装置具有一滤液杯及一试样杯，试样杯置于滤液杯开口处，以适当方法固定，如密接，夹紧，螺旋等。试样杯与滤液杯靠滤膜连通。滤液杯及试样杯的形状与尺寸并无特殊规定，只要它们的制造材料不影响热原含量的测定，如可采用玻璃，合成树脂，及金属等。

离心式过滤装置上使用的过滤膜在正常情况下可将溶液保持在试样杯内，进行离心分离时，溶液透过过滤膜进入滤液杯内。一般情况下，可采用超滤膜（UF膜）。但是，本发明并不限于使用超滤膜，任何一种具有上述功能的膜都可使用，如一种疏水性微孔滤膜（MF膜）也能使用。如使用超滤膜，分子量切取范围以选用10，000至3，000，000为宜。如切取分子量太小，过滤速度很慢。如切取分子量太大，溶液将会渗漏。膜的材质并不严格限制，只要不干扰热原含量的测定。例如，超滤膜的材料可采用纤维素、醋酸纤维素、三醋酸纤维素、多电解质共轭纤维、聚砜、乙烯/丙烯共聚物、聚醚砜等。

作为MF膜，可选用例如孔径为0.01至10微米的膜，膜的材料并不严格规定，只要不干扰热原含量的测定，例如MF膜的材料可采用聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯等，这些膜也可采用双层膜，与疏水性的膜如聚丙烯等联用。

图1至图3是本发明中采用的离心式过滤装置的剖面图。

图1中的装置有滤液杯（1）及试样杯（2）。试样杯置于滤液杯的开口处，并予以固定。在试样杯（2）底部有过滤膜（3），在离心分离时试样溶液经过过滤膜（3）进入过滤杯内，试样杯（2）上有盖（4）。图2中的过滤装置基本上与图1同，但在试样杯（2）底部的过滤膜（3）是倾斜的，图3中的过滤装置基本上与图1同，但试样杯（2）的底部被挤压伸长，而过滤膜（3）放在垂直于轴的方向。这些离心式过滤装置有市售，其商业名称为ULTRAFREE-CL（日本微孔公司出售），ULTRACENT（日本Toso Kabushiki Kaisha制造），CENTRICUT（日本Kurabo制造）等。

在过滤装置法中，采用的吸附剂须能从试样中选择性地吸附热原，而不吸附试样中其他共存物质，后文所述的吸附剂是优先采用的吸附剂代表性实例。本发明的范围并不局限于这些吸附剂，在这领域的有经验人员可寻得适用于过滤装置的其他吸附剂。

这些吸附剂的实例包括在日本专利公布号183412/1982中所披露的品种，这些吸附剂是由含氮环状化合物直接地或通过间隔物连接在水不溶性载体而组成的（基质）。后文中称之为“杂环吸附剂”。

杂环吸附剂中的含氮杂环化合物，得以下列分子结构表示

R-A-X

式中R为有氮原子的杂环，A为单键，亚烷基或亚链烯基;当A为单键时，X为氢原子或一官能团，或当A为亚烷基或亚链烯基时，X为一官能团;杂环部分及亚烷基可被一个或多个取代基取代，

水不溶性载体是具有羟基、氨基、羧基或卤原子的物质，

间隔物为具有如下分子式的化合物：

NH₂（CH₂）_nNH₂

NH₂（CH₂）_nCOOH

NH₂（CH₂）_nOH，或

HOOC（CH₂）_nCOOH

此处n可为1-12的整数。

含氮杂环的分子结构中的R可包括例如，咪唑环，吡唑环，嘧啶环，哒嗪环，吡嗪环，嘌呤环，吖啶环，***环，噁二唑环，四唑环，吲唑环，苯并***环，苯并哒唑环，苯并嘧啶环，苯并吡嗪环，亚萘基环等。A为单键，X为氢原子或官能团如氨基，羟基，羧基或类似基团，或A为具有1-12个碳原子的亚烷基如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚己基、亚辛基、亚葵基、或亚十二烷基，或具有2-12碳原子的亚链烯基，如1，2-亚乙烯基，亚丙烯基、亚丁烯基、亚己烯基、或亚辛基及X为官能团如氨基，羟基、羧基或类似基团。含氮杂环R及亚烷基A可选择性地以一个或多个基团予以取代（如羧基、桥氧基、C_1-6烷基、羟基、氨基，C_1-6烷氧基等）。优先采用的含氮杂环化合物例子是如分子式（Ⅰ）表示的化合物，其中R为含氮杂环，如咪唑环，嘧啶环，嘌呤环或吖啶环，A为单键、亚乙基或被羧基取代的亚乙基，X为氨基，羧基或羟基。

在本发明中任何不溶于水的载体如能直接或通过间隔物与含氮杂环化合物相结合的都能使用。有代表性的这些不溶于水的载体包括那些具有羟基、氨基、羧基或卤族原子的物质，优先推荐的这些不溶于水的带有羟基的载体，是多糖类，如纤维素、琼脂糖，交联葡聚糖等，带羟基的聚苯乙烯树脂（例如带有烃烷基的苯乙烯和二乙烯共聚物等），聚乙烯醇等。带氨基的水不溶性载体的实例为氨烷基化的多糖类（例如氨烷基化纤维素如氨乙基纤维素或氨己基纤维素，氨烷基化琼脂糖如氨己基琼脂糖，对-氨基苄基纤维素，对-氨基苄基-琼脂糖等），聚氨基葡糖，氨烷基化的聚苯乙烯树脂（例如，氨烷基化的苯乙烯-二乙烯苯共聚物等），聚丙烯酰胺，氨烷基聚丙烯酰胺（如氨乙基聚丙烯酰胺等），氨烷基化的多孔玻璃（如氨丙基多孔玻璃等）等等。带有羧基的不溶于水的载体，其例子有带羧基的多糖（例如羧烷基琼脂糖，如羧己基琼脂糖或羧戊基琼脂糖，羧烷基纤维素如羧甲基纤维素，带羧基的交联葡聚糖，如羧甲基交联葡聚糖等），羧烷基聚丙烯酰胺（例如羧甲基聚丙烯酰胺等），羧酸树脂（如丙烯酸-二乙烯苯共聚物等）等等。带有卤族原子的水不溶性载体，其例子有卤烷基聚苯乙烯树脂（如氯甲基苯乙烯-二乙烯苯共聚物）等等。

本发明中优先推荐使用的上述杂环吸附剂，是用至少一个化合物，或单氧环化合物（如氯甲基环氧丙烷），或一个脂族二醛（如戊二醛）将含氮杂环化合物（Ⅰ）如组氨酸、组胺、咪唑丙烯酸、尿嘧啶、乳清酸、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、2-氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶、腺嘌呤、或6，9-二氨基-2-羟乙基-吖啶与不溶于水的多糖通过亚烷基二胺作为间隔物连接起来。

此外，在本发明中，除上述杂环吸附剂外的吸附剂也可使用，这种吸附剂包括一种固体吸附剂，由脂肪族含氮化合物直接或通过间隔物连接于基质上而组成（下文称此为脂肪族型吸附剂）。这也是一种吸附剂的实例。

构成这种脂肪族型吸附剂的化合物，没有含氮杂环，也不带芳香氨基，只含脂肪族氮原子，通常此化合物有一个3-50个原子，一般是3-30个原子，组成的功能键，或链原子数（链长）是以构成最长连续链段的碳原子数计算，例如在CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₆NH₂的功能链中，链长是中间链（取代的亚丙基）（3）及二氨基亚己基（8）之和，即11。氮原子、氧原子（醚）及硫原子（硫醚）是作为除了碳原子外的成链原子来计算的。

氮原子须连接在脂肪链的碳原子上，如亚甲基碳原子。作为在脂肪链上的氮原子，可为伯胺基，仲胺基，叔胺基，季铵盐，亚氨基或类似基团，其中伯胺基（NH₂）及仲胺基（NH）更是优先推荐的。脂肪族链上的氮原子可以是化合物中间链上的原子，也可以是在终端上的原子。另外，一个戊烷氮原子也可以直接或通过其他脂肪碳原子连接到中间原子上。作为功能键，具有伯胺基或仲胺基的脂肪族链上的氮原子，及与氮原子相邻的有三个或更多碳原子碳链为最佳。如上述举例所示的功能链，亚己基（及有羟基取代的亚丙基）是与两个脂肪族链上的氮原子相邻。

功能链的例子见下述A至D

脂肪链A：-CH₂CH（OH）CH₂NHR¹

R¹的例子包括氢原子及下述基团（括号内的化合物是相应于R¹基团的R¹NH₂或R¹OH）。

（CH₂）_nNH₂（N＝1至12）[亚烷基二胺]

COCH（NH₂）（CH₂）₄NH₂[赖氨酸]

COCH（NH₂）（CH₂）₃HN₂[鸟氨酸]

脂肪链B：-CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₅NHR²

R²的例子为（CH₂）_nNH₂（n＝1至12）

（CH₂）_nNHC（＝NH）₂（n＝1至12）

脂肪链C：-CH₂CH（OH）CH₂）NHCOCH₂CH₂NHR³

R³的例子为（CH₂）_nNH₂（n为1至12）

（CH₂）_nNHC（＝NH）₂（n为1至12）

脂肪链D：-CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₆NHR⁴

R⁴的例子为C（＝NH）NH₂，COCH（NH₂）（CH₂）₄NH₂，

（CH₂）_nNH₂（n为1至12）

吸附剂的基质一般为多孔性物质，下文所述主要是指多孔性基质。但基质并不因此而受限制，任何基质具有吸附性能可用于定量分析的都可使用。

多孔基体的孔径以50nm至1μm为最佳。基质具有能直接或间接地固定带有氮原子脂肪链的结构。其例子包括有活性部位（如活性氢）的物质，其活性部位能与如羟基，氨基，或其他官能团和其它物质进行反应。

这些基质的例子与不溶于水的杂环型吸附剂载体相似，推荐的例子包括多糖类（包括其衍生物，如氨烷基多糖类，烷羧基多糖类等，多糖类如纤维素，交联葡聚糖，聚氨基葡糖等），有机合成聚合物（如聚丙烯腈，聚砜，聚酰胺，聚乙烯醇，聚苯乙烯，聚丙烯酸，带烷胺基或卤烷基的聚苯乙烯，聚丙烯酰胺等）及无机聚合物（如硅胶，氧化铝，氨丙基多孔玻璃，各种陶瓷等）。此外，按通常方法适当地将能用于连接脂肪链的羟基，氨基等引入到上述多孔材料中而得到的物质也能用作基质。

制造脂肪链型吸附剂时，将带有氮原子的脂肪链，用共价键、离子链、疏水键，配位键等直接地或通过间隔物连接于上述多孔基质。例如可用日本专利公布号183712/1982所述的方法制备脂肪族型吸附剂，即用环氧化合物如氯甲基环氧丙烷等来活化多孔基质如纤维素等，然后再与带有氨基，羟基，硫醇基，羧基等的脂肪链相结合，或活化基质，引入间隔物后，再与带有氨基，羟基，醛基，硫醇基等的脂肪链进行反应。

上述得的多孔吸附剂中，最被推荐的吸附剂是采用多糖类如纤维素等作为基质，正如脂肪链为如上结构-CH₂CH（OH）CH₂NHR¹或-CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₅NHR¹，孔径为100至500nm。

过滤装置法是先将试样在过滤装置的试样杯内与吸附剂接触，不被吸附的物质经离心分离后进入滤液杯内，也可再对试样杯内的吸附剂进行洗涤及再离心分离，将洗液转入滤液杯内，滤液杯内的溶液是不含热原的物质，可将其弃去。然后将已吸附热原的吸附剂在试样杯内与检测试剂，例如鲎试剂进行反应以测定热原的含量。

正常情况下，热原含量的测定可快速、简便、精确地进行。在完成鲎反应后，将反应液与吸附剂进行离心分离并转入滤液杯，然后进行定量测定。

下文，将详述定量测定的操作

在本发明的方法中，试样须是溶液，如水溶液或含水的溶液，但最好是水溶液。由于本发明中使用的吸附剂不吸附干扰鲎试验测定的物质，如氨基酸（如L-半胱氨酸等），抗生素（如青霉素G，链霉素等），蛋白质变性剂（如尿素等），丝氨酸蛋白酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸等），糖类（如葡萄糖等），糖醇，氯化钠，Ringer氏溶液等，也不吸附对鲎试验呈阳性的非热原物质，如葡聚糖，（1-3）-β-D-葡聚糖等，因此本发明的方法可用于测定存在上述物质的试样，这在以前是难以测定热原含量的。此外，按照本发明，在蛋白质溶液、血浆或血清中所含的内毒素也能进行测定。

吸附操作在试样杯内进行，操作条件随不同试样而异。正常情况下，热原能特异性地及有效地吸附，每毫升试样使用吸附剂量为3至270毫克，最好为7-180毫克，温度为4-40℃，pH为4-8，最好为6-7，离子强度不大于0.2。在此条件下吸附15分钟或更长时间，试样中的热原几乎全被吸附，热原在吸附剂内被富集。在完成吸附后，也可进行再吸附，以提高测定灵敏度。

按照已知的方法将吸附了热原的吸附剂与试样液分离，再以不含热原的水清洗，或不含热原的缓冲溶液等清洗以除去不是热原的物质。

在本发明中，如此清洗过的吸附剂，可直接进行鲎试验。

一般鲎试验可分为合成底物法及胶凝法两种。合成底物法按照不同底物又可分为比色法及萤光法。在本发明中任何方法都能使用。例如吸附着热原的吸附剂与鲎细胞溶解产物和具有发色团或发萤光基团的底物在25-40℃，一般为37℃，反应10-20分钟。反应完毕后，将反应混合物进行比色或萤光测定，然后按照标准曲线，测出热原的含量。标准曲线是按照上述方法在相同条件下制作的。

合成底物并不严格规定，而是按照化学反应的类型来选择。

使用比色法时，可用合成底物如

Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA或Boc-Leu-Gly-Arg-pNA（式中Ac是乙酰基，Boc是叔丁氧羰基，pNA为对硝基苯胺），吸光度是在405nm波长下测定。使用萤光测定法时，可用合成底物如Boc-Leu-Gly-Ala-MCA（Boc如前所述，MCA为7-氨基-4-甲基香豆素）在激发波长380nm及萤光波长460nm下进行萤光测定。

使用胶凝法时，将鲎细胞溶解产物加至已吸附热原的吸附剂中，反应立刻开始，或在低温下反应开始不久时将吸附剂除去，然后再在25-40℃，一般在37℃继续反应10-120分钟。由于胶凝作用，反应溶液的浓度随时间测定，试样中热原的含量可从标准曲线上得出，标准曲线是按照上述方法在相同条件下制备的。

上文都是以鲎试验作为检测试剂的。但是，按照试样品种的特点，也可采用其他检测试剂来进行定量测定。在本发明中热原的浓缩以及将热原和干扰物质或对检测显阳性的其他物质进行分离，可采用对热原有吸附性的吸附剂，因此在某些情况下，不再需要与鲎试验相同效果的检测试剂。

本发明中使用的吸附剂可用日本专利公布号183712/1982提供的方法进行制造。

PS法的详细叙述如下文

按照PS法，测定热原含量可将试样溶液与固体吸附剂（脂肪族型吸附剂接触。此吸附剂是由含氮脂肪族化合物直接或通过间隔物与基质连接，经固体与液体分离后，将固体吸附剂与热原检测试剂反应。

关于脂肪族型吸附剂已在前述过滤装置法时作了说明。此脂肪族型吸附剂与试样溶液接触后能选择性地吸附热原，经固体与液体分离后（包括清洗步骤），热原与试样溶液中其他物质加以分离。

固体吸附剂与热原检测试剂反应，以检测热原的含量。在这里，采用了鲎浊度法。在很短时间内（10秒钟以内）由于固体吸附剂的沉淀，在上层出现清液。经过试管的光通量仍不中断，因此在固体吸附剂不从试样溶液中分离出的情况下仍能测定凝结时间。因此，使用一个具有合适选择吸附性及沉降特性的吸附剂，并在试样溶液中将热原与其他干扰物质等分离，可以实施一个特异性地，灵敏地，定量测定热原含量的方法。用胶凝法进行测定，虽然也有已知的转化方法，但还是采用具有良好定量性质的比浊技术为宜。

使用PS法时，上述过滤装置也可使用。使用过滤装置后，固体与液体分离（包括清洗步骤）的良好操作特性，也能用于PS法。

按照本发明，鲎试验法的灵敏度可大大改进，甚至含有干扰物质的试样，这在以前很难进行测定，而现在能很好地测定其热原含量。此外，即使试样中含有某些除热原以外的对鲎试验阳性的物质，分离和测定热原都能容易地及精确地进行。而且，它又可能采用更价廉的试剂来代替鲎试剂。因此本发明的测定热原含量的方法可用于检查药品等生产步骤。

下述的实施例及参照例进一步具体地说明本发明的内容，但并不意味着它将限制本发明的范围。

实施例1

标准曲线的制备

在不含热原的水（2毫升）中，加入已知量的内毒素EC-5（食物及药品管理局（FDA）的参比内毒素）以制备EC-5的水溶液（EC-5浓度分别为0，0.05，0.10或0.20EU/ml，式中EU是内毒素单位）

将此溶液置于离心式过滤装置的试样杯内如图1，在试样杯内加入如参考例1（见后）所述制备的吸附剂在水中的悬浮物，其量为0.3克（湿重）吸附剂/毫升，100微升，以圆形旋混器在50r.p.m，20-25℃下搅拌60分钟，然后将混合物以2，300G离心分离15分钟，取下滤液杯，将滤液倾去，将滤液杯复位，加入25mM NaCl溶液0.5毫升于试样杯中，再离心分离10分钟。再将滤液杯内滤液倾去，将滤液杯复位。在试样杯内加入不含热原的水2毫升，混合物再离心分离25分钟，再将滤液杯中滤液倾去。

然后在试样杯内加入Wako公司的鲎试验用鲎变形细胞溶解物[溶解1小瓶（0.2毫升，灵敏度：FDA参比内毒素浓度胶凝状态下为0.1毫微克/毫升）。（Wako公司的鲎试验是由日本Wako纯化学工业有限公司制造），加至0.4M Tris-盐酸化合物缓冲液（pH8.0，1.5毫升）内含0.04M氯化镁]（50微升），温度为4℃，溶液以旋混器轻轻搅拌。加入加热到70℃的0.6mM Boc-Leu-Gly-Arg-MCA水溶液（200微升）作为底物溶液。混合物轻轻搅拌后，在37℃反应25-30分钟。反应完全后，加入12.5%乙酸水溶液（2.3毫升）以终止反应，然后装上滤液杯，将混合物于2，300G离心分离30分钟。

然后进行萤光测定，激发波长为380nm，萤光波长为460nm。

试验结果见表1。

表1

试验号内毒素浓度（EU/ml）相对强度（RI）

1 0.0 18.8

2 0.0 19.9

3 0.05 47.1

4 0.05 53.9

5 0.10 65.2

6 0.10 78.8

7 0.20 125.7

8 0.20 113.4

将试验数据绘制成曲线，纵座标为萤光测定相对强度（RI），横座标为LPS浓度，得出标准曲线如图4。

从图4得知，曲线的线性关系良好。

实施例2

标准曲线的制备

在不含热原的水中（2毫升）加入已知量的LPS从大肠杆菌O128：B12取得）以制备LPS水溶液（LPS的浓度为0、5、10、15或20pg/ml），如实施例1同样方式测定LPS溶液中LPS浓度，结果见图5，曲线的线性关系亦很好。

实施例3

苯丙氨酸中内毒素的测定

在2%不含内毒素的L-苯丙氨酸水溶液中加入内毒素EC-5（0.1EU/ml），然后用实施例1得到的标准曲线，测定内毒素含量，按照实施例1的方式重复试验二次。在对不吸附物质进行离心后将吸附剂顺次以0.02M NaCl（2毫升）及水（2毫升）进行清洗。

测定结果的平均值为0.114EU/ml，（回收率为114%）。

另一方面，在上述含有EC-5的2%L-苯丙氨酸溶液以具有胶凝灵敏度0.03EU/ml的鲎试剂（试剂A）或具有0.14EU/ml的鲎试剂（试剂B）进行测定。作为阴性对照，采用了不含内毒素的蒸馏水。作为阳性对照，在使用试剂A时，EC-5水溶液中EC-5浓度为0.033EU/ml，在使用试剂B时;EC-5水溶液中EC-5浓度为0.167EU/ml。试验结果两种试剂对阴性对照都得出负的结果，对阳性对照都得出正的结果。在苯丙氨酸溶液内检测不出内毒素。

实施例4

氨基酸营养液中内毒素的测定

在不含内毒素的氨基酸营养液中（Amizet 10，日本Tanabe Seiyaku有限公司制造）加入EC-5（0.2EU/ml），将混合物以不含内毒素的水稀释4倍。如实施例3所述相同情况测定内毒素，平均测定结果为0.066EU/ml（回收率为132%）。

另一方面，按照实施例3所述相同方法使用试剂A及试剂B测定内毒素含量，阳性对照及阴性对照也与实施例3同，但加入内毒素的氨基酸营养液在使用试剂A时稀释了6倍，在使用试剂B时不加稀释。试验结果是在氨基酸营养液中检测不出内毒素。

实施例5

青霉素G中内毒素的测定

在不含内毒素的青霉素G钾盐溶液（50000单位/毫升）中加入EC-5内毒素（0.5EU/ml），将混合物以不含内毒素的水稀释10倍，按照实施例3所述，以相同方式测定内毒素含量，平均测定结果为0.062EU/ml（回收率：124%）。

另一方面，除了加入内毒素的青霉素G钾盐溶液在使用试剂A时稀释15倍，在使用B时稀释3倍之外，按照实施例3同样的方式，用试剂A、试剂B、阴性对照和阳性对照对内毒素含量进行测定。结果，虽然在用试剂B时能测出青霉素G钾水溶液中的内毒素含量，但在使用试剂A时却不能测出。

实施例6

标准曲线的制备

在不含有热原的水中（100μl）加入已知量的内毒素EC-5，制备EC-5水溶液（EC-5）浓度分别为0、0.2、0.4、0.8或1.6EU/ml）。

将此溶液（100μl）与按照后述的参照例1制备的吸附剂的10%悬浮物（pH6.0μ＝0.02，900μl）混合，将混合物置于离心式过滤装置中（如图1），其中以MF膜（聚亚乙烯基二氟化物）和疏水膜（聚丙烯）组成的双层膜作为滤膜，在室温下用园形旋混器搅拌（50r.p.m）15分钟。再于1700G离心分离5分钟，将滤液杯内的滤液弃去，将滤液杯复位，在试样杯内加入不含内毒素的0.02M NaCl溶液（1ml）以旋混器搅拌20秒钟，再离心（1700G）分离5分钟。将滤液杯内滤液再弃去，在试样杯内加入鲎变形细胞溶解物试剂QLC-1000（300μl）该试剂是由Daiichi Kagaku Yakuhin K，K制备的[将鲎变形细胞溶解物（1小瓶）溶解于不含内毒素的0.1M Tris-盐酸缓冲液（0.01M Mgcl₂，pH8.0，1.4ml及将Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-Pna溶解于不含内毒素的蒸馏水溶液（6.5毫升），两种溶液按比例1∶2进行混合]，温度为4℃。将此混合物搅拌15秒钟，再在37℃反应30分钟，待反应完毕，加入25%醋酸水溶液（200μl）以终止反应。将滤液杯复位，将混合物离心（1700G）分离5分钟，然后将滤液杯中溶液在405nm波长下进行吸光度测定。

测定结果见表2

表2

试验号内毒素浓度（EU/ml）吸光度

1 0.0 0.128

2 0.2 0.260

3 0.4 0.449

4 0.8 0.921

5 1.6 1.613

将数据绘制曲线，纵座标为吸光度，横座标为内毒素浓度，得出标准曲线如图6。

由图6可见，标准曲线的线性良好。

实施例7-11

各种物质中内毒素的测定

除了将内毒素（EC-5）分别加到无内毒素的氯化钠、葡萄糖、盐酸半胱氨酸、青霉素G钾盐、β-1，3-D-葡聚糖中之外，按实施例6所描述的同样方法测定内毒素的含量，采用实施例6中得到的标准曲线。

结果见表3。

表3

试验号试样溶液内毒素量内毒素含量

（EU/ml）（EU/ml）

7（1） 0.15M氯化钠水溶液 0.5 0.52

7（2） 0.5M氯化钠水溶液 0.5 0.52

7（3） 1.0M氯化钠水溶液 0.5 0.51

7（4） 2.0M氯化钠水溶液 0.5 0.42

8 50%葡萄糖水溶液 0.5 0.55

9 盐酸半脱氨酸水溶液 0.5 0.50

10 青霉素G钾水溶液 0.5 0.58

11 β-1，3-D-葡聚糖水溶液 0.5 0.55

实施例12

人血清白蛋白（HSA）中的毒素的测定

向5%HSA溶液中加入内毒素（EC-5）（0或0.5EU/ml），除了用pH5.5，μ＝0.1的吸附剂悬浮液之外，按实施例6所描述的方法，用实施例6所得到的标准曲线测定内毒素含量。

结果见表4。

表4

内毒素量内毒素含量

（EU/ml）（EU/ml）

0 0.11

0.5 0.60

实施例13

标准曲线的制备

除了内毒素（EC-5）溶液的浓度为0，0.05，0.1，0.2或0.4（EU/ml）及酶促反应时间为40分钟外，按实施例6所描述的相同方法，得到如表5所示的结果。

表5

试验号内毒素浓度吸光度

（EU/ml）

1 0 0.364

2 0.05 0.441

3 0.1 0.572

4 0.2 0.855

5 0.4 1.503

将所得数据点在坐标纸上，纵坐标表示吸光度，横坐标表示内毒素浓度，得到如图7所示的标准曲线。

如图7所示，标准曲线显示良好的相关性。

实施例14-16

各种物质中内毒素的测定

除了将内毒素（EC-5）分别加到无内毒素的苯丙氨酸、甲硫氨酸和氨基酸营养液中，且标准曲线采用上述实施例7所得的之外，按实施例7所描述的同样方法测定内毒素含量。

结果见表6

表6

试验号试样溶液内毒素量内毒素含量

（EU/ml）（EU/ml）

14 2%苯丙氨酸水溶液 0.1 0.10

15 5%甲硫氨酸水溶液 0.1 0.10

16 氨基酸营养液 0.2 0.20

实施例17

标准曲线的制备（比浊法技术）

向无热原的水（2ml）中加入预先测定量的内毒素EC-5，制得EC-5水溶液（EC-5的浓度：0.05，0.1，1或10EU/ml）。

将此溶液（200μl）和下文所述参照例1中所制得的10%吸附剂悬浮液（pH6.0，μ＝0.02，900μl）放入离心式过滤装置，该装置采用由一MF膜（聚偏二氟乙烯）和一疏水膜（聚丙烯）组成的双层膜作为滤膜，用一圆形旋混器在室温下于50r.p.m搅拌15分钟。然后，于1700G离心5分钟，取下滤液杯弃去内容物。然后，于4℃下向试样杯中加入鲎变形细胞溶解产物[将1小时瓶鲎单次试验Wako（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Japan制造）溶解到无内毒素的0.1M Tris-HCl缓冲液（pH7.3，5ml）中而制成]200μl和无热原的蒸馏水（100μl）。用旋混器将此混合物搅拌15秒钟，再使其在4℃下静置15分钟。然后，将于1700G离心5分钟得到的滤液转入带盖的无热原试管中，用毒素测定器测量凝结时间（比浊法技术）。

在另一方面，制备预先测定浓度的EC-5水溶液（EC-5的浓度：0.05，0.1，1或10EU/ml），如上所述，将上述EC-5水溶液（200μl）和鲎变形细胞溶解产物试剂（200μl）处理得到的滤液作凝结时间测定（常规方法）但不作吸附剂吸附热原的操作。

结果见表7。按本发明的方法，获得与常规方法测得的几乎相同的值。

将得到的数据在坐标纸上作点，纵坐标表示凝结时间，横坐标表示内毒素浓度，得到如图8所示的标准曲线。

如图8所示，标准曲线显示良好的相关性。

表7

试验号内毒素浓度凝结时间（分）

（EU/ml） A^＊B^＊＊

1 0.05 35.8 31.4

2 0.1 29.8 27.0

3 1 15.2 16.5

4 10 7.2 11.9

（注）A＊：本发明的方法

B＊＊：常规方法

实施例18

向无热原的水（PEW）中加入热原（DIFCO制造，从大肠杆菌O111：B₄中得到），制得各种热原浓度Co（pg/ml）的热原水溶液。从用毒素测定器（比浊法技术）测定上面的热原而制得的标准曲线上计算热原浓度。

将脂肪族型吸附剂A-1型（300mg，湿重）放入带盖的无热原PF试管中，加入热原水溶液（3ml），立即用一圆形旋混器将混合物搅拌15分钟（25r.p.m.，20-25℃）。在完成吸附处理后，用一无热原的MF过滤装置将溶液过滤。用一PF刮勺将滤器上的吸附剂收集到PF试管中，并向其中加入无热原的水，得到30%悬浮液。

向用于毒素测定器的试管底加入悬浮液（100μl），使之在4℃下静置。然后加入在4℃下溶解的LAL试液（ES试验Wako）（100μl）。将混合物与鲎试剂反应10分钟后，将试管放在37℃孵箱中加温10秒钟，用毒素测定器测定凝结时间Tg（分）。除了Co，Tg和C/Co外，根据凝结时间测得的热原含量在表8中表示为每1ml未稀释的溶液中的C值（pg/ml）。

结果，得到几乎恒定的C/Co，且logC和logTg显示良好的线性相关。相应地，用同一方法测定试液的凝结时间，可根据上面的标准曲线测定热原含量。

表8

C_oT_gC C/C_o

0.5 80.0 0.1 0.20

0.5 75.2 0.1 0.20

3.1 44.6 0.4 0.13

3.1 45.6 0.5 0.16

6.3 31.0 1.2 0.19

6.3 28.4 1.4 0.22

21.9 19.6 4.7 0.21

21.9 19.2 4.9 0.22

86.4 14.2 14 0.16

86.4 12.6 20 0.23

实施例19

家兔血清中内毒素的测定

向家兔血清中加入内毒素（EC-5）（0或10EU/ml）。

用无内毒素醋酸盐缓冲液（pH5.5）将此溶液稀释10倍。将此溶液（100μl）和下文所述参照例1所制得的吸附剂的10%悬浮液（900μl;悬浮在同上的缓冲液中）相混合，并将混合物置于实施例6所述离心式过滤装置中，于4℃搅拌30分钟，然后于1700G离心5分钟，取下滤液杯，弃去内容物。放回滤液杯，将无内毒素的0.02MNaCl溶液（1ml）加入试样杯中，接着用一旋混器搅拌20秒，再于1700G离心5分钟。弃去滤液杯中的内容物，将试样杯于70℃加热10分钟。然后，在4℃下向样品杯中加入鲎变形细胞溶解产物试剂（与实施例6相同，300μl）。将混合物搅拌15秒，再于37℃反应30分钟。反应完成后，加入25%醋酸水溶液（200μl）以终止反应。将滤液杯接到试样杯上，将混合物离心5分钟。然后转入滤液杯中的反应液在405nm下测吸光度，用标准曲线（见图9）计算家兔血清中的内毒素含量。结果见表10。

除了用无热原的蒸馏水代替家兔血清和不进行70℃下的热处理之外，用上面描述的同样方法相平行地获得标准曲线。

表10

内毒素量内毒素含量

（EU/ml）（EU/ml）

0 1.32

10 12.45

实施例20

人血浆中内毒素的测定

向人血浆中加入内毒素（EC-5）（0或1EU/ml）。用无内毒素的蒸馏水将此溶液稀释40倍。此溶液（400μl）加入实施例6所述的离心式过滤装置，于65℃下加热2小时。然后向此溶液中加入下文描述的参照例1所制得的15%吸附剂悬浮液（600μl，悬浮在无内毒素的醋酸盐缓冲液（pH5.5）中），于室温下将此混合物搅拌15分钟。然后将其离心5分钟，取下滤液杯，弃去内含物。放回滤液杯，向试样杯中加入无内毒素的0.02M NaCl溶液（1ml），接着用旋混器搅拌20秒，再离心5分钟。弃去滤液杯中的内容物，然后于4℃下向试样杯中加入鲎变形细胞溶解产物试剂（和实施例6相同，300μl）。将混合物搅拌，然后于37℃反应40分钟。反应完成后，用实施例19描述的相同方法处理反应液，并测定反应液在405nm下的吸光度。用标准曲线（见图10）计算人血浆中的内毒素含量。结果见表11。

除了用无热原的蒸馏水代替人血浆和不进行65℃下的热处理外，用上面描述的相同方法相平行地得到标准曲线。

表11

编号内毒素量内毒素含量

（EU/ml）（EU/ml）

1 0 0.04

1 0.98

2 0 0

1 1.17

3 0 0.01

1 0.89

4 0 0

1 1.00

杂环型吸附剂的制备

参照例1

（1）将琼脂糖珠CL-4B（Pharmacia Fine Chemicals制造的琼脂糖衍生物的商品名，350g，湿重）悬浮在蒸馏水（500ml）中。加入2N氢氧化钠水溶液（200ml）和氯甲基环氧丙烷（50ml）将该混合物于40℃搅拌2小时。在反应完成后，将混合物过滤，残渣用蒸馏水洗涤以得到经氯甲基环氧丙烷活化的琼脂糖珠CL-4B。将这样获得的经氯甲基环氧丙烷活化的琼脂糖珠CL-4B悬浮于加热至60℃的0.6%己二胺[1，6]水溶液（1.4升），将悬浮液于60℃下搅拌2小时。反应完成后，将混合物过滤，残渣用蒸馏水洗涤以获得3-（6-氨基己胺基）-2-羟基-丙基化的琼脂糖珠CL-4B（370g，湿重）。当用滴定法测定所得到的琼脂糖珠的氨基己基含量时，此含量约为37.6μmol/g（湿重）。

（2）将3-（6-氨基己胺基）-2-羟基-丙基化的琼脂糖珠CL-4B（370g，湿重）悬浮于4N氢氧化钠水溶液（700ml）中。于65℃下，向悬浮液中加入氯甲基环氧丙烷（700ml），将混合物搅拌。反应完成后，加水到混合物中以冷却至50℃或更低的温度。然后，将混合物过滤，残渣用蒸馏水洗涤，以得到经氯甲基环氧丙烷活化的3-（6-氨基己胺基）-2-羟基-丙基化的琼脂糖珠CL-4B。将其悬浮在加热至90℃的20%水合盐酸组氨酸（用氢氧化钠水溶液调节至pH12，2.1升）中，于80-90℃下将此悬浮液搅拌30分钟。反应完成后，将混合物过滤，残渣用蒸馏水彻底洗涤。将残渣悬浮于蒸馏水（1升）中，经120℃高压消毒20分钟，然后过滤。相继地用0.2N盐酸水溶液，0.2N氢氧化钠水溶液、1.5N氯化钠水溶液和蒸馏水彻底洗涤残渣。这样，就得到以琼脂糖作为载体，组氨酸作为配体，和己二胺-[1，6]作为间隔物中心的水不溶性吸附剂（390g，湿重）。每g（湿重）吸附剂的组氨酸含量为20.4μmol。

参照例2

除了用Cellulofine GCL-2000-M（日本Chssoo Co.，Ltd生产的纤维素衍生物的商品名，350g）代替琼脂糖珠CL-4B之外，按照参照例1所描述的相同的方法获得一种吸附剂。所得到的吸附剂是含纤维素作为载体，组氨酸作为配体和己二胺-[1，6]作为间隔物中心的水不溶性吸附剂（340g，湿重）。每1g（湿重）吸附剂的组氨酸含量为58μmol。

参照例3

将按参照例1（1）所述的相同方法制得的3-（6-氨基己胺基）-2-羟基-丙基化的琼脂糖珠CL-4B（18g，湿重）悬浮在0.05M磷酸盐缓冲液（pH7.0，45.6ml）中。向悬浮液中加入25%戊酰胺醛水溶液（19.2ml），在室温下将此混合物搅拌2小时。在反应完成后，将混合物过滤，残渣用0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0）彻底洗涤，得到经戊酰胺醛活化的3-（6-氨基己胺基）-2-羟基丙基化的琼脂糖珠CL-4B。将其悬浮于15mM组织胺-0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0，59.6ml）中，于室温下将此悬浮液搅拌2小时。反应完成后，将混合物过滤，残渣用1M氯化钠水溶液（600ml）洗涤。将残渣悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.0，30ml）。向此悬浮液中加入氢硼化钠（0.3g），在室温下将混合物搅拌1小时。反应完成后，将混合物过滤，残渣用1M氯化钠水溶洗和蒸馏水相继进行彻底的洗涤。这样就得到含琼脂糖作为载体、组织胺作为配体和己二胺-[1，6]作为间隔物中心的水不溶性吸附剂（20.7g，湿重）。每1g（湿重）吸附剂的组织胺含量为4.1μmol。

参照例4

脂肪族型吸附剂的制备

A-1型：

将多孔体纤维素凝胶珠载体（a）（50g，湿重）用水洗涤并分散在0.6N氢氧化钠水溶液（110ml）中之后，经减压过滤而脱水。向混合物中加入在60℃下反应了30分钟的氯甲基环氧丙烷（16ml）。向经过滤并用水洗涤过的环氧活化的中间体（b）中加入配体溶液，将混合物在70℃下反应1小时。配体溶液的制备是将65%己二胺-[1，6]（4ml）溶解在水（100ml）中。反应液经过滤、水洗、以盐酸调节pH至10.4，水洗和脱水后，得到约55g湿的A-1型吸附剂（C）（见表9）。

表9

g（湿重）/g（干重）

（a） 17.0 [1.82ml/g（湿重）]

（b） 15.8 [环氧化物含量：174μmol/g（干重）]

（c） 18.2 [1.45ml/g（湿重）]

[己二胺-[1，6]含量：133μmol/g

干重]（元素分析）

此分离剂（吸附剂）具有CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₆-NH₂（链长：11）为其主要功能链。

按相同的方法，通过改变反应条件可以得到己二胺-[1，6]含量为50-600的分离剂。我们认为，通过改变反应条件得到的分离剂可具有CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₆NHCH₂CH（OH）CH₂（链长：14）亦可具有CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₆NH₂（链长：11）为其主要功能链。

A-2型：

这是通过A-1型吸附剂和赖氨酸的缩合反应而得到的。

功能链：

CH₂CH（OH）CH₂NH（CH₂）₆NHCOCH（NH₂（CH₂）₄NH₂

B-1型：

这是采用多孔纤维素凝胶为基质，在其上面加上氯甲基环氧丙烷和氨而制得的。产物以CH₂CH（OH）CH₂NH₂和CH₂CH（OH）CH₂NHCH₂（OH）CH₂为其功能链，且为颗粒形状，颗粒直径约为50-200μm，最大孔径约为100-500nm。

B-2型：

这是通过B-1型吸附剂和赖氨酸的缩合反应而制得的。

功能链：CH₂CH（OH）CH₂NHCOCH（NH₂）（CH₂）₄NH₂。

Claims

1、一种测定热原含量的方法，其特征在于：用一离心式过滤装置进行离心过滤，该装置有一滤液杯及一试样杯，试样杯活动地连接于滤液杯开口处，所述试样杯通过一滤膜与滤液杯相连接，在试样杯中将试样与具有吸附热原能力的吸附剂相接触，任何不被吸附的物质在加速渗过膜的条件下通过滤膜进入滤液杯而被去除，将试样杯中所保留的吸附在吸附剂上的热原与检测试剂反应以测定热原含量。

2、按权利要求1所述的一种方法，其特征在于：在一合成底物的存在下完成和鲎溶解产物的反应后，经离心通过滤膜将吸附剂从反应液中分离出来，而反应液则转入滤液杯中，将反应液作热原含量测定。

3、按权利要求1所述的一种方法，其特征在于：其中滤膜为切取分子量10，000-3，000，000的超滤膜或孔径0.01-10μm的微孔滤膜。

4、按权利要求1所述的一种方法，其特征在于：其中吸附剂为由如下分子式的含氮环状化合物组成的杂环型吸附剂：

R-A-X

其中R为含氮杂环基团，A为单键烷基，具有1-12个碳原子的亚烷基或具有2-12个碳原子的亚链烯基，当A为单键烷基时，X为氢原子、氨基、羟基或羧基，当A为亚烷基或亚链烯基时，X为氨基、羟基或羧基，所述杂环基团和亚烷基可任意选择地被选自羧基、氧代，含1-6个碳原子的烷基、羟基、氨基和具有1-6个碳原子的烷氧基的一个或一个以上基团所取代;和具有羟基、氨基、羧基或卤原子的水不溶性载体;

所述含氮环状化合物直接地或通过一间隔物联接于水不溶性载体，该间隔物为选自由

NH₂（CH₂）_nNH₂，

NH₂（CH₂）_nCOOH，

NH₂（CH₂）_nOH和

HOOC（CH₂）_nCOOH，

其中n为1-12的整数，所组成的一组中的一个化合物。

5、按权利要求4所述的一种方法，其特征在于：含氮杂环基团R为咪唑环、吡唑环、嘧啶环、哒嗪环、吡嗪环，嘌呤环、吖啶环、***环、噁二唑环、四唑环、吲唑环、苯并***环、苯并哒嗪环、苯并嘧啶环、苯并吡嗪环和亚萘基环。

6、按权利要求1所述的一种方法，其特征在于：其中吸附剂为由一含脂肪族氮化合物和一孔径大小为50nm至1μm的多孔基质所组成的脂肪族型吸附剂，其含脂肪族氮化合物具有含3-50个成链原子的功能链，所述脂肪族氮原子为伯胺基、仲胺基、叔胺基、季铵或氨基的氮原子，并连接于脂肪族碳原子：

所述含脂肪族氮化合物直接地或通过一间隔物联接于所述基质，该间隔物为选自含

NH₂（CH₂）_nNH₂，

NH₂（CH₂）_nCOOH，

NH₂（CH₂）_nOH和

HOOC（CH₂）_nCOOH，

其中n为1-12的整数，的一组中的一个化合物。

7、按权利要求1所述的一种方法，其特征在于：用离心法进行未被吸收物质的分离。

8、按权利要求1所述的一种方法，其特征在于：将试样溶液和处于4-40℃温度下，pH为4-8，离子强度不高于0.2的吸附剂接触至少15分钟。

9、按权利要求2所述的一种方法，其特征在于：反应在25-40℃温度下进行10-120分钟。

10、按权利要求2所述的一种方法，其特征在于：合成底物为Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA，Boc-Leu-Gly-Arg-pNA或Boc-Leu-Gly-Arg-MCA。

11、用热原检测试剂作热原含量测定的一种方法，其特征在于：

将试样溶液中的热原和固体吸附剂接触，在固-液分离后，将吸附剂和一检测试剂反应以测定热原含量，所述固体吸附剂包括一种含脂肪族氮的化合物和通过一间隔物结合其上的基质。

12、按权利要求11所述的一种方法，其特征在于：其中吸附剂为由一含脂肪族氮化合物和一孔径大小为50nm至1μm的多孔基质所组成的脂肪族型吸附剂，其含脂肪族氮化合物具有含3-50个成链原子的功能链，所述脂肪族氮原子为伯胺基、仲胺基、叔胺基、季铵或氨基的氮原子，并连接于脂肪族碳原子;

所述含脂肪族氮化合物直接地或通过一间隔物连接于所述基质，该间隔物为选自由

NH₂（CH₂）_nNH₂，

NH₂（CH₂）_nCOOH，

NH₂（CH₂）_nOH和

HOOC（CH₂）_nCOOH，

其中n为1-12的整数，所组成的一组中的一个化合物。