CN107287169A

CN107287169A - 一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用

Info

Publication number: CN107287169A
Application number: CN201710654533.5A
Authority: CN
Inventors: 杨旭; 张宇; 王露; 成玉富
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2017-08-03
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2017-10-24

Abstract

本发明提供一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用。该基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；该基因获得方法包括以下步骤：1)提取水茄样本总RNA和基因组DNA；2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，设计特异引物进行RACE‑PCR扩增；对步骤2)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。所述茄子细胞色素P450基因StCYP84A以及编码相关蛋白可用于抗黄萎病，进一步可应用于植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良。本发明的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。

Description

一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和农业领域，具体涉及一种茄子抗黄萎病细胞色素P450基因的获得方法及其应用。

背景技术

茄子(Solanum melongena L.)是我国重要蔬菜之一，营养丰富，经济效益较高，但大多数栽培茄易受黄萎病侵染。茄子黄萎病是由轮枝菌引起的一种土传性维管束病害，其症状通常表现为植株半边或叶片半边发黄、萎蔫，发病严重时劈开茎秆，可见维管束变褐。该病潜伏期长，传播能力强，为害范围广。发病严重时产量损失可达60％以上，美国、日本和印度都曾爆发茄子黄萎病，造成大面积减产。针对茄子黄萎病的防治，目前生产中多采用化学药剂、轮作等方法，但由于农药污染、经济成本等方面的矛盾，这些防治方法的实际应用效果不佳。

P450基因(细胞色素P450家族基因)在植物防御反应中发挥了非常重要的作用，广泛参与植保素的合成、激素代谢及大量次生代谢物的合成过程。如拟南芥植保素的生物合成涉及5个P450酶：CYP79B2、CYP79B3、CYP71A12、CYP71A13和CYP71B15。此外，拟南芥P450家族中12个基因特异受到A.brassicicola(芸薹链格孢)的诱导表达，5个受到A.alternata(链格孢)的诱导表达。拟南芥中超量表达CaCYP450A还能增强对假单胞杆菌(Pst)和活体营养型卵菌的抗性。以上研究表明大量P450基因参与拟南芥的生物胁迫反应。P450参与植物抗黄萎病反应的研究也逐渐受到关注，棉花中黄萎病菌会诱导棉酚的大量合成，Luo等人发现黄萎病菌侵染后棉花中CYP706B1参与了棉酚的合成，推测CYP706B1可能在棉花抗黄萎病反应中发挥了一定的作用。Sun等从棉花中发现了一个P450家族新成员SSN(Silence-Induced Stem Necrosis)基因，SSN基因表达被抑制后转基因棉花茎杆产生类病斑。进一步研究发现，SSN表达被抑制后转基因棉花根中茉莉酸的合成和信号路径组成型激活。SSN基因在棉花中超量表达和抑制表达后极显著影响了转基因植株根部的脂类代谢。脂类代谢异常使游离脂类成分或其衍生物作为***信号激活了棉花地上部分的组成型免疫反应并产生细胞坏死。表明SSN在棉花基础免疫反应调控中起到一个开关的作用，通过调控脂类代谢影响棉花应对病原菌侵染后的抗性水平。该发现是迄今棉花抗黄萎病研究中取得的最重要的成果之一。此外，Prall等研究还发现CYP72A基因在茄科作物中变异程度最大，推测驯化过程中CYP72A基因的丢失可能也与野生种和栽培种的抗性差异有关。其他植物中，P450参与抗病反应的报道，如PepCYP调控辣椒炭疽病，CYP82C2参与葡萄灰霉病调控等，以上研究表明大量P450家族基因参与了植物抗病反应，并且P450家族基因调控植物黄萎病的研究也正逐渐受到关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种茄子抗黄萎病细胞色素P450基因的获得方法及其应用。本发明的发明理念为：充分利用分子育种的优势，从分子生物学方法的角度出发，利用RACE方法扩增、并对RACE产物测序、拼接，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长；随后，对其进行生物信息学分析、测定黄萎病菌接种后该基因的表达量变化，同时检测过氧化物酶活性以进一步验证其功能，揭示该基因在黄萎病抗性中所发挥的作用，确定抗黄萎病基因。

本发明提供了一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A，具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。该基因是茄子抗黄蒌病相关基因，是一条长度为2035bp的cDNA序列。该基因5’UTR含129bp，3’UTR含331bp。CDS全长1575bp,编码524个氨基酸。

本发明还公开了该基因编码一种茄子抗黄萎病相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述的氨基酸序列含有细胞色素氧化酶典型的保守结构域。

本发明还提供了一种茄子细胞色素P450基因的获得方法，包括以下步骤：

1)提取水茄样本总RNA；

2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，进行RACE-PCR扩增，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长，在RACE-PCR扩增中所使用的特异引物的核苷酸序列如下：

R1F：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’(SEQ ID NO.3)

R1R：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’；(SEQ ID NO.4)

3)对步骤2)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。

上述方法步骤1)中，推荐使用水茄样本四片真叶时期的根为材料提取总RNA。

本发明进一步公开了所述茄子细胞色素P450基因StCYP84A在抗黄萎病中的应用。

本发明公开了所述的茄子细胞色素P450基因StCYP84A在植物分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了如上所述的茄子抗黄萎病相关蛋白，以及编码上述茄子抗黄萎病相关蛋白的基因在茄子黄萎病的研究、植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良中的应用。本发明的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本基因为水茄中的黄萎病抗性相关细胞色素氧化酶基因，实验表明该基因响应水茄对黄萎病抗性的调控过程，该基因的克隆及研究对理解茄子抗黄萎病机制具有一定的参考价值；

2)该基因的获得既可作为茄子抗黄萎病分子标记辅助育种提供参考基因，也丰富了茄子等植物抗黄萎病转基因育种的基因选择，为茄子抗黄萎病分子育种奠定初步基础。

附图说明

图1是野生茄水茄根系RNA完整性的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2是基因全长序列琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3是StCYP84A保守区预测。

图4是StCYP84A跨膜结构域预测。

图5是水茄中StCYP84A的表达分析。

图6是鹰嘴长茄中StCYP84A的表达分析。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

实施例1：

本实施例1以野生茄水茄cDNA和基因组DNA为模板，使用RACE方法克隆了多酚氧化酶基因，具体步骤如下：

1)孢子悬浮液的制备：

茄子黄萎病菌经PDA培养基平板培养7天后，用解剖针从边缘挑取面积约1cm*1cm的菌丝块，移入PL培养液中，在摇床上以120rmp/min，25℃，震荡培养7-9天，此时PDA培养液(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)由透明液体变成乳白色液体。将乳白色液体用双层纱布过滤，保留滤液，用血球计数板观察孢子数，计算出每毫升孢子数量，用灭菌蒸馏水稀释病菌孢子，最终配成浓度为1x10⁷孢子/mL的孢子悬浮液，随即用于接种。

2)采用浸根接菌法接种：

从每个茄子品种中选取16株长势良好的幼苗，将幼苗拔起，用清水洗净根部，在幼苗根际1cm处断根，然后将根浸泡在茄子黄萎病病原菌孢子悬浮液(浓度1×10⁷个/mL)中15min，随后立即定植到新的4x8的穴盘中(穴盘中基质经高温蒸汽灭菌)。白天温度控制在25～28℃左右，夜间20～22℃左右，空气湿度60-90％。

分别取未接种前植株的叶片、茎段、根系和接种后6h、12h、24h、48h、96h植株的叶片、茎段、根系，经过液氮冷冻，-80℃保存。

3)提取总RNA与基因组DNA：

以水茄四片真叶时期的根为材料，提取水茄总RNA和基因组DNA。总RNA的提取参照TaKaRa RNA提取试剂盒说明书上的操作步骤，cDNA的合成参照PrimeScript^TM RT reagentKit说明书上的操作步骤，分装后直接用于PCR或置于-20℃冰箱保存。基因组DNA的提取参照TaKaRa植物基因组提取试剂盒操作说明。

4)引物设计与RACE扩增：

在引物设计方面，课题组前期利用表达谱测序筛选到部分响应黄萎病菌侵染的茄子基因片段，结合表达水平差异、GO功能注释以及Pathway代谢通路等方面的分析，发现多酚氧化酶家族基因在茄子调控黄萎病胁迫过程中发挥了重要作用。因此，选择一条茄子多酚氧化酶基因序列片段为基础，利用Primer5引物设计软件设计特异引物，其核苷酸序列如下：

3'-RACE引物GSP2：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’；(SEQ ID NO.3)

5'-RACE引物GSP1：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’；(SEQ ID NO.4)

通用引物UPM核苷酸序列：

长序列：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO.5)

短序列：CTAATACGAC TCACTATAGGGC(SEQ ID NO.6)。

其中，RACE的具体步骤包括：

a)PCR反应混合液的准备：

34.5μl PCR-Grade Water，5μl 10X BD Advantage 2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl 50X BD Advantage 2Polymerase Mix，总体积为41.5μl；

b)涡旋混合，短暂离心；

c)5'-RACE PCR反应，在0.5ml PCR管中按顺序加入所有成分，轻柔混合；

d)3'-RACE PCR反应，在0.5ml PCR管中按顺序加入所有成分，轻柔混合；

e)PCR反应条件：

5cycles：94℃30sec,72℃3min；5cycles：94℃30sec,70℃30sec,72℃3Min；20cycles(Poly A+RNA)：94℃30sec,68℃30sec,72℃3Min；

f)PCR产物的回收、测序与序列分析：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，利用TaKaRa MoniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit凝胶回收试剂盒回收目的片段。将其连接到pMD18-T上。16℃连接反应30分钟，转化到JM109感受态细胞中，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上37℃过夜培养，形成单菌落。随机挑选其中的白色菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基震荡过夜培养，利用载体通用引物M13(上海生工提供，M13F：5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'(SEQ IDNO.7)；M13R：5'-AAC AGC TAT GAC CAT-3'(SEQ ID NO.8))进行PCR扩增，以确认T载体中***片段的有无及其长度大小，并随后进行测序、拼接，得到水茄StCYP84A基因cDNA全长。

实施例2：

本实施例中，对实施例1中克隆获得的水茄基因进行了分析和检测，且通过聚类分析和氨基酸比对确定该基因属于细胞色素氧化酶基因家族，与马铃薯中细胞色素P450基因同源性较高；并且，利用荧光定量PCR分析表明其表达与水茄黄萎病抗性相关，进一步确认其功能。具体如下：

1)水茄StCYP84A基因及其编码蛋白的生物信息学分析

通过RACE技术克隆获得一条cDNA序列，长度为2035bp的cDNA序列(SEQ ID NO.1)，命名为StCYP84A。该基因5’UTR含129bp，3’UTR含331bp。通过ORF Finder结合BLAST X进行序列比对，推测StCYP84A含一个1575bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码324个氨基酸，预测其等电点5.71，蛋白分子量约为59.27kD，该蛋白具有序列2所示的氨基酸序列。利用targetp v1.1预测蛋白亚细胞定位。根据StCYP84A SP值为0.92，推测该基因属于分泌蛋白。利用Blastp对StCYP84A氨基酸序列保守区进行预测(图3)，结果显示该序列含细胞色素P450典型保守结构域，推测该蛋白属于细胞色素氧化酶家族。TMHMM预测跨膜结构域，结果显示氨基酸的跨膜螺旋预期数为21.20862，大于18(一般认为该数值大于18相应的氨基酸可能含有跨膜结构)，因此推测该蛋白属于跨膜蛋白(图4)。

2)荧光定量PCR分析

当幼苗长至四叶一心时，采用伤根法，将抗病材料水茄和感病材料鹰嘴长茄根系浸没在黄萎病菌孢子悬浮液中15min，孢子浓度为5×10⁷cfu/mL，此为实验组；清水作为对照组。处理后，取实验组接种前剪取的水茄和鹰嘴长茄根、接种黄萎病菌后6h、12h、24h、48h剪取实验组的幼苗根系和对照组6h、12h、24h、48h剪取的幼苗根系，并将其经液氮速冻后于-80℃超低温冰箱中保存备用。重复3次。

随后，提取样品的总RNA，通过核酸蛋白测定仪测定RNA浓度和纯度。在逆转录之前，对所提取的总RNA浓度进行调整，使所要进行逆转录的RNA稀释到相同浓度，逆转录获得cDNA。以微管蛋白基因tublin为内参(因为该基因在茄子中表达稳定)，通过半定量PCR，检测了黄萎病菌侵染前后水茄根中StCYP84A(图6)基因表达情况。

其中，根据Shetty等的研究(Santoshkumar M.Shetty,Arun Chandrashekar,Yeldur P.Venkatesh。Eggplant polyphenol oxidase multigene family:Cloning,phylogeny,expression analyses and immunolocalization in response to wounding。Phytochemistry 72(2011)2275–2287)设计了内参引物，并且自行设计了水茄和鹰嘴长茄定量PCR引物，它们的核苷酸序列为：

荧光定量PCR扩增的总反应体系为20μL：包括反应体系为：模板2μL，上、下游引物各1μL，SYBR Green Master Mix 10μL，H₂O 6μL。

反应程序：95℃预变性10min；95℃10s，55℃20s，72℃30s。

图6所示的结果表明，水茄接种后6h、12h、24h CYP84A1的表达显著低于对照(图5)，而感病品种鹰嘴长茄中CYP84A1的表达并未表现出显著差异(图6)，表明StCYP84A参与了水茄抵御黄萎病的侵染过程，预测该基因可能为水茄中特有的抗病负调控基因。

本发明克隆得到的StCYP84A基因不仅有助于揭示茄子与黄萎病菌之间相互作用的分子机制，为植物抗黄萎病代谢途径研究提供了重要的理论基础，也为植物分子标记辅助育种和基因工程领域进行遗传性状的改良提供了有价值的候选功能基因。在应用方面，可以将本发明的StCYP84A基因导入茄子等植物中，以期获得对黄萎病具有抗性的的转基因茄子，本发明的基因对培育植物抗逆品种，特别是抗黄萎病茄子品种提高作物产量和品质具有重要意义。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A及其获得方法和应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2035

<212> DNA

<213> 茄子Solanum melongena L.

<400> 1

aaagtagcaa catgttgagt tgcaatttca tcccaacata ctccaccacc atctccaaaa 60

tctccactga aaaatagaca aaagatattt aaaaaactaa gaaaagaaag agtaagattt 120

cgaaataaaa tgaaagagat ggtgcaaaaa aatatcaatt caattcttga agctttacaa 180

gctaatccta tgctactctt cttgtttatt atccctctct tcttcttata ccttttctcg 240

acgtctagcc ggagacgtta tcctccaggt ccaagagggt ggcctctcat tggtaacatg 300

atgataatgg accagttaac tcaccgtggt cttgctaaac tagcagaaaa atatggtggt 360

gttatgcacc tcaaaatggg ttatatccac aaaattgtaa tatctggtcc ggaggaagct 420

agacaagtac tacaggtaca agacaacata tattcgaacc gtcccgcgac cgtagcgata 480

agctacttaa cgtacgaccg tgcagacatg gcttttgctg actacggacc gttttggcgt 540

cagatgagaa aattgtgcgt catgaaactc ttcagtcgca aacgagcgga gtcatgggac 600

tcagttcgcg acgaagtgga ctcactgatc aagattgtta caaccaacgc tggcacctcc 660

gtcaacttag gggaacttgt ttttggtctc actcgtgaca ttatctaccg agctgctttc 720

gggactagtt cagctgaagg acaagaagaa tttattaaaa ttttgcaaga attttcgaag 780

ctatttggcg cgtttaacat ggttgatttt attccatggc taggatggat tggtcagcaa 840

ggtctaaatg ttaggcttgc taacgcacgg gcatctcttg atgggttcat tgattcaata 900

attgatgacc atattgaaag aaaaaaggct aatgttacta ttgataatgg tgacagagaa 960

actgatatgg tggatgagct tttagctttt tacagtgaag aagctacagt aaatgagtct 1020

gaagataatt tgcagaatgc tataaggctt acaagggata atatcaaagc tatcatcatg 1080

gatgtgatgt ttggagggac agagacagta gcttctgcaa tagaatgggt gatggcagag 1140

cttgtgaaaa atccagagga gcttaaaaag gtacaacaag aattagctaa cgttgtcgga 1200

ctcaatagaa gagttgaaga atctgatctt gaaaaattaa cctacttaaa atgttgttta 1260

aaagaaacgc tccgtctcca ccctccgatc cctctcctcc tccacgaaac cgcggaggaa 1320

tcgaccatct tcgggtacca tattccggca gggtcacatg ttgtcataaa ttcatttgcc 1380

attggacgtg acaaaaattc atgggaagat gctgacagtt acaagccttc taggttcctt 1440

aaacaaggtg tcccagattt taaaggaggt aattttgaat ttttaccatt cgggtcgggt 1500

cggagatctt gccccggtat gcaacttggg ctttatgcat tagaaatggc tgtggcccat 1560

cttcttcatt gttttacttg ggaattacct gatgggatga aaccaagtga acttaaaatg 1620

gatgatacct ttgggcttac tgctccattg gcaaatcgac tagtggttgt gcctagtcca 1680

cgtttattgt gtacacttta ttgaggtata ttctatgtgt atacaagtca tatacacaaa 1740

ttattggttg ttttatatta aatgtaataa tgtaatatat atgcgtatac gtaagggaga 1800

gggaccaaag caaaaggacg aaaataattg cttgaaaggg gaaagagaga ggaattgatt 1860

gaacgagatt tgtgtatagg agacactagt atctctttcc ttcttttttt ttcttttttt 1920

tcttttaatt ttcaatttcg acatttggct tgcattgtaa gttgtaaatg tccccctctt 1980

gtttgttttt ctttgaaaac ataattcaaa tcaaataaat atttcatcct tgttg 2035

<210> 2

<211> 524

<212> PRT

<213> 茄子Solanum melongena L.

<400> 2

Met Lys Glu Met Val Gln Lys Asn Ile Asn Ser Ile Leu Glu Ala Leu

1 5 10 15

Gln Ala Asn Pro Met Leu Leu Phe Leu Phe Ile Ile Pro Leu Phe Phe

20 25 30

Leu Tyr Leu Phe Ser Thr Ser Ser Arg Arg Arg Tyr Pro Pro Gly Pro

35 40 45

Arg Gly Trp Pro Leu Ile Gly Asn Met Met Ile Met Asp Gln Leu Thr

50 55 60

His Arg Gly Leu Ala Lys Leu Ala Glu Lys Tyr Gly Gly Val Met His

65 70 75 80

Leu Lys Met Gly Tyr Ile His Lys Ile Val Ile Ser Gly Pro Glu Glu

85 90 95

Ala Arg Gln Val Leu Gln Val Gln Asp Asn Ile Tyr Ser Asn Arg Pro

100 105 110

Ala Thr Val Ala Ile Ser Tyr Leu Thr Tyr Asp Arg Ala Asp Met Ala

115 120 125

Phe Ala Asp Tyr Gly Pro Phe Trp Arg Gln Met Arg Lys Leu Cys Val

130 135 140

Met Lys Leu Phe Ser Arg Lys Arg Ala Glu Ser Trp Asp Ser Val Arg

145 150 155 160

Asp Glu Val Asp Ser Leu Ile Lys Ile Val Thr Thr Asn Ala Gly Thr

165 170 175

Ser Val Asn Leu Gly Glu Leu Val Phe Gly Leu Thr Arg Asp Ile Ile

180 185 190

Tyr Arg Ala Ala Phe Gly Thr Ser Ser Ala Glu Gly Gln Glu Glu Phe

195 200 205

Ile Lys Ile Leu Gln Glu Phe Ser Lys Leu Phe Gly Ala Phe Asn Met

210 215 220

Val Asp Phe Ile Pro Trp Leu Gly Trp Ile Gly Gln Gln Gly Leu Asn

225 230 235 240

Val Arg Leu Ala Asn Ala Arg Ala Ser Leu Asp Gly Phe Ile Asp Ser

245 250 255

Ile Ile Asp Asp His Ile Glu Arg Lys Lys Ala Asn Val Thr Ile Asp

260 265 270

Asn Gly Asp Arg Glu Thr Asp Met Val Asp Glu Leu Leu Ala Phe Tyr

275 280 285

Ser Glu Glu Ala Thr Val Asn Glu Ser Glu Asp Asn Leu Gln Asn Ala

290 295 300

Ile Arg Leu Thr Arg Asp Asn Ile Lys Ala Ile Ile Met Asp Val Met

305 310 315 320

Phe Gly Gly Thr Glu Thr Val Ala Ser Ala Ile Glu Trp Val Met Ala

325 330 335

Glu Leu Val Lys Asn Pro Glu Glu Leu Lys Lys Val Gln Gln Glu Leu

340 345 350

Ala Asn Val Val Gly Leu Asn Arg Arg Val Glu Glu Ser Asp Leu Glu

355 360 365

Lys Leu Thr Tyr Leu Lys Cys Cys Leu Lys Glu Thr Leu Arg Leu His

370 375 380

Pro Pro Ile Pro Leu Leu Leu His Glu Thr Ala Glu Glu Ser Thr Ile

385 390 395 400

Phe Gly Tyr His Ile Pro Ala Gly Ser His Val Val Ile Asn Ser Phe

405 410 415

Ala Ile Gly Arg Asp Lys Asn Ser Trp Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Lys

420 425 430

Pro Ser Arg Phe Leu Lys Gln Gly Val Pro Asp Phe Lys Gly Gly Asn

435 440 445

Phe Glu Phe Leu Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ser Cys Pro Gly Met

450 455 460

Gln Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Glu Met Ala Val Ala His Leu Leu His

465 470 475 480

Cys Phe Thr Trp Glu Leu Pro Asp Gly Met Lys Pro Ser Glu Leu Lys

485 490 495

Met Asp Asp Thr Phe Gly Leu Thr Ala Pro Leu Ala Asn Arg Leu Val

500 505 510

Val Val Pro Ser Pro Arg Leu Leu Cys Thr Leu Tyr

515 520

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcacttccc ccagcaagcc aggta 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcctacacc ttgcttacct tccgtt 26

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacagctatg accat 15

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcatgttcc gtggtgatgt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gagaagacct cagcaacact 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

acttcgtcgc gaactgagtc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ctaacgtacg accgtgcaga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gatgctcagg ctcatgatgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caggcatgtc tcgaagtgct 20

Claims

1.一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A，其特征在于，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的茄子抗黄萎病P450基因StCYP84A编码的蛋白，其特征在于具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

3.一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取水茄样本总RNA；

2)以步骤1)中所提取RNA反转录成的cDNA为模板，进行RACE-PCR扩增，在RACE-PCR扩增中所使用的特异引物的核苷酸序列如下：

R1F：5’-TTCACTTCCCCCAGCAAGCCAGGTA-3’；

R1R：5’-GTCCTACACCTTGCTTACCTTCCGTT-3’；

3)对步骤2)中所获得的PCR产物进行回收、测序与序列分析。

4.如权利要求3所述的一种茄子细胞色素P450基因StCYP84A的获得方法，其特征在于，步骤1)中，使用水茄样本四片真叶时期的根为材料提取总RNA。

5.权利要求1所述的茄子细胞色素P450基因StCYP84A在抗黄萎病中的应用。

6.权利要求1所述的茄子细胞色素P450基因StCYP84A在植物分子标记辅助育种中的应用。