CN105504013B

CN105504013B - 八肽修饰的***、其制备、纳米结构和应用

Info

Publication number: CN105504013B
Application number: CN201410562349.4A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 于化龙
Original assignee: Beijing Yisheng Kanghua Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Hengrun Taisheng Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-10-20
Filing date: 2014-10-20
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2034-10-20
Also published as: CN105504013A

Abstract

本发明公开了下式的八肽Lys(AA‑Asp‑Gly‑Arg)‑Glu‑Asp‑Gly修饰的***，八肽中的AA为L‑Val或L‑Phe。公开了它们的制备方法，公开了它们的纳米结构，公开了它们对小鼠耳后心肌移植免疫排斥反应的抑制作用，公开了它们对二甲苯导致炎症反应的抑制作用，进一步公开了它们不像***那样会产生骨质疏松及血栓副作用。

Description

八肽修饰的***、其制备、纳米结构和应用

技术领域

本发明涉及八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***，八肽中的AA为L-Val或L-Phe残基。涉及它们的制备方法，涉及它们的纳米结构，涉及它们对小鼠耳后心肌移植免疫排斥反应的抑制作用，涉及它们对二甲苯导致炎症反应的抑制作用，进一步涉及它们不像***那样会产生骨质疏松及血栓副作用。因而本发明涉及八肽修饰的***在制备免疫抑制和抗炎药物的应用前景。本发明属于生物医药领域。

背景技术

通过器官移植替换废旧器官，已经成为临床外科的常规治疗手段。器官移植中免疫排斥反应是器官移植失败的最主要因素。接受器官移植的患者，术后服用***类糖皮质激素免疫抑制剂，是避免排斥反应和延长移植器官存活时间的重要措施之一。***类糖皮质激素在临床的另外的重要应用是，治疗风湿性疾病，自身免疫病和严重感染或炎性疾病。患者长期使用***类糖皮质激素，不可避免地诱发骨质疏松和血栓性疾病。目前，降低***类糖皮质激素副作用风险的唯一办法，就是停药。停药的后果是，降低疗效。改造***类糖皮质激素的结构，降低或规避副作用，是***类糖皮质激素研究的热点。

发明人曾经用RGD四肽修饰皮质激素，制备了结构A的化合物。它们在1.43μmol/kg剂量下，可延长移植的乳鼠心肌存活时间。它们在25.5μmol/kg剂量下，可抑制小鼠炎症。它们在1.43μmol/kg剂量下，不会诱发小鼠患骨质疏松症。它们在1.43μmol/kg剂量下，是否不存在血栓形成风险，当时没有定论。

结构A.发明人曾经公开的RGD四肽修饰的皮质激素

发明人还曾经用尿毒素三肽修饰氢化可的松和***龙，制备了结构B的化合物。它们分别在7.5mmol/kg和2.0mmol/kg剂量下，可延长移植的乳鼠心肌存活时间。没有发现它们的抗炎活性。它们在7.5mmol/kg和2.0mmol/kg剂量下，是否不存在骨质疏松和血栓形成风险，当时没有定论。

结构B.发明人还曾经公开的尿毒素三肽修饰的氢化可的松和***龙

采用新方法改造***的结构，进一步降低用药剂量，不仅消除骨质疏松副作用，而且消除血栓形成副作用，是发明人一直努力发展的新技术。经过各种组合，发明人认识到肽与甾体五元环被五个以上原子隔离是问题之一。于是发明人用乙酰基代替丁二酰基，制备了下式的化合物。疗效没有明显改进。

接着，发明人采取RGD四肽逆转连接到L-Lys的侧链氨基上的策略，制备了下式的化合物。虽然疗效没有明显改进，但是骨质疏松和血栓形成副作用都不再发生。

最后，发明人采取尿毒素三肽Glu-Asp-Gly逆转连接到上面化合物的L-Lys的α-氨基上的策略，制备了本发明的化合物，达到了降低用药剂量，消除骨质疏松副作用和消除血栓形成副作用三重目标。根据这些研究，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是，提出下式的八肽修饰的***结构。式中AA为L-Val和L-Phe残基。

本发明要解决的第二个技术问题是，提供制备八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***的方法，该化合物包括三大步骤：

1)在DMSO中，NaH催化***17位羟乙酰基的羟基与溴乙酸乙酯脱HBr，将17位羟乙酰基转化为乙氧羰基甲氧乙酰基。再在NaOH溶液中将17位乙氧羰基甲氧乙酰基转化为17位羧甲氧乙酰基；

2)按照标准的液相接肽法，逐步接肽，将L-Boc-Lys的侧链氨基与羧端游离的全保护的RGDV或RGDF的羧端偶联，将L-Lys的羧端与α-氨基游离的全保护的Glu-Asp-Gly的N端偶联，制备全保护的八肽Fmoc-Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl，然后在20％哌啶的DMF溶液中脱Fmoc制备N游离的全保护八肽Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl，式中AA为L-Val或L-Phe残基；

3)在HATU，HOBt和NMM存在下，在无水DMF中，先将步骤1得到的***-17-羧酸与步骤2得到的Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl偶联，再在三氟乙酸中用三氟甲磺酸脱去全部保护基，制得权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)。

本发明要解决的第三个技术问题是，评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)延长小鼠耳后移植心肌存活时间。

本发明要解决的第四个技术问题是，评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)抑制小鼠炎症的活性。

本发明要解决的第五个技术问题是，评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)抑制大鼠血栓形成的活性。

本发明要解决的第六个技术问题是，评价八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)抑制小鼠骨质疏松的活性。

附图说明

图1八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)的合成路线.i)DMSO，BrCH₂CO₂C₂H₅，NaH；ii)MeOH，NaOH；iii)DCC，HOBt，NMM；iV)4N HCl/EtOAc，v/v)H₂，Pt/C；vi)HATU，HOBt，NMM；vii)20％哌啶/DMF；viii)TFMSA，TFA。

图2浓度为1.43×10^-6M的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***(式中AA为L-Val或L-Phe残基)在水溶液中的透射电镜照片。

图3化合物对小鼠耳后心肌移植心肌存活的影响，n＝10，口服给药，0.1μmol/kg/day，连续给药15天。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备Boc-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

称取17.6g(54.2mmol)Boc-Asp(OBzl)，7.3g(53.9mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的13.4g(65.0mmol)DCC，搅拌活化30分钟后，加入12.0g(59.6mmol)HCl·Gly-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用200mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL饱和硫酸氢钾水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液各洗3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得24.0g(93.8％)标题化合物。

实施例2制备HCl·Asp(OBzl)-Gly-OBzl

冰浴下向24.0g(50.8mmol)Boc-Asp(OBzl)Gly-OBzl加入200mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液，反应2小时后，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解，减压浓缩。该操作也重复3次。得19.6g(93.3％)标题化合物。

实施例3制备Boc-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

称取3.9g(11.6mmol)Boc-Glu(OBzl)，1.65g(12.2mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的2.86g(13.9mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入5.7g(13.9mmol)HCl·Asp(OBzl)Gly-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)，显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用200mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液，饱和50mL氯化钠水溶液，50mL饱和硫酸氢钾水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，过滤，滤液减压浓缩，得6.3g(78.8％)标题化合物。

实施例4制备HCl·Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

冰浴下向6.3g(9.1mmol)Boc-Glu(OBzl)Asp(OBzl)Gly-OBzl加入100mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液，反应2小时后，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解，减压浓缩。该操作也重复3次，得5.5g(96.5％)标题化合物。

实施例5制备Fmoc-Lys(Boc)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

称取22.5g(48.0mmol)Fmoc-Lys(Boc)，6.5g(48.0mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的12g(58.3mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入30g(48.0mmol)HCl·Glu(OBzl)Asp(OBzl)Gly-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝10/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用400mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用100mL饱和碳酸氢钠水溶液，100mL饱和氯化钠水溶液，100mL饱和硫酸氢钾水溶液，100mL饱和氯化钠水溶液，100mL饱和碳酸氢钠水溶液，100mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，拌样，柱层析纯化，得42.1g(84.2％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：1040.9[M+H]⁺。

实施例6制备HCl·Fmoc-Lys-Glu(OBzl-)Asp(OBzl)-Gly-OBzl

冰浴下向42.1g(40.5mmol)Fmoc-Lys(Boc)Glu(OBzl)Asp(OBzl)Gly-OBzl加入500mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液，反应6小时后，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝10/1)显示原料点消失。减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解，减压浓缩。该操作也重复3次，得38g(96.2％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：941.2[M+H]⁺

实施例7制备Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl

称取38.5g(90.0mmol)Boc-Arg(Tos)，12g(88.6mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的22g(109.2mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入22g(109.2mmol)HCl·Gly-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用500mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用100mL饱和碳酸氢钠水溶液，100mL饱和氯化钠水溶液，100mL饱和硫酸氢钾水溶液，100mL饱和氯化钠水溶液，100mL饱和碳酸氢钠水溶液，100mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，拌样，柱层析纯化，得45g(87.8％)标题化合物。

实施例8制备Boc-Arg(Tos)-Gly

用200mL甲醇溶解45g(78.3mmol)Boc-Arg(Tos)Gly-OBzl，向其中加入9g Pd/C，反应瓶上安装三通，水泵抽至真空，通入氢气，再次重复抽真空，通气2次，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失，滤除Pd/C，滤液减压浓缩，得31g(64.0％)标题化合物。

实施例9制备Boc-Asp(OMe)-Val-OBzl

称取5g(20.2mmol)Boc-Asp(OMe)，2.7g(19.9mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的5g(24.3mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入8.3g(22.0mmol)TosH·Val-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用100mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用20mL饱和碳酸氢钠水溶液，20mL饱和氯化钠水溶液，20mL饱和硫酸氢钾水溶液，20mL饱和氯化钠水溶液，20mL饱和碳酸氢钠水溶液，20mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，过滤，滤液减压浓缩，得8.1g(92.0％)标题化合物。

实施例10制备HCl·Asp(OMe)-Val-OBzl

冰浴下向8.1g(18.6mmol)Boc-Asp(OMe)Val-OBzl加入80mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液，反应4小时后，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失，减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解，减压浓缩。该操作也重复3次，得6.7g(97.1％)标题化合物。

实施例11制备Boc-Asp(OMe)-Phe-OBzl

称取3g(12.1mmol)Boc-Asp(OMe)，1.6g(11.8mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的3g(14.6mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入4g(13.7mmol)HCl·Phe-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用100mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用20mL饱和碳酸氢钠水溶液，20mL饱和氯化钠水溶液，20mL饱和硫酸氢钾水溶液，20mL饱和氯化钠水溶液，20mL饱和碳酸氢钠水溶液，20mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，过滤，滤液减压浓缩，得5.2g(88.1％)标题化合物。

实施例12制备HCl·Asp(OMe)-Phe-OBzl

冰浴下向5.2g(10.7mmol)Boc-Asp(OMe)Phe-OBzl加入50mL浓度为4M的氯化氢的乙酸乙酯溶液，反应4小时后，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失，减压浓缩。残留物用无水乙酸乙酯溶解，减压浓缩。该操作重复3次。残留物用无水***溶解，减压浓缩。该操作也重复3次，得4.3g(95.6％)标题化合物。

实施例13制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Val-OBzl

称取13g(26.8mmol)Boc-Arg(Tos)Gly，3.6g(26.6mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的6.5g(31.6mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入10.7g(28.6mmol)HCl·Asp(OMe)Val-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，滤液减压浓缩，残留物用400mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液，饱和50mL氯化钠水溶液，50mL饱和硫酸氢钾水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，过滤，滤液减压浓缩，得18.0g(83.7％)标题化合物。

实施例14制备Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Phe-OBzl

称取25g(51.5mmol)Boc-Arg(Tos)Gly，5.5g(40.6mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加THF溶解的11g(53.4mmol)DCC，搅拌活化30分钟后加入10.7g(40.4mmol)HCl·Asp(OMe)Phe-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝20/1)显示原料点消失。过滤除去DCU，减压浓缩至干，残留物用400mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用50mL饱和碳酸氢钠水溶液，饱和50mL氯化钠水溶液，50mL饱和硫酸氢钾水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液，50mL饱和碳酸氢钠水溶液，50mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，过滤，滤液减压浓缩，得30.2g(87.8％)标题化合物。

实施例15制备

Fmoc-Lys[Val-Asp-(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

称取4g(5.6mmol)Boc-Arg(Tos)GlyAsp(OMe)Val，780mg(5.8mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加2.6g(6.4mmol)溶于无水DMF的HATU，搅拌活化30分钟后加入5.6g(5.7mmol)HCl·Fmoc-Lys-Glu(OBzl)Asp(OBzl)Gly-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝5/1)显示原料点消失。减压浓缩，残留物用200mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和硫酸氢钾水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，拌样，柱层析纯化，得7.9g(85.9％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：1636.5[M+H]⁺。

实施例16制备

Fmoc-Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

称取1.6g(2.1mmol)Boc-Arg(Tos)GlyAsp(OMe)Phe，285mg(2.1mmol)HOBt，干燥四氢呋喃(THF)溶解，冰浴下搅拌，向其中滴加DMF溶解的1g(2.6mmol)HATU，搅拌活化30分钟后加入2.1g(2.2mmol)HCl·Fmoc-LysGlu(OBzl)Asp(OBzl)Gly-OBzl，NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝5/1)显示原料点消失。减压浓缩至干，残留物用200mL乙酸乙酯溶解，得到的乙酸乙酯溶液依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和硫酸氢钾水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液洗涤3次，乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥30分钟，拌样，柱层析纯化，得2.1g(60.0％)标题化合物。ESI-MS(m/z)：1684.5[M+H]⁺。

实施例17制备17-乙氧羰基甲氧乙酰基***

称取20g(51.5mmol)***用50mL DMSO溶解，置于冰浴下搅拌，称取1.3g(52.1mmol)NaH小心加入反应瓶中，量取17mL溴乙酸乙酯滴加到反应瓶中，室温反应2小时，然后向反应瓶中加入400mL乙酸乙酯，得到的溶液用饱和氯化钠水溶液洗5次，每次50mL，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得15.1g(62.9％)标题化合物。Mp：225-226℃，

(c＝0.1，CH₃OH)，ESI-MS(m/z)：479.84[M+H]⁺，¹H NMR(300MHz，CDCl₃)：δ/ppm＝7.23-7.20(d，J＝9Hz，1H)，6.36-6.33(d，J＝9Hz，1H)，6.12(s，1H)，4.52(m，2H)，4.40-4.37(d，J＝9Hz，1H)，4.22(m，4H)，3.11(m，1H)，2.39(m，3H)，1.81(m，3H)，1.56(m，5H)，1.30(m，4H)，1.08(s，3H)，0.95-0.92(d，J＝9Hz，3H)。

实施例18制备17-羧甲氧乙酰基***

用100mL甲醇溶解15.1g(31.6mmol)17-乙氧羰基甲氧乙酰基***，冰浴下用2N NaOH调节pH＝12，冰浴下反应并维持pH＝12，15小时后TLC(CH₂Cl₂/EA＝1/1)显示原料点消失。反应混合物用饱和硫酸氢钾水溶液调pH＝7，减压浓缩，残留物用200mL蒸馏水溶解，用饱和硫酸氢钾水溶液调pH＝2，用乙酸乙酯萃取3次，每次60mL，合并乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到的无色粉末用二氯化碳洗涤，过滤，收集滤饼，得12.8g(90.1％)标题化合物。Mp 232-233℃，ESI-MS(m/z)：449.3[M-H]^-，

(c＝0.1，CH₃OH)，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝7.31-7.28(d，J＝9Hz，1H)，6.23-6.20(d，J＝9Hz，1H)，6.01(s，1H)，5.30(m，1H)，5.04(s，1H)，4.45(m，2H)，4.19(m，1H)，4.03(s，2H)，2.91(m，1H)，2.61(m，1H)，2.34(m，2H)，2.16(m，2H)，1.75(m，1H)，1.61(m，1H)，1.49(s，3H)，1.33(m，1H)，1.08(m，1H)，0.87(s，3H)，0.80-0.77(d，J＝9Hz，3H)。

实施例19制备***-17-羰甲氧乙酰基-Lys[Val-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-GlyOBzl

将1.1g(2.4mmol)17-羧甲氧乙酰基***和240mg(1.8mmol)HOBt溶解于无水DMF中，冰浴搅拌下滴加941mg(2.5mmol)无水DMF溶解的HATU，搅拌30分钟后加入2.5g(1.8mmol)Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl，用NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝5/1)显示原料点消失。冰浴下向反应液中加入200mL饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次，每次50mL，合并乙酸乙酯层，依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和硫酸氢钾水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液各洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至1mL之后用层析硅胶拌样，柱层析纯化(CH₂Cl₂/MeOH＝15/1)，得1.6g(48.8％)标题化合物。Mp：137-140℃，

(c＝0.1，CH₃OH)，ESI-MS(m/z)：1845.8543[M+H]⁺，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：8.64-8.61(d，J＝9Hz，1H)，8.21(m，3H)，8.14(m，1H)，7.88(m，1H)，7.78(m，1H)，7.64(d，J＝9Hz，3H)，7.35(m，16H)，6.93-9.90(d，J＝9Hz，1H)，6.57(s，1H)，6.23-6.20(d，J＝9Hz，1H)，6.01(s，1H)，5.17(s，2H)，5.09(s，2H)，5.06(s，1H)，4.69(m，4H)，4.28(m，7H)，4.04(s，1H)，3.91(s，4H)，3.71(m，3H)，3.56(s，4H)，3.05(m，4H)，2.63(m，2H)，2.40(m，8H)，1.93(m，7H)，1.60(m，7H)，1.25(m，17H)，0.88(m，3H)，0.80(m，6H)。

实施例20制备***-17-羰甲氧乙酰基-Lys(Val-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly(5a)

称取285mg(0.15mmol)***-17-羰甲氧乙酰基-Lys-[Val-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-GlyOBzl于100mL茄瓶中，冰浴下加3mL三氟乙酸，搅拌15分钟后，加入1mL三氟甲磺酸，继续搅拌15分钟，加80mL无水***，使产物析出，搅拌5分钟，静置，沉降析出物，小心倾倒出液体。残留物加***洗涤，小心倾倒出液体。残留物加***洗涤，小心倾倒出液体。残留物减压除去溶剂，残留物加5mL蒸馏水溶解，得到的溶液用稀氨水调pH至7，过滤，滤液用Sephdex G10脱盐，冻干，得111mg(55.0％)标题化合物。Mp：107-108℃，

(c＝0.03，H₂O)，ESI-MS(m/z)：1303.5982[M+H]⁺，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.72(m，1H)，8.51(m，3H)，8.25(m，1H)，7.94(s，1H)，7.28-7.25(d，J＝9Hz，1H)，6.61(s，2H)，6.28(s，1H)，6.23-6.20(d，J＝9Hz，1H)，6.02(s，1H)，5.36(s，1H)，5.08(m，1H)，4.62(m，2H)，4.28(m，2H)，4.13(m，2H)，3.75(m，6H)，3.58(s，3H)，3.45(m，2H)，3.02(m，5H)，2.74(m，4H)，2.22(m，6H)，1.72(m，7H)，1.52(m，8H)，0.95(s，3H)，0.81(m，6H)。

实施例21制备***-17-羰甲氧乙酰基

-Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl

将1.3g(2.9mmol)17-羧甲氧乙酰基***和278mg(2.1mmol)HOBt溶解于无水DMF中，冰浴下搅拌，向其中滴加1.1g(2.9mmol)无水DMF溶解的HATU，搅拌30分钟后加入3.0g(2.1mmol)Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl，用NMM调pH＝8，室温反应12小时，TLC(CH₂Cl₂/MeOH＝5/1)显示原料点消失。冰浴下向反应液中加入饱和氯化钠溶液200mL，乙酸乙酯萃取3次，每次50mL，合并乙酸乙酯层，依次用30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和硫酸氢钾水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液，30mL饱和碳酸氢钠水溶液，30mL饱和氯化钠水溶液各洗涤3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩至1mL之后用层析硅胶拌样，柱层析纯化(CH₂Cl₂/MeOH＝15/1)，得2.1g(53.7％)标题化合物。Mp：136.8-140.0，

(c＝0.1，CH₃OH)，ESI-MS(m/z)：1893.8525[M+H]⁺，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.65-8.62(d，J＝9Hz，1H)，8.20(m，6H)，7.96-7.93(d，J＝9Hz，1H)，7.78(s，3H)，7.65-7.62(d，J＝9Hz，3H)，7.27(m，25H)，6.95(m，2H)，6.77(s，1H)，6.56，(s，1H)，6.24-6.21(d，J＝9Hz，1H)，6.01(s，1H)，5.28(s，1H)，5.17(s，2H)，5.09(m，4H)，4.66(m，3H)，4.31(m，7H)，4.16(m，2H)，3.92(s，4H)，3.70(m，2H)，3.56(s，4H)，2.75(m，10H)，2.34(m，8H)，1.99(m，9H)，1.38(m，17H)，0.88(s，3H)。

实施例22制备***-17-羰甲氧乙酰基-Lys(Phe-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly(5b)

称取***-17-羰甲氧乙酰基-Lys[Phe-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl 526mg(0.28mmol)于100mL茄瓶中，冰浴下加入三氟乙酸3mL，搅拌15分钟后加入三氟甲磺酸1mL，继续反应15分钟加入80mL无水***，使产物析出，搅拌5分钟后停止，静置、沉降析出物，小心倾倒出液体。残留物加***洗涤，小心倾倒出液体。残留物加***洗涤，小心倾倒出液体。残留物减压除去溶剂，残留物加5mL蒸馏水溶解，得到溶液稀氨水调pH至7，过滤，滤液用Sephdex G10脱盐，冻干，得142mg(37.8％)标题化合物。Mp：96.7-97.3，

(c＝0.03，H₂O)，ESI-MS(m/z)：1355.27[M+H]⁺，¹H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.26(m，1H)，7.62(m，4H)，7.23(m，9H)，6.22-6.19(d，J＝9Hz，1H)，6.01(s，1H)，5.37(s，1H)，4.58(m，1H)，4.25(m，3H)，3.76(m，9H)，3.00(m，10H)，2.62(m，3H)，2.34(m，4H)，2.12(m，6H)，1.65(m，8H)，1.17(m，3H)，0.91(m，3H)。

实验例1测定5a，b的透射电镜照片

将5a，b配成浓度为1.43×10^-6M的水溶液，然后将此溶液滴在铜网上，挥发干溶剂后在JEM-1230透射电子显微镜下观察纳米形态。测定表明，5a，b形成规则的纳米球。作为代表性照片，图2是浓度为1.43×10^-6M的5a，b的透射电镜照片。结果表明，5a，b的纳米结构为直径小于100nm的纳米球。可见，5a，b的纳米结构非常有利于它们在体内输送。

实验例2评价5a，b对小鼠耳后心肌组织移植的影响

受体鼠(Balb/c小鼠，雄性，体重20±2g)经10％乌拉坦(10mg/10g体重)腹腔注射麻醉。1％新洁尔灭酊耳廓局部消毒，持眼科剪于耳廓背侧中线之前1/3处作一与耳廓中线垂直处作一3-4毫米长的切口，勿损伤耳廓静脉。持镊子向耳尖方向钝性分离皮下组织，使之成一管腔。将新生供鼠(C57bl/6j24小时乳鼠)置于碎冰中一分钟，用75％酒精皮肤消毒，剖胸摘取心脏。将心脏置于PBS液内搏动1-2次，排空心腔余血。移植时，用刀片把供心纵向剖成为基本等大的两半，肌纤维成一斜面。将心肌组织移植填入受体鼠耳腔内，心肌组织的离体时间不超过2分钟。用手指轻按局部，使移植物与受鼠之周围组织贴紧。移植术后当天给药。空白对照为生理盐水，5a，b用生理盐水溶解，均口服给药，剂量为0.1μmol/kg/d，0.2mL/20g体重，连续给药15天，共给药15次。术后第7日起每天记录移植心肌组织的心电信号，测试异位心电图时，正负电极分别置于移植心脏两侧，接地极连接在小鼠后肢。

绘制移植心肌存活曲线图3。结果表明，在术后第17天5a，b组才出现移植心肌死亡，心肌存活率比***大幅度提高。该结果说明，在0.1μmol/kg/d的剂量下5a，b显著地抑制移植心肌组织的排斥反应。与发明人曾经公开结构A的化合物的有效剂量(1.43μmol/kg)相比，本发明的有效剂量降低了14倍。与发明人曾经公开结构B的化合物的有效剂量(2.0和7.0mmol/kg)相比，本发明的有效剂量降低了2000倍和7500倍。显然，本发明取得了意想不到的抑制移植心肌组织排斥反应的结果。

实验例3用小鼠二甲苯致炎模型评价5a，b的抗炎活性

使用小鼠二甲苯致炎模型评价5a，b抗炎活性。***和5a，b均一次给药，***的口服剂量为25.5μmol/kg，5a，b的口服剂量均为2.55μmol/kg。生理盐水为空白对照。ICR雄性小鼠(体重20±2g)随机分为空白对照组，阳性组及给药组，每组10只。静息一天，操作间维持温度为22℃，实验开始，口服给药，单次给药30min后，往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μL二甲苯，2h后断臼处死小鼠，剪下左右两耳，用7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片，称重，求出两耳肿胀差值，作为肿胀度，肿胀度＝左耳圆片重量-右耳圆片重量。

表1数据说明，在2.55μmol/kg剂量下5a，b有效地抑制小鼠的炎症反应。与发明人曾经公开结构A的化合物的有效剂量(25.5μmol/kg)相比，本发明的有效剂量降低了10倍。发明人曾经公开结构B的化合物没有抗炎症活性。显然，本发明取得了意想不到的抑制炎症的结果。

表1 本发明的化合物对小鼠耳肿胀度的影响

n＝10，口服给药，双样本等方差t检验；a)与生理盐水组相比P＜0.01；b)与生理盐水和***组相比P＜0.01。

实验例4评价5a，b对小鼠股骨的影响

实验例2中小鼠待移植心肌全部死亡后断臼处死，取股骨称重并测定骨密度。表3的数据说明，在0.1μmol/kg剂量下5a，b不会引起小鼠产生骨质疏松症。与发明人曾经公开结构A的化合物不引起骨质疏松的有效剂量(1.43μmol/kg)相比，本发明的有效剂量降低了10倍。发明人曾经公开结构B的化合物没有抗骨质疏松活性。显然，本发明取得了意想不到的抗骨质疏松的结果。

表2 本发明的化合物对股骨的重量和密度影响

n＝10，口服给药，连续给药15天，双样本等方差t检验：a)与生理盐水组相比，P＜0.05；b)与生理盐水组相比P＞0.05，与***相比P＜0.05。

实验例5评价5a，b对血栓形成的影响

将雄性SD大鼠随机分为组：空白对照为生理盐水，阳性对照为阿司匹林，剂量167μmol/kg；给药组***及5a，b剂量均为0.99μmol/kg。口服给药30分钟后，乌拉坦(20 g/100mL，7mL/kg)麻醉。分离右颈动脉和左颈静脉，把一根6cm长的事先精密称重的丝线放在聚乙烯管中，将插管充满抗凝剂肝素钠(0.42mg/mL，0.42mg/kg)的生理盐水溶液后，一端***左侧静脉，注射定量肝素钠抗凝，然后***右侧动脉。血流从右侧动脉流经聚乙烯管流入左侧静脉，循环15分钟。15min后取出丝线，精确称重，计算增重，统计化合物的抗血栓活性。结果列入表3。表3的数据说明，在0.99μmol/kg剂量下5a，b有效地抑制大鼠形成血栓。发明人曾经公开结构A和B的化合物都没有抗血栓活性。显然，本发明取得了意想不到的抗血栓的结果。

表3 本发明的化合物的抗血栓活性

n＝9，口服给药，0.99μmol/kg，双样本等方差t检验.a)与生理盐水相比P＜0.01；b)与生理盐水相比P＜0.05；c)与生理盐水和***组相比P＜0.01。

Claims

1.下式的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***,

式中AA为L-Val或L-Phe残基。

2.制备权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***的方法,该方法包括三大步骤:

1)在DMSO中,NaH催化***17位羟乙酰基的羟基与溴乙酸乙酯脱HBr,将17位羟乙酰基转化为乙氧羰基甲氧乙酰基，再在NaOH溶液中将17位乙氧羰基甲氧乙酰基转化为17位羧甲氧乙酰基；

2)按照标准的液相接肽法,逐步接肽,将L-Boc-Lys的侧链氨基与羧端游离的全保护的RGDV或RGDF的羧端偶联,将L-Lys的羧端与α-氨基游离的全保护的Glu-Asp-Gly的N端偶联,制备全保护的八肽Fmoc-Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl,然后在20％哌啶的DMF溶液中脱Fmoc制备N游离的全保护八肽Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl,式中AA为L-Val或L-Phe残基；

3)在HATU,HOBt和NMM存在下,在无水DMF中,先将步骤1得到的***-17-羧酸与步骤2得到的Lys[AA-Asp(OMe)-Gly-Arg(Tos)-Boc)]-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl偶联,再在三氟乙酸中用三氟甲磺酸脱去全部保护基,制得权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***。

3.权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***的纳米球。

4.权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***在制备免疫抑制剂中的应用,其特征在于制得的免疫抑制剂克服了***引起的松骨质疏松和血栓副作用。

5.权利要求1的八肽Lys(AA-Asp-Gly-Arg)-Glu-Asp-Gly修饰的***在制备抗炎剂中的应用,其特征在于制得的抗炎剂克服了***引起的松骨质疏松和血栓副作用。