CN105648012A - 一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法 - Google Patents

一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，包括以下主要步骤：将新鲜的水产蛋白绞碎后备用，将植物蛋白粉碎后过60目筛备用；绞碎后的水产蛋白和粉碎的植物饲料蛋白混合，并添加营养物和水混匀作为发酵培养基；往发酵培养基上接入能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（<i>Bacillus？licheniformis</i>）HL-3；接入菌种的培养基于55℃～60℃进行固态好氧发酵38h～48h；然后固态发酵产物加水于55℃酶解2h；液态酶解产物先后经过滤、超滤和纳滤后得到浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得到活性肽成品。本发明技术作用条件温和，更多地保留了制备的功能肽和原料本身所含其它功能性成分的生物学活性，并且简化了制备工序和降低了活性肽的生产成本，有着良好的应用前景。

Description

一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法
技术领域
本发明涉及一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，属于水产品加工与利用领域。
背景技术
蛋白质酶解的后的产物小肽不但容易消化、吸收，而且还具有抗高血压、抗胆固醇、抗血栓形成、改善脂质代谢、增强人体体能、帮助恢复疲劳、促进钙磷和其它微量元素的吸收、促进大脑发育、提高记忆力、增强巨噬细胞和B细胞活力、增强免疫功能、保护表皮细胞、防止黑色素沉淀、消除体内自由基等功效。
关于水产蛋白活性肽的制备，国内进行了大量的研究。目前，水产蛋白活性肽的制备方法主要有自溶酶解、酶解法、液态发酵法和固态发酵与液态酶解相结合的方法这四种。专利申请200810195646.4“内源酶制备生物活性小肽的工艺”公开了一种利用海洋低值鱼体内的内源酶自溶酶解的方法制备水产蛋白生物活性小肽的方法。专利申请201410145196.3“一种制备扇贝裙边活性肽的方法”公开了一种酶解法制备水产蛋白活性肽的方法。专利申请CN102028091A“一种纳豆菌发酵法制备低分子鱼肽的方法”公开了一种液体发酵法制备鱼蛋白肽的方法，专利申请201210539941.3“一种由鱼蛋白肽和与大豆肽组成的蛋白肽的生产方法”公开了一种由固态发酵与液态酶解相结合制备水产蛋白活性肽的方法。
现有的水产蛋白活性肽制备技术中存在以下缺陷。首先，现有的水产蛋白活性肽制备技术中都有高温处理的过程。以上制备技术中都有高温灭酶这一工序；微生物发酵的方法原料需要灭菌。以上这些高温处理，会在一定程度减弱制备的功能肽或水产蛋白本身所含其它功能性成分中的生物学活性；另外高温处理过程，会增强美拉德，使得酶解液颜色变深，为成品加工过程增加了负担。其次，外加酶酶解的方法需要外加蛋白酶，增加了成本；自溶酶解由于内源酶的不足，导致酶解不彻底。另外，微生物发酵法虽然不用外加蛋白酶，但是原料需要灭菌导致内源酶失活，不能充分地有效利用内源酶。
发明内容
针对现有的水产蛋白活性肽制备技术存在的问题。本发明的主要目的是提供一种低温的制备水产蛋白活性肽的方法，以便更好地保留制备的功能肽和水产蛋白本身所含功能性成分的生物学活性。本发明的另一目的是提供一种发酵法制备活性肽的方法，使得微生物发酵与内源酶酶解过程能有机结合在一起。本发明还有一目的是简化活性肽的制备工序，降低其生产成本。
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用，将植物蛋白粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎水产蛋白和粉碎后的植物蛋白按质量比为0.5~1.5：1的比例混合，并加营养物和水混匀，获得最终水分含量控制在40%～80%范围内的发酵培养基；
（4）往步骤然（3）制得的发酵培养基上接入步骤（1）所制备的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液，并混匀；
（5）固态发酵：将步骤（4）获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在55℃~60℃，发酵时间为38h～48h；
（6）液态酶解：将步骤（5）得到固态发酵产物与水按质量比为1：3的比例混合，并搅拌均匀后加入到酶解罐中，控制酶解温度为55℃，酶解2h；
（7）成品的加工：将步骤（6）得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液；酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
所述步骤（1）中所用的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3已于2016年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60003，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、牡蛎、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。所述步骤（2）中的植物蛋白为豆粕、花生粕、棉籽粕和菜粕中的一种或其中两种以上的混合物。
所述步骤（3）中的营养物为玉米粉、食品级氯化钙、食品级氯化亚铁和食品级磷酸氢二钾组成的混合物。所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：玉米粉0.01%～5%，食品级氯化钙0.01%～5%，食品级氯化亚铁0.01%～5%，食品级磷酸氢二钾0.01%～5%。
所述步骤（4）中地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为1%～15%。
与现有技术相比，本发明具有以下优点。
（1）整个制备过程没有高温处理，更好地保留了制备的功能肽和水产蛋白本身所含其它功能性成分中的生物学活性。本发明申请采用耐高温地衣芽孢杆菌发酵，在高温条件下可以抑制致病菌和腐败菌的生长，因此本技术中培养基无需灭菌。另外，本技术采用超滤膜去除酶解液中的蛋白酶，无需高温灭酶。
（2）简化了工序，降低了成本。由于本发明申请没有高温灭酶的过程，这不但降低了能耗，而且还会大大降低酶解液的美拉德反应，所以酶解液的颜色比较浅。而后续的膜分离又有一定的脱色效果，因此本技术中可以无需脱色这个程序，简化了工序，降低了成本。
（3）内源酶酶解与微生物发酵的完美结合。现有的发酵技术中，原料都需灭菌，这不但增加了能耗，而且又使得水产蛋白的内源酶失活。本技术中原料无需灭菌，保留了水产蛋白中内源酶的活性。并且，微生物发酵的温度与内源酶的最适酶解温度一致，使得内源酶酶解与微生物发酵能完美结合在一起。正是由于本发明中充分利用内源酶的酶解作用，使得本发明无需另加蛋白酶。
（4）制备成本不但要低于现有固态发酵联合液态酶解技术，而且发酵效果也要优于现有的固态发酵联合液态酶解技术。与现有的采用发酵法制备活性肽的技术相比，本发明申请原料无需灭绝，可降低能耗和成本；由于本发明申请提供的技术方案无需高温灭绝，保留了水产蛋白内源蛋白酶的酶活，这是现有的采用常温发酵菌种制备活性肽无法做到的，在水产蛋白内源蛋白酶的协助下，本发明申请可以不用外加蛋白酶。在高温下蛋白酶酶的活性更强，因此，本技术采用耐高温菌种进行发酵，水产蛋白的水解度要高于现有的常温菌种发酵技术。
本发明提供了一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法。本发明技术作用条件温和，更多地保留了制备的功能肽和水产蛋白本身所含其它功能性成分中的生物学活性，并且简化了制备工序和降低了活性肽的生产成本，有着良好的应用前景。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面就水产蛋白的种类、植物蛋白的种类、发酵参数和发酵方式的选择结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液备用。将新鲜的南极磷虾绞碎后备用；将豆粕粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的南极磷虾和100公斤粉碎并过60目筛的豆粕混合，并加入5公斤玉米粉、500克食品级氯化钙、500克食品级氯化亚铁、650克食品级磷酸氢二钾和10公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养加入10公斤地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为8厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为55℃，发酵时间为45h；发酵结束后，将固态发酵产物与水按质量比为1：3的比例混合并搅拌均匀，加入到酶解罐中，控制酶解温度为55℃，酶解2h；将上面得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液，酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
实施例2：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液备用。将新鲜的南美白对虾的虾头绞碎后备用；将花生粕粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的虾头和100公斤粉碎并过60目筛的花生粕混合，并加入6公斤玉米粉、510克食品级氯化钙、550克食品级氯化亚铁、580克食品级磷酸氢二钾和8公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养加入9公斤地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为4厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为60℃，发酵时间为48h；发酵结束后，将固态发酵产物与水按质量比为1：3的比例混合并搅拌均匀，加入到酶解罐中，控制酶解温度为55℃，酶解2h；将上面得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液，酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
实施例3：将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液备用。将新鲜的去壳后的牡蛎绞碎后备用；将豆粕粉碎后过60目筛备用。将100公斤绞碎的牡蛎和100公斤粉碎并过60目筛的豆粕混合，并加入4公斤玉米粉、560克食品级氯化钙、550克食品级氯化亚铁、650克食品级磷酸氢二钾和8公斤水一起混匀，获得混匀后的发酵培养基；混匀后的发酵培养加入9公斤地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液，搅拌并混合均匀；接种后的发酵培养基分装在已用75%的酒精表面消毒的发酵浅盘中，浅盘中装料厚度为6厘米，浅盘中发酵培养基表面覆盖灭菌处理的湿纱布，再将浅盘置于灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度为57℃，发酵时间为46h；发酵结束后，将固态发酵产物与水按质量比为1：3的比例混合并搅拌均匀，加入到酶解罐中，控制酶解温度为55℃，酶解2h；将上面得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液，酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。

Claims (7)

1.本发明公开了一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的能产耐高温蛋白酶的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3接入到灭菌后冷却的LB液体培养基中，于55℃、150r/min培养12h，制备成地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液备用；
（2）将新鲜的水产蛋白绞碎后备用，将植物蛋白粉碎后过60目筛备用；
（3）将步骤（2）制得的绞碎水产蛋白和粉碎后的植物蛋白按质量比为0.5~1.5：1的比例混合，并加营养物和水混匀，获得最终水分含量控制在40%～80%范围内的发酵培养基；
（4）往步骤然（3）制得的发酵培养基上接入步骤（1）所制备的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液，并混匀；
（5）固态发酵：将步骤（4）获得的加入菌的发酵培养基按照下列方法进行发酵：发酵培养基分装在已消毒的发酵浅盘中，装料厚度为4cm～8cm，浅盘中发酵培养基表面覆盖已灭菌的湿纱布，再将浅盘置于已灭菌的固体发酵房内的搁架上发酵，控制环境温度在55℃~60℃，发酵时间为38h～48h；
（6）液态酶解：将步骤（5）得到固态发酵产物与水按质量比为1：3的比例混合，并搅拌均匀后加入到酶解罐中，控制酶解温度为55℃，酶解2h；
（7）成品的加工：将步骤（6）得到的液态酶解产物通过过滤去除沉淀得到酶解液；酶解液通过截留分子量为5000道尔顿的超滤膜的超滤去除大分子蛋白质而得到透过液；透过液然后通过截留分子量为200道尔顿的纳滤膜的纳滤去除氨基酸而得到浓缩液；浓缩液经过冷冻干燥而得到活性肽成品。
2.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCCNo：60003。
3.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的水产蛋白为罗非鱼下脚料、南极磷虾、虾头、扇贝裙边、鳕鱼下脚料、鱿鱼下脚料、牡蛎、青鳞鱼下脚料、青鱼下脚料、鲢鱼下脚料、草鱼下脚料和鲣鱼下脚料中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的植物蛋白为豆粕、花生粕、棉籽粕和菜粕中的一种或其中两种以上的混合物。
5.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物为玉米粉、食品级氯化钙、食品级氯化亚铁和食品级磷酸氢二钾组成的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的营养物的加入量以添加的营养物的质量占发酵培养基总质量百分比计，分别为：玉米粉0.01%～5%，食品级氯化钙0.01%～5%，食品级氯化亚铁0.01%～5%，食品级磷酸氢二钾0.01%～5%。
7.根据权利要求1所述的一种固态发酵联合液态酶解的制备水产蛋白活性肽的方法，其特征在于：所述步骤（4）中地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）HL-3种子液的接种量以接入种子液的质量占发酵培养基总质量百分比计，为1%～15%。
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