JPS6211090A - トレポネマ・ハイオジセンテリアエの生育方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 豚の赤痢は離乳後の豚に主として影響を及ぼす　。

重い粘液出血性下痢である。この病気の抑制は一般に化
学生物物質（ｃｈｅｍｏｂｉｏｔ　１ｃｓ）および抗生
物質の使用により達成されてきた。今日まで、この病気
を抑制するために有効な薬物以外の予防物質は存在して
いない。嫌気性スピロ記す）は豚の赤痢の主要な病因学
的因子であることが認識されている。米国特許第４．Ｚ
ｏｏ、２７２号は、豚の赤痢に対する豚の抵抗を増加す
るために、Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの殺した
細胞を含有するワクチンまたはバクテリンの使用を開示
している。

この先行技術の方法は、バクテリン生成物の活性が比較
的低いために、商業的に受入れられなかった。記載され
た処置のスケジュールは６回の静脈内注射を含む、より
少ない筋肉内注射を含む処置のスケジュールで使用でき
るへクチリンを得ることは望ましいことである。

コレステロールに富んだ分画は、ある有機体のための生
育促進剤として有効であることが知られている。ジャー
ナル・オプ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、）Ｖｏｌ、１３５、Ｎ００３，８１８−８２７ペー
ジ（１９７８）るコレステロール含有血清分画の使用を
記載している。ジャーナル・才ブ・ゼネラル・マイクロ
バイオロジー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

ｇｙ）は、トレボネマ・ハイオジセンテリアエ±Ａ且）
、Ｖｏｌ、１１６．５３９−５４３ページ（１９８０）
の生育におけるＵＳＰコレステロールの使用を記載して
いる。

本発明によれば、栄養培地がコレステロールに富んだウ
シ分画を含有することを特徴とする得られた細胞をバク
テリン中において引続いて使用すりを適当な栄養培地中
で生育させる方法が提供される。

本発明の方法は、Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ土ａｅの
有毒な菌株を用いて実施することができる。有毒な菌株
は典型的な豚の赤痢の感染を生成することのできる菌株
である。２つの特定の菌株（Ｂ　２０４およびＢ　２３
４）はこの目的に有効であることがわかった。これらは
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　　　Ｔｙｐｅ　　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、に受託され、モしてＡＴｃ
ｃ　　Ｎｏ、３１２１２（Ｂ２０４）およびＡＴＣＣＮ
ｏ、３１２８７　（Ｂ２３４）と表示された。

Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株は、子牛胎児血
清または子箕血清、デキストロース、ｌ−システィンＭ
ＣＩ、ビタミンＢ−１２および酵母エキスを補充したト
リブチツク・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ　　Ｓｏｙ
　　Ｂｒｏｔｈ）　　［ディ７　Ｄ　Ｉ＋ラボラトリー
ズ（Ｄｉｆｃｏ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］の混
合物からなる培地中で生育させることができる。本発明
の改良は、Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ細胞を生
育させるためのこのような培地中にコレステロールに富
んだウシ分画を含めることである。コレステロールに富
んだウシ分画は前記培地の容量に基づいて好ましくは１
．０〜２．５容量％の量で存在するが。

０．１〜５．０容量％の量で存在することができる。

本発明の方法における使用に適するコレステロールに富
んだウシ分画はいくつかの源から入手可能である。マイ
ルス・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド（Ｍｉ　
ｌｅｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）のマ
イルスΦサイエンティフィック・ディウ′イジョン（Ｍ
ｉｌｅｓＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）
から入手可能でありかつ米国特許第４，２９０，７７４
号において開示されかつフレイムされている方法に従っ
てウシ血清から調製されたコレステロール・コンセント
レイト・コード（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　　Ｃｏｎｃ
ｅｎｔｒａｔｅ　　Ｃｏｄｅ）８２−０１０は有用であ
る。バイオセル・ラボラトリーズ（Ｂｉｏｃｅｌｌ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能であるポビン
・コレステロール・コンセントレイト・リスト（Ｂｏｖ
ｉｎｅＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　　Ｌｉ５ｔ）３２００
は、他の有用な物質である。本発明の方法において有用
な好ましいコレステロールに富んだウシ分画は、次の工
程： （ａ）　　Ｍ状のコレステロールを含有するウシの血漿
または血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触さ
せてコレステロールを吸着させ、 （ｂ）　　吸着されたコレステロールを残りの液状の血
漿または血清から分離し、 （ｃ）　　吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解
し、 （ｄ）　　吸着されたコレステロールをｐＨ９、０〜１
１，５において溶離し、 （ｅ）　　溶離されたコレステロール溶液を限外濾過に
より濃縮し、 （ｆ）　　ｅｍされたコレステロール溶液のｐＨを１１
．０〜１１．４の範囲内の値に調節し、 （ｇ）　　６縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸
ナトリウムおよび水に対・して透析し。

（ｈ）　　透析したコレステロール溶液を限外濾過によ
り５０〜３０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさ
らに濃縮し、 （ｉ）　　濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．
０−１１．０の範囲内の値に調節 し、 （Ｄ　　濃縮されたコレステロール溶液を５０〜１００
℃に３０分〜２４時間加熱し、そして （ｋ）　　精製されたコレステロールに富んだウシ分画
をそれから回収する、 からなる方法によって調製される。

この特定の分画およびその生産の方法は、本出願人によ
る本願と同時に提出された同時係属米国特許出願第７３
２．８５６号において記載されかつフレイムされている
。

コレステロールに富んだ分画の生産に使用するための出
発物質は、コレステロールを含有するウシの任意の血漿
または血清またはその分画であることができる。好まし
い出発物質は、ウシ血清である。出発物質が血清である
とき、可溶性塩、例えば、クエン酸ナトリウムを０．２
５〜１．０のイオン強度に添加することが好ましい。他
の適当な塩は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、硫酸アンモニウムおよび硫酸ナトリウム
を包含する。可溶性塩をＬの濃度に添加すると、引続く
シリカ吸着工程において吸着されるコレステロールの量
は増加する。ウシ血漿は、通常、抗強固剤としてクエン
酸塩を添加することを包含する方法により集められる。

この塩の濃度は通常吸着１程のために１分であり、そし
て追加の塩は不必要である。

血漿または血清の出発物質を０〜５０℃、好ましくは２
０〜２５℃の温度に維持する。ｐＨは５．５〜９．０、
好ましくは７．０〜８．０の範囲に調節する。

本発明において有用なシリカあ吸着剤は臨界の組成をも
たない。適当なシリカ物質はカポット・コーポレーショ
ン（ｃａｂｏｔ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から商標
カポシル（ｃａｂｏｓｉｌ）で入丁可能な極微小シリカ
およびカリ−・カンパニー（ｃａｒｙ　　Ｃｏｍｐａｎ
ｙ）から商標エーロ’ｙル（Ａｅ　ｒ　ｏ　ｓ　ｉ　１
）３８０で入手可能な粉末状シリカである。このシリカ
は液状の血漿または血清に１〜５０／ｌ、好ましくは１
０〜２０ｇ／ｌの量で添加される。

液状の血漿または血清中のシリカの懸濁液は次いで約３
〜４時間混合する。次いで吸着したコレステロールを含
有するシリカを残りの液状の血漿または血清から好まし
くは遠心により分離し、モして液相を廃棄する。次いで
のシリカのペーストを一２０℃で凍結し、そしてこの温
度に少なくとも１週間、好ましくは２週間保持する。次
いで、凍結したペーストを室温（約２０〜２５℃）に２
４〜４８時間融解する。融解したペーストから絞り出さ
れる液体を廃棄する。

シリカのペーストを洗浄して存在するかも知れない望ま
しくない蛋白質を除去する。これは約０．１５モルの塩
化ナトリウムを含有する塩水溶液中にペーストを懸濁さ
せることによって達成される。他の有用な塩は酢酸ナト
リウムおよびリン酸ナトリウムである。この塩溶液はペ
ーストの重量の約２倍の量で使用する。ペーストを液体
から分離する。塩溶液を使用するこの洗浄手順は好まし
くは２回反復して吸蔵された蛋白質を除去する。

洗浄されたペーストを約２容量の脱イオン水または蒸留
水中に懸濁させ、そしてｐＨを９．０〜１１．５、好ま
しくは１０．４〜１Ｏ０６に適当なアルカリ性物質、例
えば、水性水酸化ナトリウムの添加により調節する。こ
の懸濁液を約２詩間攪拌し、その間ｐＨを上のアルカリ
性物質の周期的添加により所望水準に維持する。この処
理は所望のコレステロール分画をシリカから溶離する。

次いで、懸濁液を１２〜２４時間、好ましくは１２〜１
８時間沈降させる。コレステロール水準有する上澄み液
をさらに処理するためサイホンで取り出す。所望のコレ
ステロールに富んだ分画の生産のためのこの最初の溶離
のみを使用することが好ましい。しかし、上のアルカリ
性懸濁、溶離。

攪拌および沈降の工程を２回以上反復し、そして第１の
溶離物質とともに第２および第３の溶離からの＠濁液を
プールすることが可能である。シリカを廃棄する。

コレステロール溶液を濾過および遠心により清澄にして
微量のシリカを除去し、次いでその最初の体積の１５〜
５０％、好ましくは２０％に限外濾過技術により濃縮す
る。ＰＨはアルカリの添加により１１．０〜１１．４の
範囲の値、好ましくはｐＨ１１，２にＷＪｍする。これ
は引続く除去のために存在するかも知れない残留シリカ
の可溶化を促進する。

次いで、コレステロールの濃縮物を処理して存在する塩
の実質的にすべてを除去する。好ましい塩の除去技術は
順次に炭酸ナトリウムおよび水に対して透析することで
ある。この塩の除去工程は引続く熱処理工程のためのに
重要である。塩の有意な量の除去は加熱時のコレステロ
ールの望ましくない変性を起こすであろう。

透析したコレステロールの溶液を限外濾過により５０〜
３０００ｍｇ／ｄ　ｌ、好ましくは１０００〜２０００
　ｍ　ｇ　／　ｄ　Ｉのコレステロール水準に濃縮する
。

次いで、濃縮したコレステロールの溶液のｐＨを７．０
〜１１．０の生育、好ましくはｐＨ７。

６に調節して、それを生育培地中における引続く使用に
最も適合するようにさせる。

この溶液を５０〜１００℃、好ましくは８０℃に２０分
〜２４時間、好ましくは３０分〜６０分間加熱して、コ
レステロールの貯蔵安定性を増加する。この溶液を室温
に冷却し、そして滅菌症過しテ精製されたコレステロー
ルに富んだ分画を回収する。この生産物は純粋なコレス
テロールではなく、それは生産プロセスを通過した少量
の同定されない物質と混合物している。

純粋なコレステロールは、コレステロールに富んだウシ
分画により達成される方法でＴ、ｈｙ。

ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの生育に適切に影響を及ぼさな
いので、本発明における使用に不適当である。

Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅの細胞は、コレステ
ロールに富んだウシ分画を含有する培地中でこの分野に
おいてよく知られた条件下に生育させる。次いで、得ら
れる細胞をよ〈知られた方法においてホルマリン、メル
チオレイト（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）またはベーター
プロピオラクトンのような物質を使用して殺す０次いで
、細胞を収穫し、そして適当な担体媒質中に懸濁させて
所望のへクチリンを生産する。

へクチリンの活性は、アジュバントの使用によりさらの
増大することができる。本発明の方法により生産される
Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ互細胞とともに使用す
るために好ましいアジュバントは、米国特許第３，９１
９，４１１号において開示されかつフレイムされている
ポリアリルサツカリド（ｐｏｌｙａｌｌｙｌ　　５ａｃ
ｃｈａｒｉｄｅ）で架橋されたアクリル酸ポリマーと特
定の乳剤系との組み合わせである。このようなアジュバ
ントは、商標ＨＡＢＬＯＧＥＮでマイルス・ラボラトリ
ーズ番インコーポレーテッド（Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）のベイベット・ディウ゛
イジョン（ＢａｙｖｅｔＤ　ｉ　ｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ｏ　
ｎ）から市販されている。

上の方法で生産されたＴ、ｈｙｏｄ　　５ｅｎｔｅｒｉ
ａｅバクテリンは３週間の間隔でわずかに２回の投手で
筋肉内に注射して、豚の赤痢に対する豚の抵抗を有意に
増加することができることが発見された。

次の実施例により、本発明をさらに説明する。

実施例１ コレステロールに富んだウシ分画は、次のようにして調
製した。新鮮なウシ血清を２０〜２５℃の温度にし、そ
して１４．７ｇ／Ｉのクエン酸ナトリウム（０，５の血
清イオン強度）を添加した。生ずる溶液を３０分間攪拌
し、そしてｐＨを適当量のＩＮの水酸化ナトリウムの添
加により７．０とした。微細なシリカを１０　ｇ／　１
の量で添加し、そして生ずるスラリーを室温で３時１ｌ
Ｉｌ攪拌した。吸着した物質を含有するシリカを次いで
液相かも遠心により分離し、そして液体を廃棄した。シ
リカのペーストを一２０℃で凍結し、そしてその温度で
２週間貯蔵した０次いで、凍結したペーストを室温で４
８時間融解した。絞り出された液体を廃棄した０次いで
シリカのペーストを２容量の０．８５％（重量／容量基
準）の塩化ナトリウム水溶液（０，１４６モルのＮａＣ
ｌ）中に懸濁させた。それを１５分間おだやかに混合し
、そして少なくとも３時間沈降させた。Ｊ：澄み液をサ
イホンで除去し、そして廃棄した。この洗浄工程を２回
反復した０次いで、洗浄したペーストを２容量の脱イオ
ン水中にＦ！濁させた。ＰＨをＩＮの水酸化ナトリウム
の添加により１０．５に調節した。生ずる懸濁液を室温
で２時間攪拌し、その間ｐＨヲ１０　、５ニＪＷｊｌｉ
Ｌ；／：、　Ｊ！ｊｉ拌を停止Ｌ、モしてＬ澄み液を１
８時間沈降させた。Ｅ澄み液はサイホンで取り出し、そ
して濾過および遠心により清澄にした。シリカを廃棄し
た６次いで清澄にした溶液を限外濾過によりその最初の
体積の２０％に濃縮した。濃縮した物質のｐＨはＩＮの
水酸化ナトリウムの添加により１１．２に調節した。

次いで、濃縮した物質のｐＨを６容量の０．０１モルの
炭酸ナトリウムに対してｐＨ１１，２において透析した
。次いで、それを６容積の蒸留水に対して透析した。こ
の濃縮物のコレステロール水準を既知の技術により分析
し、そしてさらに１０００ｍ、ｇ／ｃｆｌのコレステロ
ール水準に限外濾過により濃縮した。次いで、ｐＨをＩ
Ｎの塩酸の添加により７．６に調節し、そして得られる
溶液を８０℃に１時間加熱した０次いで、この溶液な室
温に冷却し、滅菌濾過した０次いで、濾過した物質を精
製したコレステロールに富んだ分画として回収した。

Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣＮｏ、
３１２１２（７）凍結した種を、１３ｍ１のトリブチツ
ク・ンイ・ブロス（ＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙ　　Ｂｒｏｔ
ｈ）［デ４７　Ｄ　１１ラボラトリーズ（Ｄｆｆｃｏ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、２７．５ｇ／　ｌ］　
、１０％の子牛胎児血清、０．５％のデキストロース、
０．０５％の１−システィンＨＣＩおよび０．２５ｍｃ
ｇ／ｍｌのビタミンＢ−１２を含有するガラス管中に接
種した。このような百分率は重量／容量基準に基いた０
次いで、ガラス管をシールし、そして１０容敲％の水素
、８０容量％の窒素、ｌＯ容量％の二酸化炭素を含有す
る嫌気性雰囲気中↑３７℃において７２時間インキュベ
ーションした。次いで、得られる種を同一の培地を含有
する２本の管に移し、それらを３７℃で２４時間同一条
件下にインキュベーションした。これらの管の内容物を
プールした。次いで、プールした活性な種培養物の７ｍ
ｌの部分を、各々が２００ｍ１のトリブチツク・ソイ・
ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ　　Ｓｏｙ　　Ｂｒｏｔｈ）、
１％の酵母エキス、５％の子羊血清。

０．５％のデキストロース、０．０５％の１−システィ
ｙＨｃｌおよび０．２５ｍｃｇ／ｍｌのビタミンＢ−１
２を含有する２本の５００ｍ１容のびんの各々に添加し
た。このような百分率は重量／容置基準に基いた０次い
で、びんの内容物を記載する嫌気性雰囲気中で３７℃に
おいて、濁るまで（薬２４時ＨＲ）　、　インキュベー
ションした。

次いで生ずる膨張した種培養物を２つの部分に分け、そ
して各部分を単独で使用して、各々が７リツトルのトリ
ブチツク・ソイ・ブロス（Ｔ　ｒ　ｙｐｔｉｃ　　Ｓｏ
ｙ　　Ｂｒｏｔｈ）、１％の酵母エキス、３％の子羊血
清、１％のデキストロース、０．０５％の１−システィ
ンＨＣＩおよび０．２５ｍｃｇ／ｍｌのビタミｙＢ−１
２を含有する２つの１４リツトル容のパイロット発酵器
の一方に接種した。このような百分率は重量／容量基準
に基いた。発酵器の一方に２．５容量％の上のようにｍ
Ｗしたコレステロールに富んだウシ分画をさらに補充し
た０次いで、両者の発酵器を３７℃において４４時間玉
の嫌気性雰囲気下にインキュベーションした。ｐＨを５
Ｎの水酸化ナトリウムの周期的添加により６．５に調節
した。

上のインキュベーションが完結したとき、適当な試料を
各発酵器から取り、次いで発酵器の内容物を０．１５容
罎％のホルマリンで処理して細胞を不活性化した。細胞
の試料を顕微鏡検査し、合計の細胞の計数をペトロッフ
ーハウサー（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅｒ）計数室内
で測定し、そして生存しうる細胞の計数を新しく注いだ
５％のウシ血液寒天平板上で系統的に希釈することによ
って決定した。これらの血液寒天平板を３７℃において
５０容量％の水素および５０容量％あ二酸化炭素の嫌気
性雰囲気中で４日間インキュベーションした。Ｔ、ｈｙ
ｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅのコロニーを溶血の個々のゾ
ーンとして観察した。これらの実験の結果を表１に記載
する。

表１ 生存しう 合計の細　る細胞の 培地　　　題簿」ｌ東五−胞の計数　計数コレステ　ゆ
るいコイル　１．３Ｘ　　３．７Ｘロ一ル分画　状：比
較的に　ｔｏ９／　　１０’／を含まず　　長く薄い壁
の　ｍｌ　　　　ｍｌ細胞；全体的 に不活性 コレステ　緊密なコイル　２．６Ｘ　　１．４Ｘロ一ル
分画　状；より短　１０９　／　　１０９　／を含む　
　　く、より厚い　ｍｌ　　　　ｍｌ壁の細胞；活 性 上のデータから理解できるように、コレステロールに富
んだウシ分画の存在は合計の細胞の計数を二倍にし、生
存しうる細胞の計数を１００倍増加させ、そして細胞の
形態学に対して陽性の作用を示した。

実施例２ 次いで、との実施例１に記載するように調製したＴ、ｈ
ｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣＣＮｏ、３１２１２
種培養物を使用して、各々が２００ｍ１のトリブチツク
・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ　　Ｓｏｙ　　Ｂｒｏ
ｔｈ）を１％の酵母エキス、５％の子羊血清、０．０５
％の１−システィンＨｃ１および０．２５ｍｃｇ／ｍｌ
のビタミンＢ−１２と混合して含有する２本の５００　
ｍ　ｌ容のびんの各々に接種した。このような百分率は
重量／容量２＆準に基いた。びんの１つ（対照）は、０
．５容量％の実施例１に記載したようにして調製したコ
レステロールに富んだウシ分画を含有した。第２のびん
は、０．５容量％のマイルス・ラボラトリーズ・イ〉′
コーホレーテッド（ＭｉＩｅｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、Ｉｎｃ、）のコレステロール・コンセントレイ
ト・コード（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　　Ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｅ　　Ｃｏｄｅ）８２−０１０を含有した。第
３のびんは、２．５容量％のバイオセル・ラボラトリー
ズ（Ｂｉｏｃｅｌｌ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳ）の
ポビン・コレステロール・コンセントレイト・リスト（
Ｂｏｖｉｎｅ　　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　　Ｌｉ５ｔ
）３２００を含有した。次いで、これらの接種したびん
を１０容量％の水素、８０容量％の窒素、１０容量％の
二酸化炭素を含有する嫌気性雰囲気中で３７℃において
３８時間インキュベーションした。びんの内容物を２Ｎ
水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ７，０に２時間およ
び３１時間調節した。各びんから°の合計の細胞の計数
をペトロッフーハウサ−（Ｐｅｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｅ
ｒ）計数室内で測定した。結果を表２に示す。

入ヱ 旦生遣 培地の補充物　　　　合計の細胞の計数好ましいコレ ステロールに　　　２．５Ｘ１０９／ｍｌ富んだ分画 （対照） コレステロ− ル・コンセン ト　し　イ　ト　・　　　　　　　２．７Ｘ１０９／ｍ
ｌコード８２− ポビン・コレ ステロール・ コンセントレ　　　３．０Ｘ１０９．／ｍｌイト・リス
ト Ｌのデータから理解できるように、種々の源からのコレ
ステロールに富んだウシ分画を使用して望ましく高い細
胞計数ｃ７）Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを生産
することができる。

実施例３ 好ましいコレステロールに富んだ分画を補充した培地と
ともにＴ、ｈｙＯｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ旦菌株ＡＴＣＣ
Ｎｏ−３１２８７を使用して、実施例１のｆ順を全体的
に反復して、高い濃度の細胞を生産した。

実施例４ 実施例１に記載する方法において生育培地中に好ましい
コレステロールに富んだ分画を使用して調製した殺した
Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ旦廁胞と、米国特許第
３，９１９，４１１号に記載する１０容量％のＨＡＢＬ
ＯＧＥＮアジュバントおよび１：１０，０００のメルチ
オレイトと混合することによって、ワクチンまたはバク
テリンを調製した。このワクチンは２ｘｌ　０９ｍ胞／
ｍｌを含有した。次いで、このワクチンを５種類の別々
の対抗（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）研究において使用して、
このワクチンの豚の赤痢に対する作用を決定した。ワク
チン接種／対抗研究（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ　　５ｔｕｄ
ｉｅｓ）の各々において。

豚を豚の赤痢の経歴をもたない群れから入手し、そして
これらの豚は雌雄混合のものであり、そして一般にヨウ
クシャ−（Ｙｏ　ｒｋｓｈｉ　ｒｅ）、ハンプシャー（
Ｈａｍｓｈｉｒｅ）またはクロス（ｃｒ　ｏ　ｓ　ｓ）
の種であった。最初のワクチン接種の時、豚は離乳後少
なくとも３週間でありかつ体重８８．９〜１０１．６ｋ
ｇ（３５〜４０ボンド）のものであった。

すべてのワクチン接種／対抗の研究は、ワクチン接種し
た豚および対照の豚を分離することのできる隔離設備に
おいて実施した。豚に抗生物質を含有しない蛋白質の１
０分の食物の配給量（ｇｒｏｗｅｒ　　ｒａｔｉｏｎ）
をかえた。対抗前に、豚をレフタル・スワブ（ｒｅｃｔ
ａｌ　　ｓ　　ｗ　ａｂ）し、そして適当な単離培地」
二で試験後、Ｔ。

ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅおよびサルモネラ（Ｓａ
ｌｍｏｎｅ　Ｉ　Ｉａ）種を含有り、ナイコトカ示され
た。

実施例１に類似するが、最終の細胞を殺さないで生育さ
せたＴ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ菌株ＡＴＣＣＮ
ｏ、３１２１２または３１２８７で胃内で豚を対抗させ
た。対抗投与量は１０”〜１０９の有機体を含有するよ
うに希釈された１００ｍ１の活性培養物から成っており
、これを個々の豚に胃管を経由して４８時間の断食後に
投与した。

各対抗した豚を毎日の基準で対抗後２８日の観察期間に
わたって観察した。臨床的病気の開始後、赤痢の豚をレ
フタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌｓｗａｂ）して病原因子
を単離した。スワブ（ｓｗａｂ）をスペクチノマイシン
（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）血液寒天モ板上で継代
培養し、４０℃で４〜６日間インキュベーションし、モ
して溶血の寒天平板をスピロヘータの存在についてｍ微
鏡検査することによって、Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒ
ｉａｅの感染を確認した８、５種類の研究の間に死んだ
豚の各々を剖検した。巨視的な病変を記録し、そしてレ
フタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ　　ｓｗａｂ）を結腸か
ら取り、七のように車代培養した。

次の臨床学的指数を使用して、対抗に対する個々の豚の
臨床的応答を測定した： 〇−正常　　　　　〇−正常　　　〇−正常１−下痢　
　　　　１−粘液　　　ｌ−柔らかい？−赤痢　　　　
　２−血液およ　１，５−ゆる３−やせた　　　　び粘
液　　　　い ４−死にかけた　　３−血液　　　２−流動性５−死　
　　　　　　　　　　　３−木っぽい種々の分析法を使
用して、臨床学的指数を評価し、そして丁に定義する： ａ）　毎日の臨床学的指数（ＤＣＩ）−各対抗した豚に
ついての毎日の臨床学的指数 は、３つの上に記載したパラメーター：Ｄ（、Ｉ＝全全
体状態＋糞便の組成＋糞便ｂ）　の稠度 毎日の群の臨床学的指数（Ｉ）ＧＣＩ）−ワクチン接種
した群および対照群についての毎日の群の臨床学的指数
を次式に 従って計算した： ×　ｌ　０Ｏ Ｃ）　個々の累積臨床学的指数（ＩＣＣＩ）一対抗後２
８日の期間にわたる各豚についての個々の累積臨床学的
指数は、次のようにして計算した： ΣＤＣＩ（対抗後２８日の期間） ｄ）　群の累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）−ワクチン接
種した群および対照群についての群の累積臨床学的指数
は、豚の特定の群内でＩＣＣｌをモ均することによって
１すた　： １０匹の豚を等しく２つに室の中に分割した。

５匹のワクチン接種した豚に５ｍｌの前述のワクチンを
３週の間隔で２回筋肉内投与した。５匹のワクチン接種
しない豚を別な室内に保持した。促進剤投与（ｂｏｏｓ
ｔｅｒ）後２週に、すべての豚を毒性のＴ、ｈｙｏｄｙ
ｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣＣＮｏ、３１２１２で対抗さ
せた。

研究ＮＯ０２ ２９匹の豚を５室の２３匹のワクチン接種した豚および
２室の６匹の対照に分割した。ワクチン接種した豚に５
ｍｌの前述のバクテリ７を３週の間隔で２回筋肉内役ケ
した。対抗は研究Ｎｏ、１に記載するものと同一であっ
た。

研究ＮＯ６３ １０匹の豚を等しく２つに室の中に分割した。

５匹のワクチン接種した豚に５ｍｌの前述のバクテリ７
を３週の間隔で２回筋肉内投与した。５匹のワクチン接
種しない豚を別の室内に保持した。

促進剤投与後２週に、すべての豚を毒性のエユ１ｙｏｄ
ｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＡＴＣＣＮｏ、３１２８７で対抗
させた。

研究Ｎ００４ ４６匹の豚を９室の３６匹のワクチン接種した豚および
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５　ｍ　ｌの前述のバクテリ７を３
週の間隔で２回筋肉内投与した。対抗は研究Ｎｏ、３に
記載するものと同一であった。

研究Ｎ０１５ ４６匹の豚を９室の３６匹のワクチン接種した豚および
２室の１０匹のワクチン接種しない対照に分割した。ワ
クチン接種した豚に５　ｍ　ｌの前述の／ヘクテリンを
３週の間隔で２回筋肉内投与した。対抗は研究Ｎｏ、１
に記載するものと同一であった。

５種類の研究は合計１０５匹のワクチン接種した豚およ
び３６匹の対照を含んだ。５種類の研究の結果を表３お
よび４に要約する： 菌株ＡＴＣＣ３１２１２を用いる胃内の対抗後、臨床学
的赤痢はワクチン接種した豚の１７゜２％（６４匹のう
ち１１匹）および対照の豚の７１．４％（２１匹のうち
１５匹）において観察された。これはワクチン接種した
豚のうちの臨床学的赤痢の実際の場合の７５．９％の減
少を表わす、対抗後の２８日の観測の全期間について計
算した累積臨床学的指数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種し
た豚について１０．４であり、これに対してワクチン接
種したしない豚について８３．２であった。これは臨床
学的指数により測定して合計の臨床学的症候（Ｆ痢、赤
痢、やせること、死）の８７．５％の減少を表わす、死
はワクチン接種した豚において観察されず、こに対して
２１匹の対照のうち５匹は対抗後に死んだ（２３，８％
）、臨床学的赤痢の開始はワクチン接種した豚において
遅延され、そして臨床学的病気の期間は減少した。無食
欲は認められるようにワクチン接種した豚において減少
した。

菌株ＡＴＣＣ３１２８７を用いる胃内の対抗後、臨床学
的赤痢はワクチン接種した豚の３５゜４％（４１匹のう
ち１４匹、１匹の豚士）および対照の豚の７０．０％（
１５匹のうち１０匹、１匹の豚士）において観察された
。これはワクチン接種した豚のうちの臨床学的赤痢の実
際の場合の４９．４％の減少を表わす、累積臨床学的指
数（ＧＣＣＩ）はワクチン接種した豚について１８．６
であり、これに対してワクチン接種したしない豚につい
て７３．５であった。これは合計の臨床学的症候の７４
．７％の減少を表わす、死はワクチン接種した豚におい
て観察されず、こに対して１５匹の対照のうち２匹は対
抗後に死んだ（１３，３％）。臨床学的赤痢の開始はワ
クチン接種した豚において有意に遅延され、そして臨床
学的病気の期間は減少した。

臨床学的赤痢の病原性因子としてＴ、ｈｙｏｄｓｅｎｔ
ｅｒｉａｅの確認は、スペクチノマイシン血液寒天平板
上のレフタル・スワブ（ｒｅｃｔａｌ　　ｓｗａｂ）の
モ板培養後に、すべての場合において達成された。サル
モネラ（Ｓａｌｍ。

ｎｅｌｌａ）種の選択的培地Ｊ−の同時の平板培養は陰
性の結果を与えた。

死んだ豚の結腸の内容物は血液を含みかつ水っぽく、そ
して結腸自体は総体的に炎症しかつ絨毛を欠いていた６
剖検時に内壁から取ったレフタル・スワブ（ｒｅｃｔａ
ｌ　　ｓｗａｂ）は、Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａ
ｅにツイテ陽性でありかつサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ）種について陰性であった。対抗後２８日に保護
したワクチン接種した豚から取ったレクタルΦスワブ（
ｒｅｃｔａｌ　　ｓｗａｂ）は、スペクチノマイシン血
液寒天平板上で４２℃において継代培養後、すべての場
合において陰性であった。

すべての１４１匹のワクチン接種した豚および対照の豚
を考慮すると、５種類の対抗研究を通して臨床学的応答
の要約する表５を構成することができる。１０５匹のワ
クチン接種した豚のうち２５．５匹は臨床学的赤痢を発
現しく２４．３％）、これに対して３６匹のワクチン接
種しない豚のうちの２５．５匹は臨床学的赤痢を発現し
た（７０．８％）。これはすべてのワクチン接種した豚
のうちの臨床学的赤痢の６５．７％の減少を表わす。３
６匹の対照の豚の７匹は対抗後に死に（１９，４％）、
これに対してワクチン接種した豚は死ななかった。すべ
ての１０５匹のワクチン接種した豚についての群の累積
臨床学的指数は１３．６であり、そして３６匹のワクチ
ン接種しない豚についてのＧＣＣＩは７９．２であった
。これはすべてのワクチン接種した豚のうちの合計の臨
床学的症候（下痢、赤痢、やせること、死）の８２．８
％の減少を表わす。

５種類の個々の研究からのワクチン接種／対抗の結果を
考慮すると、Ｔ、ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅバクテ
リンは、豚の赤痢の予防の条件下で表面するとき、明確
な効能の程度を示であろうと結論することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、栄養培地がコレステロールに富んだウシ分画を含有
   することを特徴とする得られた細胞をバクテリン中にお
   いて引続いて使用するために￥トレポネマ・ハイオジセ
   ンテリアエ￥（￥Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｈｙｏｄｙｓｅ
   ｎｔｅｒｉａｅ￥）を適当な栄養培地中で生育させる方
   法。 ２、コレステロールに富んだウシ分画が、次の工程： （ａ）液状のコレステロールを含有するウシの血漿また
   は血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させて
   コレステロールを吸着させ、 （ｂ）吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿ま
   たは血清から分離し、 （ｃ）吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解し、 （ｄ）吸着されたコレステロールをｐＨ９．０〜１１．
   ５において溶離し、 （ｅ）溶離されたコレステロール溶液を限外濾過により
   濃縮し、 （ｆ）濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを１１．０
   〜１１．４の範囲内の値に調節し、 （ｇ）濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナト
   リウムおよび水に対して透析し、 （ｈ）透析したコレステロール溶液を限外濾過により５
   ０〜３０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさらに
   濃縮し、 （ｉ）濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．０〜
   １１．０の範囲内の値に調節し、 （ｊ）濃縮されたコレステロール溶液を５０〜１００℃
   に３０分〜２４時間加熱し、そして （ｋ）精製されたコレステロールに富んだウシ分画をそ
   れから回収すること、 からなる方法によって調製される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、栄養培地が０．１〜５．０容量％のコレステロール
   に富んだウシ分画を含有する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４、栄養培地が１〜２．５容量％のコレステロールに富
   んだウシ分画を含有する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５、栄養培地が２．５容量％のコレステロールに富んだ
   ウシ分画を含有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、栄養培地が１〜２．５容量％のコレステロールに富
   んだウシ分画を含有し、前記コレステロールに富んだウ
   シ分画は、次の工程： （ａ）液状のコレステロールを含有するウシの血漿また
   は血清あるいはその分画をシリカの吸着剤と接触させて
   コレステロールを吸着させ、 （ｂ）吸着されたコレステロールを残りの液状の血漿ま
   たは血清から分離し、 （ｃ）吸着されたコレステロールを凍結しかつ融解し、 （ｄ）吸着されたコレステロールをｐＨ１０．４〜１０
   ．６において溶離し、 （ｅ）溶離されたコレステロール溶液を限外濾過により
   出発容量の１５〜５０％の容量に濃縮し、 （ｆ）濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを１１．２
   の値に調節し、 （ｇ）濃縮されたコレステロール溶液を順番に炭酸ナト
   リウムおよび水に対して透析し、 （ｈ）透析したコレステロール溶液を限外濾過により１
   ０００〜２０００ｍｇ／ｄｌのコレステロール水準にさ
   らに濃縮し、 （ｉ）濃縮されたコレステロール溶液のｐＨを７．６の
   値に調節し、 （ｊ）濃縮されたコレステロール溶液を８０℃に３０〜
   ６０分間加熱し、そして （ｋ）精製されたコレステロールに富んだウシ分画をそ
   れから回収すること、 からなる方法によって調製される特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１項記載の方法により生産された
   ￥トレポネマ・ハイオジセンテリアエ￥（￥Ｔｒｅｐｏ
   ｎｅｍａ　ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ￥）バクテリ
   ン。 ８、特許請求の範囲第２項記載の方法により生産された
   ￥トレポネマ・ハイオジセンテリアエ￥（￥Ｔｒｅｐｏ
   ｎｅｍａ　ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ￥）バクテリ
   ン。 ９、約２×１０＾９細胞／ｍｌを含有する特許請求の範
   囲第７項記載のバクテリン。 １０、ポリアリルサッカリドで架橋されたアクリル酸ポ
   リマーと乳剤系との組み合わせから成るアジュバントと
   混合された特許請求の範囲第７項記載のバクテリン。