CN105616447A - 一种草分枝杆菌注射液的制备方法及草分枝杆菌注射液 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种草分枝杆菌注射液的制备方法,该方法采用原始菌种-主种子批-工作种子批三级培养的方式,最后工作种子批经发酵培养,分离、纯化、灭菌,获得草分枝杆菌原液。所述原液经过聚山梨酯80和氯化钠所配制的稀释液的稀释,直接得到草分枝杆菌注射液。按照本发明所提出的草分枝杆菌注射液制备方法,具有菌种保持性好、安全程度高、成本低、生产效率高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及草分枝杆菌,特别涉及一种草分枝杆菌注射液的制备方法。
背景技术
草分枝杆菌是抗酸分枝杆菌中的一种,基于其同结核分枝杆菌的生物亲缘性,可介入人体的免疫过程,调节机体免疫***的免疫能力。灭活的草分枝杆菌进入人体后可刺激T淋巴细胞释放出多种淋巴因子如MAF,MIF,MCF,MMF等,这些因子作用于单核巨噬细胞***,使之向病灶部位聚集、活化,对病原菌进行吞噬、杀伤和清除;同时,自然杀伤(NK)细胞、B淋巴细胞也活化、增多;IgM,IgG趋正常,调节细胞免疫***产生免疫功能,增强机体免疫能力。临床验证结果证明,在免疫功能检查中,T淋巴细胞亚群,T3,T4,T8,T4/T8明显增加,统计学差异显著(P<0.001-0.002),自然杀伤细胞,免疫球蛋白均明显变化,统计学具有显著差异(P<0.01),具有显著免疫增强作用。
对于草分枝杆菌的免疫增强乃至抗癌功能,目前在药学、临床学上都进行了大量的研究,在文献DE3728367C1中,披露了用草分枝杆菌对HIV感染者进行免疫接种的方法,改善HIV感染者的生存状况。
在《新的免疫增强剂——草分枝杆菌的实验和临床研究》(实用癌症杂志,2003.3,Vol.18,No.2)一文中,详细报道了临床上的草分枝杆菌对Lovo人结肠癌细胞的抑制作用》。
文献CN103396958A中,披露了一种动物用草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法,将菌种接种到种子培养基上进行种子培养后,直接进入发酵培养。这种培养方式虽然在一定程度上保证了菌种的纯度及降低了变异几率,然而,却也限制了其产量。
为了扩大草分枝杆菌的使用范围,需要一种能够工业化生产的草分枝杆菌注射液的制备方法。
发明内容
本发明提出了一种草分枝杆菌注射液的制备方法,包括以下步骤:
a)将将草分枝杆菌的原始冻干菌种溶解、用稀释的苏通培养基稀释、分装,完成原始种子批的建立,并在-70摄氏度环境下保存;
b)对原始种子批菌种进行检查,并将合格的原始种子批菌种解冻、过滤、稀释、接种于改良罗氏培养基上在30-40摄氏度的环境下培养120-150小时;
c)将步骤b)中获得的菌体进行研磨、稀释后接种于改良罗氏培养基上,在30-40摄氏度的环境下培养168-196小时,经洗脱、研磨、分装,形成主种子批菌种,并进行检验;
d)将检验合格的主种子批菌种接种于改良罗氏培养基上,在30-40摄氏度的环境下培养196-240小时,经洗脱、研磨、分装,形成工作种子批菌种,并进行检查;
e)将工作种子批菌种通过复苏、扩增形成工作种子液,将工作种子液按照体积比1-5%的接种量将工作种子液接种到发酵罐内的发酵培养基中,培养条件为35-42摄氏度,通气量为0.5-1.5L/分钟、以50-300rpm转速的条件下培养360-450小时,收集之后用0.8-1.0%的NaCl冲洗液进行冲洗、过滤,纯化、灭菌之后即获得草分枝杆菌原液;
f)以聚山梨酯80和氯化钠及注射用水混合,过滤配制成稀释液,所述稀释液中聚山梨酯80的体积百分比是0.05-0.4%,氯化钠重量百分比是0.7-1.1%,其中过滤之后的稀释液与草分枝杆菌原液混合,获得草分枝杆菌药液;
g)将草分枝杆菌药液灌封在清洁灭菌后的安瓿瓶中,终端灭菌检漏后,即为草分枝杆菌注射液。
如上所述的制备方法,其特征在于:
所述苏通培养基的配方是(单位:g/L):天门冬素4g、枸橼酸盐2g、磷酸氢二钾0.5g、MgSO4.7H2O0.5g、枸橼酸铁铵0.5g、甘油-6ml;
调节PH值至弱碱性,然后采用湿热灭菌法进行二次灭活,步骤为:
对配制好的苏通培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟;
一次灭活完成后的苏通培养基,在常温下静置4小时,然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理35分钟,完成二次灭活处理。
如上任一所述的方法,其特征在于:
所述改良罗氏培养基的配方是(单位:g/L):
磷酸二氢钾2.4、硫酸镁0.24、柠檬酸镁0.6、L-谷氨酸钠7.2、孔雀绿0.4、马铃薯淀粉30,并调节PH值至弱碱性,然后采用湿热灭菌法进行二次灭活,步骤为:
对配制好的改良罗氏培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟;
一次灭活完成后的改良罗氏培养基,在常温下静置4小时,然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理30分钟,完成二次灭活处理。
如上任一所述的方法,其特征在于:
所述发酵培养基的配方是(单位:g/L):磷酸二氢钾1.5、磷酸氢二钠1.5、硫酸铵0.5、硫酸镁0.055、硫酸铜0.001、味精0.5、柠檬酸钠0.45、琼脂粉15、甘油6、酵母膏5、马铃薯淀粉15、葡萄糖5,然后再用湿热灭菌法进行灭活处理,具体方法是:
将配好的发酵培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟。
本发明还提出了一种草分枝杆菌注射液,所述草分枝杆菌注射液是由如上任一所述的方法制备而成。
本发明所提出的草分枝杆菌注射液的制备方法,适宜于规模的工业生产,且显著的降低了成本,能够充分满足患者需求。
附图说明
图1草分枝杆菌原液的制备流程图
图2从原液到注射液的制备流程图
具体实施方法
实施例1
一、草分枝杆菌原液的制备
如图1所示,草分枝杆菌原液采用三级培养的模式进行制备,具体步骤如下:
原始种子批的建立
将草分枝杆菌的原始冻干菌种溶解、用稀释的苏通培养基稀释、分装,完成原始种子批的建立,并在-70摄氏度环境下保存。
所述苏通培养基的配方是(单位:g/L):天门冬素4g、枸橼酸盐2g、磷酸氢二钾0.5g、MgSO4.7H2O0.5g、枸橼酸铁铵0.5g、甘油-6ml;
调节PH值至弱碱性,然后采用湿热灭菌法进行二次灭活,步骤为:
对配制好的苏通培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟;
一次灭活完成后的苏通培养基,在常温下静置4小时,然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理35分钟,完成二次灭活处理。
主种子批菌种的建立
对原始种子批菌种进行检查,并将合格的原始种子批菌种解冻、过滤、稀释、接种于改良罗氏培养基上在30-40摄氏度的环境下培养120-150小时;
然后将获得的菌体进行研磨、稀释后接种于改良罗氏培养基上,在30-40摄氏度的环境下培养168-196小时,经洗脱、研磨、分装,形成主种子批菌种,并进行检验。
所述改良罗氏培养基的配方是(单位:g/L):
磷酸二氢钾2.4、硫酸镁0.24、柠檬酸镁0.6、L-谷氨酸钠7.2、孔雀绿0.4、马铃薯淀粉30,并调节PH值至弱碱性,然后采用湿热灭菌法进行二次灭活,步骤为:
对配制好的改良罗氏培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟;
一次灭活完成后的改良罗氏培养基,在常温下静置4小时,然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理30分钟,完成二次灭活处理。
工作种子批菌种的建立
检验合格的主种子批菌种接种于改良罗氏培养基上,在30-40摄氏度的环境下培养196-240小时,经洗脱、研磨、分装,形成工作种子批菌种,并进行检查。
草分枝杆菌原液的形成
工作种子批菌种通过复苏、扩增形成工作种子液,将工作种子液按照体积比1-5%的接种量将工作种子液接种到发酵罐内的发酵培养基中,培养条件为35-42摄氏度,通气量为0.5-1.5L/分钟、以50-300rpm转速的条件下培养360-450小时,收集之后用0.8-1.0%的NaCl冲洗液进行冲洗、过滤,纯化、灭菌之后即获得草分枝杆菌原液。
所述发酵培养基的配方是(单位:g/L):磷酸二氢钾1.5、磷酸氢二钠1.5、硫酸铵0.5、硫酸镁0.055、硫酸铜0.001、味精0.5、柠檬酸钠0.45、琼脂粉15、甘油6、酵母膏5、马铃薯淀粉15、葡萄糖5,然后再用湿热灭菌法进行灭活处理,具体方法是:
将配好的发酵培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟。
草分枝杆菌药液的配制及灌封
以聚山梨酯80和氯化钠及注射用水混合,过滤配制成稀释液,所述稀释液中聚山梨酯80的体积百分比是0.05-0.4%,氯化钠重量百分比是0.7-1.1%,其中过滤之后的稀释液与草分枝杆菌原液混合,获得草分枝杆菌药液。稀释液与原液的配比,按照药液中草分枝杆菌的浓度不同而选择不同的配比。一般而言,稀释液对草分枝杆菌原液的稀释,按照如下四种规格进行:
0.172μg/ml(极低浓度),每ml注射液中的F.U.36菌落数为4.6×105;
1.72μg/ml(低浓度),每ml注射液中的F.U.36菌落数为4.6×106;
17.2μg/ml(中浓度),每ml注射液中的F.U.36菌落数为4.6×107;
172μg/ml(高浓度),每ml注射液中的F.U.36菌落数为4.6×108。
将草分枝杆菌药液灌封在清洁灭菌后的安瓿瓶中,终端灭菌检漏后,即为草分枝杆菌注射液。
需要说明的是:以上仅用以说明而非限制本发明的技术方案,尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换,而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换,均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种草分枝杆菌注射液的制备方法,包括以下步骤:
a)将将草分枝杆菌的原始冻干菌种溶解、用稀释的苏通培养基稀释、分装,完成原始种子批的建立,并在-70摄氏度环境下保存;
b)对原始种子批菌种进行检查,并将合格的原始种子批菌种解冻、过滤、稀释、接种于改良罗氏培养基上在30-40摄氏度的环境下培养120-150小时;
c)将步骤b)中获得的菌体进行研磨、稀释后接种于改良罗氏培养基上,在30-40摄氏度的环境下培养168-196小时,经洗脱、研磨、分装,形成主种子批菌种,并进行检验;
d)将检验合格的主种子批菌种接种于改良罗氏培养基上,在30-40摄氏度的环境下培养196-240小时,经洗脱、研磨、分装,形成工作种子批菌种,并进行检查;
e)将工作种子批菌种通过复苏、扩增形成工作种子液,将工作种子液按照体积比1-5%的接种量将工作种子液接种到发酵罐内的发酵培养基中,培养条件为35-42摄氏度,通气量为0.5-1.5L/分钟、以50-300rpm转速的条件下培养360-450小时,收集之后用0.8-1.0%的NaCl冲洗液进行冲洗、过滤,纯化、灭菌之后即获得草分枝杆菌原液;
f)以聚山梨酯80和氯化钠及注射用水混合,过滤配制成稀释液,所述稀释液中聚山梨酯80的体积百分比是0.05-0.4%,氯化钠重量百分比是0.7-1.1%,其中过滤之后的稀释液与草分枝杆菌原液混合,获得草分枝杆菌药液;
g)将草分枝杆菌药液灌封在清洁灭菌后的安瓿瓶中,终端灭菌检漏后,即为草分枝杆菌注射液。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述苏通培养基的配方是(单位:g/L):天门冬素4g、枸橼酸盐2g、磷酸氢二钾0.5g、MgSO4.7H2O0.5g、枸橼酸铁铵0.5g、甘油-6ml;
调节PH值至弱碱性,然后采用湿热灭菌法进行二次灭活,步骤为:
对配制好的苏通培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟;
一次灭活完成后的苏通培养基,在常温下静置4小时,然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理35分钟,完成二次灭活处理。
3.如权利要求1-2任一所述的方法,其特征在于:
所述改良罗氏培养基的配方是(单位:g/L):
磷酸二氢钾2.4、硫酸镁0.24、柠檬酸镁0.6、L-谷氨酸钠7.2、孔雀绿0.4、马铃薯淀粉30,并调节PH值至弱碱性,然后采用湿热灭菌法进行二次灭活,步骤为:
对配制好的改良罗氏培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟;
一次灭活完成后的改良罗氏培养基,在常温下静置4小时,然后以121摄氏度的温度再次进行灭活处理30分钟,完成二次灭活处理。
4.如权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于:
所述发酵培养基的配方是(单位:g/L):磷酸二氢钾1.5、磷酸氢二钠1.5、硫酸铵0.5、硫酸镁0.055、硫酸铜0.001、味精0.5、柠檬酸钠0.45、琼脂粉15、甘油6、酵母膏5、马铃薯淀粉15、葡萄糖5,然后再用湿热灭菌法进行灭活处理,具体方法是:
将配好的发酵培养基在121摄氏度温度下进行灭活处理30分钟。
5.一种草分枝杆菌注射液,所述草分枝杆菌注射液是由如权利要求1-4任一所述的方法制备而成。
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