CN105585612B - 八肽修饰的***、制备、纳米结构和应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***,八肽中的AA为L-Val或L-Phe残基。涉及它们的制备方法,涉及它们的纳米结构,涉及它们对小鼠耳后心肌移植免疫排斥反应的抑制作用,涉及它们对二甲苯导致炎症反应的抑制作用,进一步涉及它们不像***那样会产生骨质疏松及血栓副作用。因而本发明涉及下式的八肽修饰的***在制备免疫抑制和抗炎药物的应用前景。本发明属于生物医药领域。
背景技术
通过器官移植替换废旧器官,已经成为临床外科的常规治疗手段。器官移植中免疫排斥反应是器官移植失败的最主要因素。接受器官移植的患者,术后服用***类糖皮质激素免疫抑制剂,是避免排斥反应和延长移植器官存活时间的重要措施之一。***类糖皮质激素在临床的另外的重要应用是,治疗风湿性疾病,自身免疫病和严重感染或炎性疾病。患者长期使用***类糖皮质激素,不可避免地诱发骨质疏松和血栓性疾病。目前,降低***类糖皮质激素副作用风险的唯一办法,就是停药。停药的后果是,降低疗效。改造***类糖皮质激素的结构,降低或规避副作用,是***类糖皮质激素研究的热点。
发明人曾经用RGD四肽修饰皮质激素,制备了结构A的化合物。它们在1.43μmol/kg剂量下,可延长移植的乳鼠心肌存活时间。它们在25.5μmol/kg剂量下,可抑制小鼠炎症。它们在1.43μmol/kg剂量下,不会诱发小鼠患骨质疏松症。它们在1.43μmol/kg剂量下,是否不存在血栓形成风险,当时没有定论。
发明人还曾经用尿毒素三肽修饰氢化可的松和***龙,制备了结构B的化合物。它们分别在7.5mmol/kg和2.0mmol/kg剂量下,可延长移植的乳鼠心肌存活时间。没有发现它们的抗炎活性。它们在7.5mmol/kg和2.0mmol/kg剂量下,是否不存在骨质疏松和血栓形成风险,当时没有定论。
采用新方法改造***的结构,进一步降低用药剂量,不仅消除骨质疏松副作用,而且消除血栓形成副作用,是发明人一直努力发展的新技术。经过各种组合,发明人认识到肽与甾体五元环被五个以上原子隔离是问题之一。于是发明人用乙酰基代替丁二酰基,制备了下式的化合物。疗效没有明显改进。
接着,发明人采取RGD四肽逆转连接到L-Lys的侧链氨基上的策略,制备了下式的化合物。虽然疗效没有明显改进,但是骨质疏松和血栓形成副作用都不再发生。
最后,发明人采取尿毒素三肽His-Gly-Glu逆转连接到上面化合物的L-Lys的α-氨基上的策略,制备了本发明的化合物,达到了降低用药剂量,消除骨质疏松副作用和消除血栓形成副作用三重目标。根据这些研究,发明人提出了本发明。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是,提出下式的八肽修饰的***结构。式中AA为L-Val和L-Phe残基。
本发明要解决的第二个技术问题是,提供制备八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)的方法,该化合物包括三大步骤:
1)在DMSO中,NaH催化***17位羟乙酰基的羟基与溴乙酸乙酯脱HBr,将17位羟乙酰基转化为乙氧羰基甲氧乙酰基。再在NaOH溶液中将17位乙氧羰基甲氧乙酰基转化为17位羧甲氧乙酰基;
2)按照标准的液相接肽法,逐步接肽,将L-Boc-Lys的侧链氨基与羧端游离的全保护的RGDV或RGDF的羧端偶联,将L-Lys的羧端与α-氨基游离的全保护的His-Gly-Glu的N端偶联,制备全保护的八肽Fmoc-Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,然后在20%哌啶的DMF溶液中脱Fmoc制备N游离的全保护八肽Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,式中AA为L-Val或L-Phe残基;
3)在HATU,HOBt和NMM存在下,在无水DMF中,先将步骤1得到的***-17-羧酸与步骤2得到的Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl偶联,再在三氟乙酸中用三氟甲磺酸脱去全部保护基,制得权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)。
本发明要解决的第三个技术问题是,评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)延长小鼠耳后移植心肌存活时间。
本发明要解决的第四个技术问题是,评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)抑制小鼠炎症的活性。
本发明要解决的第五个技术问题是,评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)抑制大鼠血栓形成的活性。
本发明要解决的第六个技术问题是,评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)抑制小鼠骨质疏松的活性。
附图说明
图1八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)的合成路线.i)DMSO,BrCH2CO2C2H5,NaH;ii)MeOH,NaOH;iii)DCC,HOBt,NMM;iv)4N HCl/EtOAc,v/v)H2,Pt/C;vi)HATU,HOBt,NMM;vii)20%哌啶/DMF;viii)TFMSA,TFA。
图2浓度为1.43×10-6M的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)在水溶液中的透射电镜照片。
图3化合物对小鼠耳后心肌移植心肌存活的影响,n=10,口服给药,0.1μmol/kg/day,连续给药15天。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备Boc-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取(30.0mmol)Boc-Gly 5.294g,4.353g(32.5mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的7.406g(35.9mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入15.572g(31.3mmol)TosH·Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1),显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用200mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液,50mL饱和硫酸氢钾水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液,50mL饱和碳酸氢钠水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液各洗3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩,得13.0g(88.4%)标题化合物。
实施例2制备HCl·Gly-Glu(OBzl)-OBzl
冰浴下向13.0g(26.9mmol)Boc-Gly-Glu(OBzl)-OBz加入200mL 4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液,反应2小时后,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解,减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解,减压浓缩。该操作也重复3次。得12.5g(96.1%)标题化合物。
实施例3制备Boc-His(Boc)-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取1.400g(3.9mmol)Boc-His(Boc),0.561g(4.0mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的0.975g(4.7mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入2.0g(4.8mmol)HCl·Gly-Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1),显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用100mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用饱和碳酸氢钠20mL饱和碳酸氢钠水溶液,饱和20mL氯化钠水溶液,20mL饱和硫酸氢钾水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液,20mL饱和碳酸氢钠水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,过滤,滤液减压浓缩,得1.700g(60.7%)标题化合物。
实施例4制备HCl·His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
冰浴下向1.7g(2.4mmol)Boc-His(Boc)-Gly-Glu(OBzl)-OBzl加入10mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液,反应2小时后,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解,减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解,减压浓缩。该操作也重复3次,得1.2g(92.3%)标题化合物。
实施例5制备Fmoc-Lys(Boc)-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取20g(42.7mmol)Fmoc-Lys(Boc),4.9g(36.2mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的9.6g(46.6mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入20g(35.8mmol)HCl·His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=10/1)显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用400mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用100mL饱和碳酸氢钠水溶液,100mL饱和氯化钠水溶液,100mL饱和硫酸氢钾水溶液,100mL饱和氯化钠水溶液,100mL饱和碳酸氢钠水溶液,100mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,拌样,柱层析纯化,得22g(63.2%)标题化合物。ESI-MS(m/z):972.9[M+H]+。
实施例6制备HCl·Fmoc-Lys-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
冰浴下向22g(22.7mmol)Fmoc-Lys(Boc)-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl加入500mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液,反应6小时后,TLC(CH2Cl2/MeOH=10/1)显示原料点消失。减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解,减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解,减压浓缩。该操作也重复3次,得15.1g(93.8%)标题化合物。ESI-MS(m/z):872.9[M+H]+。
实施例7制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl
称取38.5g(90.0mmol)Boc-Arg(Tos),12g(88.6mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的22g(109.2mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入22g(109.2mmol)HCl·Gly-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用500mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用100mL饱和碳酸氢钠水溶液,100mL饱和氯化钠水溶液,100mL饱和硫酸氢钾水溶液,100mL饱和氯化钠水溶液,100mL饱和碳酸氢钠水溶液,100mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,拌样,柱层析纯化,得45g(87.8%)标题化合物。
实施例8制备Boc-Arg(Tos)-Gly
用200mL甲醇溶解45g(78.3mmol)Boc-Arg(Tos)Gly-OBzl,向其中加入9g Pd/C,反应瓶上安装三通,水泵抽至真空,通入氢气,再次重复抽真空,通气2次,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失,滤除Pd/C,滤液减压浓缩,得31g(64.0%)标题化合物。
实施例9制备Boc-Asp(OMe)-Val-OBzl
称取5g(20.2mmol)Boc-Asp(OMe),2.7g(19.9mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的5g(24.3mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入8.3g(22.0mmol)TosH·Val-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用100mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用20mL饱和碳酸氢钠水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液,20mL饱和硫酸氢钾水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液,20mL饱和碳酸氢钠水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,过滤,滤液减压浓缩,得8.1g(92.0%)标题化合物。
实施例10制备HCl·Asp(OMe)-Val-OBzl
冰浴下向8.1g(18.6mmol)Boc-Asp(OMe)Val-OBzl加入80mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液,反应4小时后,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失,减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解,减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解,减压浓缩。该操作也重复3次,得6.7g(97.1%)标题化合物。
实施例11制备Boc-Asp(OMe)-Phe-OBzl
称取3g(12.1mmol)Boc-Asp(OMe),1.6g(11.8mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的3g(14.6mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入4g(13.7mmol)HCl·Phe-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用100mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用20mL饱和碳酸氢钠水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液,20mL饱和硫酸氢钾水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液,20mL饱和碳酸氢钠水溶液,20mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,过滤,滤液减压浓缩,得5.2g(88.1%)标题化合物。
实施例12制备HCl·Asp(OMe)-Phe-OBzl
冰浴下向5.2g(10.7mmol)Boc-Asp(OMe)Phe-OBzl加入50mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液,反应4小时后,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失,减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解,减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解,减压浓缩。该操作也重复3次,得4.3g(95.6%)标题化合物。
实施例13制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl
称取13g(26.8mmol)Boc-Arg(Tos)Gly,3.6g(26.6mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的6.5g(31.6mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入10.7g(28.6mmol)HCl·Asp(OMe)Val-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU,滤液减压浓缩,残留物用400mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液,饱和50mL氯化钠水溶液,50mL饱和硫酸氢钾水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液,50mL饱和碳酸氢钠水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,过滤,滤液减压浓缩,得18.0g(83.7%)标题化合物。
实施例14制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Phe-OBzl
称取25g(51.5mmol)Boc-Arg(Tos)Gly,5.5g(40.6mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加THF溶解的11g(53.4mmol)DCC,搅拌活化30分钟后加入10.7g(40.4mmol)HCl·Asp(OMe)Phe-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU,减压浓缩至干,残留物用400mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液,饱和50mL氯化钠水溶液,50mL饱和硫酸氢钾水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液,50mL饱和碳酸氢钠水溶液,50mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,过滤,滤液减压浓缩,得30.2g(87.8%)标题化合物。
实施例15制备Fmoc-Lys[Val-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取2.7g(3.8mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Val,515mg(3.8mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加1.75g(4.6mmol)溶于无水DMF的HATU,搅拌活化30分钟后加入3.5g(3.9mmol)HCl·Fmoc-Lys-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=5/1)显示原料点消失。减压浓缩,残留物用200mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和硫酸氢钾水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,拌样,柱层析纯化,得2.2g(40.0%)标题化合物。ESI-MS(m/z):1668.5[M+H]+。
实施例16制备Fmoc-Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取3.8g(5.0mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Phe,676mg(5.0mmol)HOBt,干燥四氢呋喃(THF)溶解,冰浴下搅拌,向其中滴加2.1g(5.5mmol)溶于无水DMF的HATU,搅拌活化30分钟后加入4.5g(5.0mmol)HCl·Fmoc-Lys-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=5/1)显示原料点消失。减压浓缩,残留物用200mL乙酸乙酯溶解,得到的乙酸乙酯溶液依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和硫酸氢钾水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次,乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟,拌样,柱层析纯化,得2.7g(33.8%)标题化合物。ESI-MS(m/z):1716.8[M+H]+。
实施例17制备17-乙氧羰基甲氧乙酰基***
称取20g(51.5mmol)***用50mL DMSO溶解,置于冰浴下搅拌,称取1.3g(52.1mmol)NaH小心加入反应瓶中,量取17mL溴乙酸乙酯滴加到反应瓶中,室温反应2小时,然后向反应瓶中加入400mL乙酸乙酯,得到的溶液用饱和氯化钠水溶液洗5次,每次50mL,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液减压浓缩得15.1g(62.9%)标题化合物。Mp:225-226℃,(c=0.1,CH3OH),ESI-MS(m/z):479.84[M+H]+,1H NMR(300MHz,CDCl3):δ/ppm=7.23-7.20(d,J=9Hz,1H),6.36-6.33(d,J=9Hz,1H),6.12(s,1H),4.52(m,2H),4.40-4.37(d,J=9Hz,1H),4.22(m,4H),3.11(m,1H),2.39(m,3H),1.81(m,3H),1.56(m,5H),1.30(m,4H),1.08(s,3H),0.95-0.92(d,J=9Hz,3H)。
实施例18制备17-羧甲氧乙酰基***
用100mL甲醇溶解15.1g(31.6mmol)17-乙氧羰基甲氧乙酰基***,冰浴下用2N NaOH调节pH=12,冰浴下反应并维持pH=12,15小时后TLC(CH2Cl2/EA=1/1)显示原料点消失。反应混合物用饱和硫酸氢钾水溶液调pH=7,减压浓缩,残留物用200mL蒸馏水溶解,用饱和硫酸氢钾水溶液调pH=2,用乙酸乙酯萃取3次,每次60mL,合并乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥,减压浓缩,得到的无色粉末用二氯化碳洗涤,过滤,收集滤饼,得12.8g(90.1%)标题化合物。Mp 232-233℃,ESI-MS(m/z):449.3[M-H]-,(c=0.1,CH3OH),1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=7.31-7.28(d,J=9Hz,1H),6.23-6.20(d,J=9Hz,1H),6.01(s,1H),5.30(m,1H),5.04(s,1H),4.45(m,2H),4.19(m,1H),4.03(s,2H),2.91(m,1H),2.61(m,1H),2.34(m,2H),2.16(m,2H),1.75(m,1H),1.61(m,1H),1.49(s,3H),1.33(m,1H),1.08(m,1H),0.87(s,3H),0.80-0.77(d,J=9Hz,3H)。
实施例19制备***-17-羰甲氧乙酰基
-Lys[Val-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取1.3g(2.9mmol)17-羧甲氧乙酰基***,270mg(2.0mmol)HOBt,溶解于无水DMF中,冰浴下搅拌,向其中滴加1.1g(2.9mmol)无水DMF溶解的HATU,搅拌活化30分钟后加入2.7g(2.0mmol)Lys[Val-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=5/1)显示原料点消失。冰浴下向反应液中加入200mL饱和氯化钠水溶液,用乙酸乙酯萃取3次,每次50mL,合并乙酸乙酯层,依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和硫酸氢钾水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液各洗涤3次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩至1mL之后用层析硅胶拌样,柱层析纯化(CH2Cl2/MeOH=15/1),得1.217g(33.8%)标题化合物。Mp:144.3-147.0,(c=0.1,CH3OH),ESI-MS(m/z):1779.8102[M+H]+,1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.69(s,1H),8.26(m,2H),8.10(s,2H),7.90(m,2H),7.65(m,3H),7.51(s,1H),7.31(m,15H),6.89(m,4H),6.59,(s,1H),6.23-6.20(d,J=9Hz,1H),6.01(s,1H),5.38(s,1H),5.13(s,2H),5.06(m,4H),4.68(m,2H),4.45(m,2H),4.29(m,2H),4.17-4.14(d,J=9Hz,1H),4.05(m,1H),3.93(m,4H),3.72(m,3H),3.56(s,4H),2.94(m,4H),2.60(m,2H),2.34(s,5H),2.12(m,3H),1.95(m,2H),1.62(m,7H),1.28(m,17H),0.89(m,3H),0.80(m,6H)。
实施例20制备***-17-羰甲氧乙酰基-Lys(Val-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu(5a)
称取380mg(0.21mmol)***-17-羰甲氧乙酰基-Lys[Val-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl于100mL茄瓶中,冰浴下加入三氟乙酸3mL,搅拌15分钟后加入三氟甲磺酸1mL,继续搅拌15分钟,加80mL无水***,使产物析出,搅拌5分钟,静置,沉降析出物,小心倾倒出液体。残留物加***洗涤,小心倾倒出液体。残留物加***洗涤,小心倾倒出液体。残留物减压除去溶剂,残留物加5mL蒸馏水溶解,得到的溶液用稀氨水调pH至7,过滤,滤液用Sephdex G10脱盐,冻干,得102mg(35.9%)标题化合物。Mp:96.8-97.4,(c=0.03,H2O),ESI-MS(m/z):1349.19[M+NH4]+,1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.29(m,2H),8.14(m,5H),7.78(m,5H),7.53(m,8H),7.13-7.10(d,J=9Hz,1H),6.79(s,2H),6.23-6.20(d,J=9Hz,1H),6.01(s,1H),4.63(m,2H),4.49(m,2H),4.20(m,2H),3.72(m,6H),3.57(s,2H),3.07(m,5H),2.72(m,3H),2.42(m,4H),2.00(m,6H),1.62(m,7H),1.26(m,8H),0.96(s,3H),0.83(m,6H)。
实施例21制备***-17-羰甲氧乙酰基
-Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl
称取1.0g(2.2mmol)17-羧甲氧乙酰基***,218mg(1.6mmol)HOBt,溶解于无水DMF,冰浴下搅拌,向其中滴加857mg(2.3mmol)无水DMF溶解的HATU,搅拌活化30分钟后加入2.2g(1.6mmol)Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,NMM调pH=8,室温反应12小时,TLC(CH2Cl2/MeOH=5/1)显示原料点消失。冰浴下向反应液中加入饱和氯化钠溶液200mL,乙酸乙酯萃取3次,每次50mL,合并乙酸乙酯层,依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和硫酸氢钾水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液,30mL饱和碳酸氢钠水溶液,30mL饱和氯化钠水溶液各洗涤3次,无水硫酸钠干燥,减压浓缩至1mL之后用层析硅胶拌样,柱层析纯化(CH2Cl2/MeOH=15/1),得873mg(30.1%)标题化合物。Mp:151.9-153.4,(c=0.1,CH3OH),ESI-MS(m/z):1826.7932[M+H]+,1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.70(s,1H),8.28(m,2H),8.14(m,4H),7.87(m,4H),7.64(m,3H),7.51(s,1H),7.28(m,20H),6.89(m,4H),6.60,(s,1H),6.23-6.20(d,J=9Hz,1H),6.01(s,1H),5.38(s,1H),5.13(s,2H),5.06(m,4H),4.65(m,2H),4.35(m,6H),4.17-4.14(d,J=9Hz,1H),3.80(m,8H),3.55(s,4H),2.73(m,4H),2.47(m,3H),2.33(s,6H),2.08(m,5H),1.58(m,8H),1.28(m,16H),0.93(m,3H)。
实施例22制备***-17-羰甲氧乙酰基-Lys(Phe-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu(5b)
称取365mg(0.20mmol)***-17-羰甲氧乙酰基-Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl于100mL茄瓶中,冰浴下加入三氟乙酸3mL,搅拌15分钟后加入三氟甲磺酸1mL,继续反应15分钟加入80mL无水***,使产物析出,搅拌5分钟后停止,静置、沉降析出物,小心倾倒出液体。残留物加***洗涤,小心倾倒出液体。残留物加***洗涤,小心倾倒出液体。残留物减压除去溶剂,残留物加5mL蒸馏水溶解,得到溶液稀氨水调pH至7,过滤,滤液用Sephdex G10脱盐,冻干,得91mg(33.0%)标题化合物。Mp:92.7-93.8,(c=0.03,H2O),ESI-MS(m/z):1396.15[M+NH4]+,1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=8.42(m,2H),8.13(m,3H),7.83(m,1H),7.73(m,1H),7.52(m,6H),7.18(m,7H),6.76(m,1H),6.19-6.16(d,J=9Hz,1H),6.00(s,1H),5.44(s,1H),4.51(m,1H),4.42(m,1H),4.35(m,1H),4.25(m,1H),4.11(m,1H),3.99(m,1H),3.72(m,6H),3.51(s,3H),3.37(m,4H),2.87(m,4H),2.39(m,3H),1.76(m,1H),1.61(m,6H),1.53(m,8H),0.92(m,3H)。
实验例1测定5a,b的透射电镜照片
将5a,b配成浓度为1.43×10-6M的水溶液,然后将此溶液滴在铜网上,挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米形态。测定表明,5a,b形成规则的纳米球。作为代表性照片,图2是浓度为1.43×10-6M的5a,b的透射电镜照片。结果表明,5a,b的纳米结构为直径小于100nn的纳米球。可见,5a,b的纳米结构非常有利于它们在体内输送。
实验例2评价5a,b对小鼠耳后心肌组织移植的影响
受体鼠(Balb/c小鼠,雄性,体重20±2g)经10%乌拉坦(10mg/10g体重)腹腔注射麻醉。1%新洁尔灭酊耳廓局部消毒,持眼科剪于耳廓背侧中线之前1/3处作一与耳廓中线垂直处作一3-4毫米长的切口,勿损伤耳廓静脉。持镊子向耳尖方向钝性分离皮下组织,使之成一管腔。将新生供鼠(C57bl/6j24小时乳鼠)置于碎冰中一分钟后用75%酒精皮肤消毒,剖胸摘取心脏。将心脏置于PBS液内搏动1-2次以排空心腔余血。移植时,用刀片把供心纵向剖成为基本等大的两半,肌纤维成一斜面。将心肌组织移植填入受体鼠耳腔内,心肌组织的离体时间不超过2分钟。用手指轻按局部,使移植物与受鼠之周围组织贴紧。移植术后当天给药。空白对照为生理盐水,5a,b用生理盐水溶解,均口服给药,剂量为0.1μmol/kg/d,0.2mL/20g体重,连续给药15天,共给药15次。术后第7日起每天记录移植心肌组织的心电信号,测试异位心电图时,正负电极分别置于移植心脏两侧,接地极连接在小鼠后肢。
绘制移植心肌存活曲线图3。结果表明,在术后第17天5a,b组才出现移植心肌死亡,心肌存活率比***大幅度提高。该结果说明,在0.1μmol/kg/d的剂量下5a,b显著地抑制移植心肌组织的排斥反应。与发明人曾经公开结构A的化合物的有效剂量(1.43μmol/kg)相比,本发明的有效剂量降低了14倍。与发明人曾经公开结构B的化合物的有效剂量(2.0和7.0mmol/kg)相比,本发明的有效剂量降低了2000倍和7500倍。显然,本发明取得了意想不到的抑制移植心肌组织排斥反应的结果。
实验例3用小鼠二甲苯致炎模型评价5a,b的抗炎活性
使用小鼠二甲苯致炎模型评价5a,b抗炎活性。***和5a,b均一次给药,***的口服剂量为25.5μmol/kg,5a,b的口服剂量均为2.55μmol/kg。生理盐水为空白对照。ICR雄性小鼠(体重20±2g)随机分为空白对照组,阳性组及给药组,每组10只。静息一天,操作间维持温度为22℃,实验开始,口服给药,单次给药30min后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μL二甲苯,2h后断臼处死小鼠,剪下左右两耳,用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,求出两耳肿胀差值,作为肿胀度,肿胀度=左耳圆片重量-右耳圆片重量。表1数据说明,在2.55μmol/kg剂量下5a,b有效地抑制小鼠的炎症反应。与发明人曾经公开结构A的化合物的有效剂量(25.5μmol/kg)相比,本发明的有效剂量降低了10倍。发明人曾经公开结构B的化合物没有抗炎症活性。显然,本发明取得了意想不
到的抑制炎症的结果。表1本发明的化合物对小鼠耳肿胀度的影响
n=10,口服给药,双样本等方差t检验;a)与生理盐水组相比P<0.01;b)与生理盐水和***组相比P<0.01。
实验例4评价5a,b对小鼠股骨的影响
实验例2中小鼠待移植心肌全部死亡后断臼处死,取股骨称重并测定骨密度。表3的数据说明,在0.1μmol/kg剂量下5a,b不会引起小鼠产生骨质疏松症。与发明人曾经公开结构A的化合物不引起骨质疏松的有效剂量(1.43μmol/kg)相比,本发明的有效剂量降低了10倍。发明人曾经公开结构B的化合物没有抗骨质疏松活性。显然,本发明取得了意想不到的抗骨质疏松的结果。
表2 本发明的化合物对股骨的重量和密度影响
n=10,口服给药,连续给药15天,双样本等方差t检验:a)与生理盐水组相比,P<0.05;b)与生理盐水组相比P>0.05,与***相比P<0.05。
实验例5评价5a,b对血栓形成的影响
将雄性SD大鼠随机分为组:空白对照为生理盐水,阳性对照为阿司匹林,剂量167μmol/kg;给药组***及5a,b剂量均为0.99μmol/kg。口服给药30分钟后,乌拉坦(20g/100mL,7mL/kg)麻醉。分离右颈动脉和左颈静脉,把一根6cm长的事先精密称重的丝线放在聚乙烯管中,将插管充满抗凝剂肝素钠(0.42mg/mL,0.42mg/kg)的生理盐水溶液后,一端***左侧静脉,注射定量肝素钠抗凝,然后***右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉,循环15分钟。15min后取出丝线,精确称重,计算增重,统计化合物的抗血栓活性。结果列入表3。表3的数据说明,在0.99μmol/kg剂量下5a,b有效地抑制大鼠形成血栓。发明人曾经公开结构A和B的化合物都没有抗血栓活性。显然,本发明取得了意想不到的抗血栓的结果。
表3 本发明的化合物的抗血栓活性
n=9,口服给药,0.99μmol/kg,双样本等方差t检验.a)与生理盐水相比P<0.01;b)与生理盐水相比P<0.05;c)与生理盐水和***组相比P<0.01。
Claims (5)
2.制备权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***的方法,该方法 包括三大步骤:
1)在DMSO中,NaH催化***17位羟乙酰基的羟基与溴乙酸乙酯脱HBr,将17位羟乙酰基转化为乙氧羰基甲氧乙酰基,再在NaOH溶液中将17位乙氧羰基甲氧乙酰基转化为17位羧甲氧乙酰基;
2)按照标准的液相接肽法,逐步接肽,将L-Boc-Lys的侧链氨基与羧端游离的全保护的RGDV或RGDF的羧端偶联,将L-Lys的羧端与α-氨基游离的全保护的His-Gly-Glu的N端偶联,制备全保护的八肽Fmoc-Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,然后在20%哌啶的DMF溶液中脱Fmoc制备N游离的全保护八肽Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl,式中AA为L-Val或L-Phe残基;
3)在HATU,HOBt和NMM存在下,在无水DMF中,先将步骤1得到的***-17-羧酸与步骤2得到的Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl偶联,再在三氟乙酸中用三氟甲磺酸脱去全部保护基,制得权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***。
3.权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***的纳米球。
4.权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***在制备免疫抑制剂中的应用,其特征在于制得的免疫抑制剂克服了***引起的松骨质疏松和血栓副作用。
5.权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-His-Gly-Glu修饰的***在制备抗炎剂中的应用,其特征在于制得的抗炎剂克服了***引起的松骨质疏松和血栓副作用。
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