CN105603125B - 一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒及其检测方法，属于光谱学和分子诊断领域。本发明采用盐酸羟胺络合法制备的银溶胶作为拉曼增强试剂，银溶胶以一定比例与待测物品混合均匀后，滴在石英片上，待自然风干后，使用SmartRaman Ocean5pro便携式拉曼光谱仪进行拉曼检测，所获得的拉曼光谱通过主成分分析和线性判别分析后，实现对目标病原体的定性的检测。所述检测试剂盒操作简便、灵敏度高，具有良好的应用前景。

Description

一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于光谱学和分子诊断领域，特别涉及一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)，俗称亚洲鸡瘟，可引起鸡群腹泻、呼吸困难及神经症状。禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)包括多个亚型，其中H5亚型禽流感病毒能够引起禽群大量发病和死亡，被世界动物卫生组织列为A类传染病，受到高度重视。积极监测和控制新城疫病毒和禽流感病毒在禽群中的传播，不仅能够减少养殖业的损失，还能在很大程度上降低禽流感病毒从禽群传播给人的风险，有重要的公共卫生安全意义。
目前实验室检测手段主要有病原学检测、病原血清学检测、免疫分析方法和分子生物学检测方法。病毒的分离鉴定是确诊本病最确切、最具公信力的方法，但是实验操作步骤较为冗杂，需时较；免疫分析方法中酶联免疫吸附试验技术，即ELISA，是目前抗原抗体检测领域中，应用最为广泛的免疫学检测方法，具有较高的特异性和敏感性，但是价格较为昂贵；荧光定量RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)技术具有高度的敏感性和特异性，并且可大大缩短对病毒的检出时间，克服了常规血清学诊断方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，为早期快速诊断病毒提供了敏感、快速、实用的检测方法，但是步骤较为复杂，需要提供相应的实验室设备。因此亟待建立一种操作简单，快速，灵敏，无损的高通量的检测方法。
表面增强拉曼光谱散射(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)是指当某些分子吸附到具有纳米粗超度的贵金属表面时，在这些粗超得到的拉曼散射信号就会别增强上百万倍，甚至更高。由此得到的光谱被称为“表面增强拉曼光谱”。相比其他光谱而言，如荧光光谱，红外光谱等，表面增强拉曼光谱具有灵敏度高、谱带窄、抗光漂白、不受水的干扰等特点，并且能够实现快速、实时、无损检测，因此非常适用于生物医学的研究。
发明内容
为克服现有的检测技术需要昂贵的仪器配备专业技术人员的问题，本发明的首要目的在于提供一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒。所述的检测试剂盒采用表面增强拉曼光谱技术，提供有一种操作简便、灵敏度高的检测病毒的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的检测方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒，包括金属溶胶液，石英片和拉曼光谱仪。
所述的金属溶胶液为金溶胶液或银溶胶液。
所述的银溶胶的制备方法如下：常温下将2.5mL 10-2mol/L AgNO3加入到75mL蒸馏水中，加入5mL of 10-2mol/L巯基乙酸；搅拌10min后滴入2.5mL10-2mol/L NaI，搅拌20min后，得到浅绿色的AgI溶胶，加入20mg NaBH4还原，继续搅拌约10min，生成黄褐色银溶胶，得到的是形状均一的球形粒子，平均粒径约35nm，浓度约为120μg/mL。
所述的石英片为波数范围是700-2000cm-1无明显拉曼峰的基底石英片；
所述的石英片亦可有玻璃片代替。
所述的拉曼光谱仪为SmartRaman Ocean5pro便携式拉曼光谱仪。
所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm，激光功率为15-120mW、积分时间为1-10s、波数范围是700-2000cm-1。
应用上述试剂盒进行禽病病毒的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测样品与金属溶胶液以1:2～3:1比例混匀；
2)取2～5μL步骤1)混匀后的样品滴石英片上，自然风干；
3)对石英片上形成的圆点状样品进行拉曼检测，拉曼仪器为SmartRamanOcean5pro便携式拉曼光谱仪。测试的参数为：功率为15～120mW，积分时间为1～10s，激发波长为785nm；
4)记录谱图，通过主成分分析和线性判别分析对两种病毒进行建模分类；
5)判断结果。
上述检测方法的检测环境温度在4～40℃。
上述病毒一般是内部具有核酸(DNA或RNA)，外面具有衣壳的蛋白，最外层具有囊膜或者无囊膜结构。
所述的禽病病毒包括新城疫病毒、禽流感病毒等其他禽类病毒。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明建立一种快速检测禽病病毒的方法及检测试剂盒。该方法易操作、特异性强，耗时短，能快速检测出禽病病毒的拉曼光谱图，经主成分分析和线性判别分析等化学计量方法可以明显区分不同的禽病病毒，为快速检测禽病病毒提供了光学谱图的依据，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明的GM毒株与H5N6毒株的拉曼光谱结果图。
图2是本发明GM毒株和H5N6毒株拉曼光谱图PCA-LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)二维处理图。
图3是本发明GM毒株和H5N6毒株拉曼光谱图PCA-LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)三维处理图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明使用的样品为禽流感病毒H5N6毒株(A/Oriental Magpie-robin/Guangdong/SW8/2014(H5N6)，基因库号：KT454936)、新城疫病毒GM毒株(基因库号：DQ486859)，毒株由广东省华南农业大学禽病教研室提供。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明提供了一种快速检测禽病病毒的检测试剂盒，包括金属溶胶液，石英片和拉曼光谱仪。
所述的金属溶胶液为银溶胶液。
所述的银溶胶的制备方法如下：常温下将2.5mL 10-2mol/L AgNO3加入到75mL蒸馏水中，加入5mL of 10-2mol/L巯基乙酸。搅拌10min后滴入2.5mL10-2mol/L NaI，搅拌20min后，得到浅绿色的AgI溶胶，加入20mg NaBH4还原，继续搅拌约10min，生成黄褐色银溶胶，得到的是形状均一的球形粒子，平均粒径约35nm，浓度约为120μg/mL。
所述的石英片为波数范围是700-2000cm-1无明显拉曼峰的基底石英片。
所述的拉曼光谱仪为SmartRaman Ocean5pro便携式拉曼光谱仪。
所述的拉曼光谱仪检测条件为：激光波长785nm，激光功率为100mW、积分时间为3s、波数范围是700-2000cm-1。
应用上述试剂盒进行禽病病毒的检测方法，包括以下步骤：
1)将待测样品(分别包括新城疫病毒、禽流感病毒)与金属溶胶液(本实施案例以银溶胶为例)以1:2～3:1比例混匀；
2)取2～5μL步骤1)混匀后的样品滴石英片上，自然风干；
3)对石英片上形成的圆点状样品进行拉曼检测，拉曼仪器为SmartRamanOcean5pro便携式拉曼光谱仪,测试的参数为：功率为15～120mW，积分时间为1～10s，激发波长为785nm；
4)记录谱图，通过主成分分析和线性判别分析对两种病毒进行建模分类；
5)判断结果。
检测结果如图1-图3所示，图1是本发明的GM毒株与H5N6毒株的拉曼光谱结果图。图1a为GM毒株的拉曼图，1b为H5N6毒株的拉曼图。两图主要的峰带1206cm-1(Tyr),1130cm-1υ(C-C),1003cm-1(Phe),885cm-1(Gly),635cm-1(Tyr)和592cm-1(Gly)均归属于氨基酸、蛋白质和核酸的分子。阴影部分①②③④为GM毒株与H5N6毒株在拉曼谱图中主要的差异峰位。由此可见，GM毒株与H5N6毒株的拉曼光谱存在明显的差异，可根据差异进行主成分和线性判别分析，以建立判别这两种病毒的数学模型。
主成分分析结合线性判别分析结果如图2-图3所示，图2是本发明GM毒株和H5N6毒株拉曼光谱图PCA-LDA(Principal components analysis-linear discriminateanalysis)二维处理图。由图可知星形代表GM毒株样品(30个)，圆点代表H5N6毒株样品(24个)。根据所有样品的谱图信息计算各主成分的得分，由主要成分1和主要成分2及线性分析法作图，得到两种病毒二维图上的PCA-LDA曲线，由图可知拉曼光谱结合PCA-LDA判别正确率H5N6达到86％(20/24)，GM达到100％(30/30)。
图3是本发明GM毒株和H5N6毒株拉曼光谱图PCA-LDA(Principal componentsanalysis-linear discriminate analysis)三维处理图。由图可知星形代表GM毒株样品(30个)，圆点代表H5N6毒株样品(24个)。根据所有样品的谱图信息计算各主成分的得分，由主要成分1、主要成分2和主要成分3及线性分析法作图，得到两种病毒三维图上的PCA-LDA曲线，由图可知拉曼光谱结合PCA-LDA判别正确率100％。
由此可见，使用银溶胶作为表面拉曼增强剂，可以快速、准确区分H5N6毒株和GM毒株。对于临床快速鉴别诊断这两种烈性传染病具有重大意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种银溶胶在制备检测禽病病毒试剂盒中的应用，其特征在于：所述检测试剂盒包括金属溶胶液，石英片和拉曼光谱仪；
所述的金属溶胶液为银溶胶液；
所述禽病病毒为禽流感病毒或者新城疫病毒；所述的银溶胶的制备方法如下：常温下将2.5mL 10-2mol/L AgNO3加入到75mL蒸馏水中，加入5mL 10-2mol/L巯基乙酸；搅拌10min后滴入2.5mL 10-2mol/L NaI，搅拌20min后，得到浅绿色的AgI溶胶，加入20mg NaBH4还原，继续搅拌约10min，生成黄褐色银溶胶，得到的是形状均一的球形粒子；
所述试剂盒的应用包括以下步骤：
1)将待测样品与金属溶胶液以1:2～3:1比例混匀；
2)取2～5μL步骤1)混匀后的样品滴石英片上，自然风干；
3)对石英片上形成的圆点状样品进行拉曼检测，拉曼仪器为SmartRaman Ocean5pro便携式拉曼光谱仪,测试的参数为：功率为15～120mW，积分时间为1～10s，激发波长为785nm；
4)记录谱图，通过主成分分析和线性判别分析对两种病毒进行建模分类；
5)判断结果。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的石英片为波数范围是700-2000cm-1无明显拉曼峰的基底石英片。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的石英片为玻璃片。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测环境温度在4～40℃。
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