CN105603015B - 一种l-草铵膦的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种L‑草铵膦的生产方法，该方法包括：以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，在氨基供体存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨基供体发生转氨反应，得到L‑草铵膦；所述氨基供体为丙氨酸，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。本发明以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，丙氨酸为氨基供体，通过特定的转氨酶催化底物发生转氨反应，能够将底物完全转化成为L‑草铵膦，原料转化率高，转化率可达100％。

Description

一种L-草铵膦的生产方法
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种L-草铵膦的生产方法；具体地说是一种生物酶法生产光学纯L-草铵膦的方法。
背景技术
草铵膦，英文名为：Phosphinothricin(简称PPT)，一般是指化合物2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸或其与碱性化合物形成的盐。草铵膦是由赫斯特公司于80年代开发的(后归属于拜耳公司)广谱触杀型除草剂，属于膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，在叶子内转移，但不能转移到别处，谷氨酰胺合成受抑制后，导致铵离子累积，叶绿体解体，从而使光合作用受抑制，最终导致植物死亡。
草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦(式2)和D-草铵膦(式3)。但只有L-型具有植物毒性，除草活性为外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。
目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的纯光学异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低使用成本、减轻环境压力都具有重要意义。
制备光学纯L-草铵膦的方法主要有三种：化学合成法、手性拆分法以及生物催化法。
化学合成法从手性原料出发合成光学纯L-草铵膦，多见于实验室研究中，如Minowa N等利用甘氨酸为起始原料合成L-草铵膦(Hirayama M.Asymmetric Synthesis of(+)-Phosphinothricin and Related Compounds by the Michael Addition of GlycineSchiff Bases to Vinyl Compounds[J].Bulletin of the Chemical Society of Japan,1987,60:1761–1766.)。Zeiss H J等对L-草铵膦的不对称合成做了很多尝试(Enantioselective Synthesis of Both Enantiomers of Phosphinothricin viaAsymmetric Hydrogenation ofα-acylamidoAcrylates[J].Journal of OrganicChemistry,1991,56:1783–1788.)，(Enantioselective Synthesis of L-Phosphinothricin from L-methionine and L-glutamic Acid via L-vinylglycine[J].Tetrahedron,1992,48(38):8263–8270.)。不对称合成法工艺步骤多、收率低，所用不对称合成试剂大多比较昂贵，导致生产成本偏高，不利于大规模制备L-草铵膦。
手性拆分法是通过化学合成外消旋DL-草铵膦或其衍生物，再利用手性拆分试剂，进行D型和L型异构体的分离，从而制得光学纯的L-草铵膦。此工艺主要存在以下缺点，一是需要使用手性拆分试剂，二是D-草铵膦需要重新消旋再利用，三是单次拆分收率低，四是工艺比较复杂。
相比之下，生物催化法具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高及产物易分离纯化等优点，是生产L-草铵膦的潜在优势方法。
早在研究草铵膦在土壤微生物体内的代谢途径时就已经发现，L-草铵膦在转氨酶的作用下，发生转氨作用被分解成一种α-酮酸——2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)。转氨作用是一个可逆反应，2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸可在转氨酶的催化下通过逆反应生成L-草铵膦。
国际上，Schulz A等人(Stereospecific Production of the HerbicidePhosphinothricin(glufosinate)by Transamination:Isolation and Characterizationof a Phosphinothricin-specific Transaminase from Escherichia coli[J].Appliedand Environmental Microbiology,1990,56:1-6.)(美国专利US5221737)早在上世纪90年代就利用从E.coli K-12中分离到的转氨酶，以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，L-谷氨酸作为氨基供体，催化转氨反应生产L-草铵膦(图1)。转氨酶经固定化后安装至生物反应器，产物浓度可达76.1g/L，最高产率为50g/(L·h)，L-草铵膦的ee值超过99.9％。但这个工艺有两大缺陷，其一是原料PPO不能完全转化为L-PPT，转化率最高只有90％；其二是要使可逆反应向生成L-PPT的方向进行，需要4倍当量以上的L-谷氨酸作为氨基供体，过量的谷氨酸给分离带来了很大的麻烦，问题的关键在于以L-谷氨酸作为氨基供体时酶促转氨反应是一个可逆反应。
解决这一问题的途径之一就是利用L-天冬氨酸代替L-谷氨酸，L-天冬氨酸经转氨作用后生成草酰乙酸，草酰乙酸在水溶液中不稳定、易分解为丙酮酸，从而打破了转氨反应的平衡。鉴于此，Bartsch K(美国专利US6335186 B1)在上述单酶反应体系下，增加一个草酰乙酸转氨酶，组成双转氨酶偶联反应体系(图2)。然而，在偶联反应中仍然需要使用谷氨酸，谷氨酸与酮戊二酸的在反应中形成平衡，其结构又与产品L-PPT极为类似，难以在分离纯化中加以去除；而且还增加了两种需要分离的杂质草酰乙酸和L-天冬氨酸。此外，由于动力学参数的不同，使用两种酶的过程比使用1种酶的更加难以最佳化。因此，在此工艺中PPO的转化率也只有85％。
Bartsch K等随后在中国申请的专利(中国专利CN1349561A)中又提出了一条新工艺(如图3)，他们筛选得到了能够特异性地转化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸的草酰乙酸转氨酶，直接利用L-天冬氨酸为氨基供体。但此工艺效率低下，当底物PPO的浓度为552mmol/L、在几乎完全消耗大约700mmol/L的原料L-天冬氨酸的情况下，只生成251.9mmol/L的产物L-PPT，与此同时生成了大约234.5mmol/L的杂质丙氨酸。原料PPO反应转化率只有52％。
发明内容
本发明针对现有转氨酶法生产L-PPT工艺存在的缺陷，提供了一种L-草铵膦的生产方法，该方法原料转化率高、生产成本低、收率高。
一种L-草铵膦的生产方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，在氨基供体存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦；所述氨基供体为丙氨酸，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
其中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的转氨酶来源于大肠杆菌K12W3110(E.coliK12W3110)。氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的转氨酶来源于枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtis 168)。氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的转氨酶来源于巨大芽孢杆菌YYBM1(Bacillus magaterium YYBM1)。
作为优选，所述细胞为表达转氨酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coliBL21(DE3)，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
具体地，所述工程菌含有表达载体pET-28a(+)，所述转氨酶基因连接在表达载体pET-28a(+)上。
上述生产L-草铵膦的生物催化反应不仅可以采用表达转氨酶的工程菌，还可以采用细胞破碎后的离体转氨酶，或者是经固定化后的转氨酶。
作为优选，转氨反应中，10000rpm离心10min后的湿重计，所述工程菌的添加量为反应液重量的0.5～25％。更优选，所述细胞的添加量为反应液重量的5～10％。
作为优选，所述丙氨酸与底物的摩尔比为1～6:1；更优选，所述丙氨酸与底物的摩尔比为2～4:1。
反应体系中还包括辅酶，该辅酶为维生素B6类型辅酶，例如，吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺或它们的衍生物。具体地，所述辅酶为磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺；以质量分数计，所述辅酶的添加量为0.01～2‰；更优选，0.1～1‰。
作为优选，所述转氨反应的温度为20～70℃，时间为6～72小时；更优选，温度为30～60℃，时间为12～36小时。
作为优选，控制转氨反应的pH值为6～9。采用碱进行pH的调节，如：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、异丙胺、三乙胺等。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，丙氨酸为氨基供体，通过特定的转氨酶催化底物发生转氨反应，能够将底物完全转化成为L-草铵膦，原料转化率高，转化率可达100％。
(2)本发明方法简化了分离工艺，反应完成后，过量的丙氨酸易于与产品L-草铵膦分离；与此同时，副产物丙酮酸是众多生化反应的中间物，很容易经过酶促反应转变为其他物质，从而进一步简化了后续精制工艺，提高了产品总收率。
(3)本发明原料易得且成本低廉，过量的原料还可回收再利用，环保压力小，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为以谷氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。
图2为双转氨酶体系生产L-PPT的反应式。
图3为以天冬氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。
图4为本发明以丙氨酸为氨基供体生产L-PPT的反应式。
图5为本发明涉及的反应物和产物(反应过程中)的高效液相检测图谱；
其中，1：保留时间3.572min为L-丙氨酸；2：保留时间:4.673min为丙酮酸；
3：保留时间:5.483min为未知杂质；4：保留时间:6.567min为L-PPT；5：保留时间::26.441min为PPO。
图6为本发明涉及的反应物和产物(反应结束后)的高效液相检测图谱；
其中，1：保留时间3.569min为L-丙氨酸；2：保留时间:4.673min为丙酮酸；3：保留时间:5.481min和5.727min为未知杂质；4：保留时间:6.560min为L-PPT；
图7为原料2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的质谱图；
其中，A图为PPO的正源质谱图；B图为PPO的负源质谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
上游基因工程所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶和DNA连接酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、质粒pET-28a(+)等购自Novagen公司；DNA marker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂：2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)为实验室合成，其质谱图如图7所示；L-草铵膦标准品购自Sigma-Aldrich公司；其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸(简称PPO)的结构式如式(1)所示；L-草铵膦(简称L-PPT)的结构式如式(2)所示；具体如下：
本发明转氨反应通过高效液相色谱(HPLC)监测反应的进行，并对各个反应物和产物进行分析。HPLC分析方法为：液相色谱仪：Agilent 1100；色谱柱型号：XB-SAX,5μm,4.6mm×250mm。流动相：100mM磷酸二氢钾水溶液:乙腈＝10：1。检测波长：205nm。流速：1.0mL/min。柱温：40℃。具体各相关物质出峰情况见液相色谱图。
实施例1
一、分别从大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1基因组中克隆转氨酶基因，根据相应基因组DNA序列(GenBank登录号分别为CP012868.1、CP010052.1和CP001982.1)设计相应的PCR上游引物和下游引物。
来源于E.coli的转氨酶的引物：
EC-F序列：5’-CCGGAATTCATGAGCAACAATGAATTCCATC-3’(EcoRI)
EC-R序列：5’-CCGCTCGAGTTAATCGCTCAGCGCATCC-3’(XholI)
来源于Bacillus Subtilis的转氨酶的引物：
BS-F序列：5’-CCCGAGCTCATGAGTCAAACAACAGCAAGCATCA-3’(SacI)
BS-R序列：5’-CCCAAGCTTTTAAGCTCGCAGGCCCGCCT-3’(HindIII)
来源于Bacillus magaterium的转氨酶的引物：
BM-F序列：5’-CGCGGATCCATGAGTCAAACTTTTAGCAA-3’(BamHI)
BM-R序列：5’-CCCAAGCTTTTACACTTCAACCGTTTGCT-3’(HindIII)
在上、下游引物中分别加入限制性酶切位点，如下划线所示，具体限制酶见引物序列括号内。分别以大肠杆菌E.coli K12W3110、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168以及巨大芽孢杆菌Bacillus magaterium YYBM1基因组DNA为模板，相应的上下游引物进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件如下：
PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
1)预变性：95℃5min；
2)变性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循环30次；
3)延伸：72℃10min；
4)4℃保存2.0h。
PCR扩增结束后，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小为1400bp左右。用DNA回收纯化试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
二、表达载体和工程菌的构建
表达载体pET-28a(+)和PCR扩增产物分别用相应的限制性内切酶进行双酶切。酶切完成后用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化回收以去除限制性内切酶和酶切下来的核苷酸小片段。双酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶将其连接至具有相对应切口的表达载体pET-28a(+)上，连接体系如下表1所示：
表1pET-28a(+)-gabT重组表达质粒连接体系
将上述连接体系中的各试剂进行混合后，放于16℃金属浴中连接12h。将酶连产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，涂平板、挑单菌落LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并由测序公司来验证***序列的正确性。再将重组表达载体转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，用PCR法来验证转化的重组子，验证后无误的基因工程菌即为E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-gabT。
实施例2
一、微生物的培养
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
将含有转氨酶基因的基因工程菌E.coli BL21(DE3)接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。转接至500mL同样含50μg/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其浓度为0.3mM，28℃下诱导培养20h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-70℃超低温冰箱中保存，待用。
二、粗酶液的制备
将培养结束后收集到的菌体，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)的缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于Tris-HCl(50mM，pH 7.5,20mM咪唑,0.3M NaCl,5mM二硫苏糖醇)缓冲液中，超声破碎菌悬液，离心去除沉淀，得到的上清为含转氨酶的粗酶液。
实施例3
定量称取PPO、丙氨酸和磷酸吡哆醛至烧杯中混合，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，加到容量瓶中，用去离子水定容，得到PPO终浓度为60mM，丙氨酸终浓度为180mM，磷酸吡哆醛终浓度为1mM的混合液。
培养能够表达SEQ ID NO.1所示转氨酶(来源于大肠杆菌E.coli K12W3110)的基因工程菌，取1mL培养液，10000rpm离心10min，弃上清，得到细胞5mg；加入到1mL上述获得的混合液中，重悬，于37℃金属浴振荡反应器内反应24h。
反应结束后，进行HPLC检测，有L-草铵膦生成，但未发现明显的PPO峰，说明PPO转化率达到100％。
定量称取PPO、丙氨酸和磷酸吡哆醛至烧杯中混合，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，加到容量瓶中，用去离子水定容，得到PPO终浓度为60mM，丙氨酸终浓度为180mM，磷酸吡哆醛终浓度为1mM的混合液。
将含有SEQ ID NO.4所示的谷丙转氨酶编码基因的基因工程菌培养结束后，取1mL培养液离心，弃上清。加入上述含PPO 60mM，丙氨酸180mM以及磷酸吡哆醛1mM的溶液1mL，重悬，于37℃金属浴振荡反应器内反应一个星期，每隔24小时取样分析，HPLC检测，未发现明显的L-草铵膦生成，说明此转氨酶对这个反应无催化效果。
实施例4
培养能够表达SEQ ID NO.2所示转氨酶(来源于枯草芽孢杆菌168(Bacillussubtis 168))的基因工程菌，将离心收集到的细胞5g，制成粗酶液。
定量称取PPO到圆底烧瓶中，用30％氨水调节溶液pH＝8.0，加入上述粗酶液，使PPO的终浓度为80mM，再加入280mM的丙氨酸和1mM的磷酸吡哆醛，用去离子水定容到50mL。通过水浴控制反应温度为40℃；磁力搅拌，HPLC监测反应，反应时间为28h。
反应过程数据如下：
反应时间(h) 丙酮酸(mM) L-PPT(mM) PPO(mM)
0 0.0 0.0 80.0
0.5 0.2 7.1 73.2
1.5 0.9 19.2 61.3
3.0 2.0 20.8 60.4
6.0 16.1 50.9 49.7
24.0 21.4 70.1 10.5
28.0 17.4 80.5 0.0
实施例5
培养能够表达SEQ ID NO.3所示转氨酶(来源于巨大芽孢杆菌YYBM1(Bacillusmagaterium YYBM1))的基因工程菌，离心收集细胞。
定量称取PPO到100mL反应器中，用30％氨水调节溶液pH＝9.0，用去离子水定容到100mL，使PPO的终浓度为100mM，再加入25g上述离心收集的细胞，再加入400mM的丙氨酸和1mM的磷酸吡哆醛。通过水浴控制反应温度为50℃；磁力搅拌，HPLC检测PPO转化情况，反应时间为19h。反应数据如下：
反应时间(h) 丙酮酸(mM) L-PPT(mM) PPO(mM)
0 0.0 0.0 100.0
0.5 61.2 84.1 16.8
1.5 51.5 86.6 13.5
3.0 42.4 98.2 1.1
6.0 37.3 100.6 0.9
19.0 34.8 100.2 0.0
对比例1
培养能够表达SEQ ID NO.3所示转氨酶(来源于巨大芽孢杆菌YYBM1(Bacillusmagaterium YYBM1))的基因工程菌，离心收集细胞。
定量称取PPO到100mL反应器中，用30％氨水调节pH＝9.0，用去离子水定容，使PPO的终浓度为100mM，在加入25g上述离心收集的细胞，再加入400mM的谷氨酸和1mM的磷酸吡哆醛。通过水浴控制反应温度为50℃；磁力搅拌，HPLC检测PPO转化情况，反应时间为72h。反应数据如下：
反应时间(h) α酮戊二酸(mM) L-PPT(mM) PPO(mM)
0 0.0 0.0 100.0
0.5 39.2 40.1 59.7
1.5 51.5 46.6 53.5
3.0 62.4 69.2 28.4
6.0 77.3 79.1 20.8
19.0 74.8 80.2 19.7
72.0 74.0 80.3 19.4
对比例2
定量称取PPO、丙氨酸和磷酸吡哆醛至烧杯中混合，用30％氨水调节溶液pH＝7.5，加到容量瓶中，用去离子水定容，得到PPO终浓度为60mM，丙氨酸终浓度为180mM，磷酸吡哆醛终浓度为1mM的混合液。
培养能够表达SEQ ID NO.4所示谷丙转氨转氨酶(来源于大肠杆菌K12MG1655(E.coli K12MG1655))的基因工程菌，制成粗酶液；取1mL粗酶液离心，弃上清，得到细胞5mg；加入到1mL上述获得的混合液中，重悬，于37℃金属浴振荡反应器内反应一个星期，每隔24小时取样分析，HPLC检测，未发现明显的L-草铵膦生成，说明此转氨酶对这个反应无催化效果。

Claims (8)

1.一种L-草铵膦的生产方法，包括：以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸及其盐为底物，在氨基供体存在的条件下，利用离体的转氨酶或体外表达转氨酶的细胞催化底物与氨基供体发生转氨反应，得到L-草铵膦；其特征在于，所述氨基供体为丙氨酸，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3所示。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述细胞为表达转氨酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述细胞的添加量为反应液重量的1～15％。
4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述丙氨酸与底物的摩尔比为1～6:1。
5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，反应体系中存在辅酶，所述辅酶为磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺。
6.如权利要求5所述的生产方法，其特征在于，以质量分数计，所述辅酶的添加量为0.01～2‰。
7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述转氨反应的温度为20～70℃，时间为6～72小时。
8.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，控制转氨反应的pH值为6～9。
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