CN105567591A - 一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物肥料领域，具体是一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用。本发明低温生防菌剂的有效成分为假单胞菌VT-B5，有效活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g及以上。制备本发明所述低温生防菌剂的固态发酵方法，包括如下步骤：1)菌种活化；2)一级种子液制备；3)二级种子液制备；4)固态发酵；5)发酵产物经干燥处理后添加稳定剂和助剂，粉碎、包装，得到低温生防菌剂。本发明的低温生防菌剂产品性能好，质量优，能明显改善土壤性状、提高植物抗逆性和抗病性、提高作物品质，增产保收。本发明的固态发酵方法生产工艺，具有生产成本低、工艺稳定、环境友好的特点。

Description

一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物肥料领域，具体是一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用。

背景技术

植物病害是影响农业生产的自然灾害之一，对植物病害的防治有三种途径：化学防治、物理防治、生物防治。三种方法各有其优缺点，化学防治见效快、杀菌广、成本低，可长期使用会导致土壤、大气等环境污染，而且存在食品安全问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已被严格限制使用；物理防治安全环保，可效率低、成本高、费时费工；生物防治作为一种高效且无毒、无害、无污染、不产生抗药性的植物病害防治方法，不仅符合人们对绿色食品的需求，而且为农业可持续发展提供了保障。因此，生防菌剂越来越受到科研人员以及广大种植者的重视。

生物防治是指利用有益微生物或微生物代谢产物对植物病害进行有效防治的技术与方法，其实质是利用微生物中间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过微生物代谢产物诱导植物抗病等，来抑制某些病原物的存活或活动。目前，有许多有益微生物产品已在农业种植中得到运用，如苏云金芽胞杆菌菌剂、枯草芽胞杆菌菌剂、多菌灵、克线灵等。生防菌剂在实际应用中会受到诸多外界因素影响或制约，如光照、温度、湿度、土壤pH值等，从而导致不能起到很明显的防治病虫害的作用。

在我国北方地区或南方冬季温度低下，一般微生物生长代谢活动明显受到温度的抑制，具备生物防治功能的菌剂此刻因受到温度的影响而不能发挥生物防治的功能。开发和生产低温生防菌剂可避免菌剂的应用受到天气温度的制约，扩大生物防治的应用范围，具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现状，提供一种低温生防菌剂及其固态发酵方法和应用。

本发明提供的一种低温生防菌剂，其有效成分为假单胞菌VT-B5，有效活菌素为1.0×10¹⁰cfu/g及以上。

本发明所述假单胞菌VT-B5(Pseudomonassp)可从北京沃土天地生物科技股份有限公司购买得到。

本发明还提供制备所述低温生防菌剂的固态发酵方法，包括如下步骤：

1)菌种活化；

2)一级种子液制备：将假单胞菌VT-B5接种至液体培养基进行一级种子液制备；

3)二级种子液制备：以糖蜜培养基进行假单胞菌VT-B5二级种子液制备；

4)固态发酵：利用以麦麸、豆粕和谷壳为主要原料的固态发酵培养基，接种假单胞菌VT-B5二级种子液进行固态发酵，制备低温微生物菌剂；

5)发酵产物经干燥处理后添加稳定剂和助剂，粉碎、包装，得到低温生防菌剂。

其中，所述以麦麸、豆粕和谷壳为主要原料的固态发酵培养基，由如下重量份的原料混合而成：豆粕400份、麦麸300份、谷壳100份、葡萄糖50份、磷酸二氢钾5份、硫酸铵10份、甘油10份、水750～850份。

其中，所述糖蜜培养基，由如下重量份的原料制成：糖蜜30.0份、玉米浆粉20.0份、磷酸二氢钾0.5份、氯化钠4.0份、七水硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份，水1000.0份。

本发明制备所述低温生防菌剂的固态发酵方法，具体步骤为：

1)菌种活化：将假单胞菌VT-B5接种至NA固体培养基斜面，于20～25℃条件下培养1～2天；

2)一级种子液制备：将步骤1)培养得到的单菌落接种于50mL/250mLNA液体培养基，20℃～25℃、120～170r/min培养至OD₆₀₀值3.0-4.0，制得一级种子液；

3)二级种子液制备：将一级种子液按体积质量比2.0％～3.0％的接种量接种至糖蜜培养基中，20℃～25℃、150～200r/min，通气量1.2～1.5VVM培养至OD₆₀₀值3.0-4.0，制得二级种子液；

4)固态发酵：将二级种子液按3.0％～4.0％的体积质量比接种到以麦麸、豆粕和谷壳为主要原料的固态发酵培养基上，于20℃～25℃、相对湿度为60％～80％条件下，静态培养2～3天，得到固态低温菌产物；

5)后处理：将固态低温菌产物低温干燥后粉碎，粉碎同时添加稳定剂和助剂，混匀，包装，得到低温生防菌剂。

其中，所述NA固体培养基，由如下重量份的原料制成：蛋白胨10.0份、牛肉膏5.0份、氯化钠5.0份，水1000.0份。

其中，所述NA液体培养基，由如下重量份的原料制成：蛋白胨10.0份、牛肉膏5.0份、氯化钠5.0份、琼脂15～20份，水1000.0份。

其中，所述NA固体培养基和NA液体培养基的pH值范围均为7.0-7.4。

其中，所述稳定剂和助剂为微生物菌剂常用稳定剂和助剂，例如：甘油、甘露醇、聚乙烯醇、山梨醇中的一种或多种。稳定剂和助剂的添加量为常规添加量，一般为质量百分含量0.5％～3％。

其中，步骤2)、步骤3)所述培养的时间均为1～2天。

其中，步骤3)所用糖蜜培养基，先在115℃～125℃高温高压灭菌20～30min，冷却后使用。

其中，步骤4)所用固态发酵培养基，初始质量百分含水量为50％～55％，初始pH为6.5～7.0，经115℃～125℃高温高压灭菌40～60min，冷却后使用。

其中，步骤5)所述低温干燥为40℃～50℃低温干燥至质量百分含水量10％。

本发明还提供所述低温生防菌剂在作为在作物种植过程中与基肥同用(沟施或穴施或撒施)或作追肥使用。用量为5～10kg/亩，可根据不同的作物和土壤肥力，酌情增减。物种植中的应用。

所述应用具体

本发明还提供所述制备低温生防菌剂的固态发酵方法在微生物菌剂生产中的应用。

本发明的优点在于：

本发明所述的低温生防菌剂固态发酵生产工艺稳定，环境友好，产品有效活菌数高。该低温生防菌剂可在南方冬季或北方全年作物种植时使用，能在低温条件下繁殖及生长代谢，定植于作物根际，通过产生多种抗生素作用于其他微生物，调节植物根圈环境中的微生物区系，改善微生态环境，减少病害的发生，促进植物生长，提高作物抗逆性，增产保收。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1低温生防菌剂的固态发酵生产

按如下配方配制各种培养基：

NA固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g，纯水1.0L，pH值7.0-7.4。

NA液体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠5.0g、琼脂15～20g，纯水1.0L，pH值7.0-7.4。

糖蜜培养基：糖蜜30.0g、玉米浆粉20.0g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钠4.0g、七水硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g，纯水1.0L。

固态发酵培养基：豆粕400g、麦麸300g、谷壳100g、葡萄糖50g、磷酸二氢钾5g、硫酸铵10g、甘油10g、水0.750～0.850L，混合均匀。

1)菌种活化：无菌条件下，将假单胞菌VT-B5接种至NA培养基斜面，于22℃条件下培养2天；

2)一级种子液制备：将步骤1)培养的菌种于无菌条件下分别挑取菌落形态优良的单菌落接种于50mL/250mLNA液体培养基，放置22℃、160r/min恒温振荡摇床中培养2天。菌种液体培养OD₆₀₀值3.2时停止培养，制得一级种子液；

3)二级种子液制备：将步骤2)制备的假单胞菌VT-B5一级种子液按体积质量比2.0％的接种量接种至经121℃高温高压灭菌20min后冷却的糖蜜培养基中，发酵温度为22℃、搅拌转速180r/min，通气量保持1.4VVM，培养2天。菌种液体培养OD₆₀₀值3.7时停止培养，制得二级级种子液；

4)固态发酵：以麦麸、豆粕和谷壳为固态发酵培养基主要原料，固态培养基初始含水量为55％，初始pH为7.0，经125℃高温高压灭菌60min，冷却后按3％的体积质量比接种二级种子液，搅拌均匀，于温度为25℃、相对湿度为60％～80％条件下，静态培养2天，得到固态低温菌产物；

5)后处理：将发酵结束的固态低温菌产物转移至干燥室，进行45℃低温干燥处理至含水量为10％后进行粉碎，粉碎同时添加微生物菌剂常用稳定剂和助剂，具体为甘油、甘露醇、聚乙烯醇、山梨醇等质量混合后添加，总添加量为质量百分含量3％，混合均匀，包装。

通过以上步骤，最终获得的菌剂活菌数达1.8×10¹⁰cfu/g。

实施例2低温生防菌剂的固态发酵生产

所用培养基的配方参见实施例1。

1)菌种活化：无菌条件下，将假单胞菌VT-B5接种至NA培养基斜面，于25℃条件下培养2天；

2)一级种子液制备：将步骤1)培养的菌种于无菌条件下分别挑取菌落形态优良的单菌落接种于50mL/250mLNA液体培养基，放置25℃、160r/min恒温振荡摇床中培养2天。菌种液体培养OD₆₀₀值3.6时停止培养，制得一级种子液；

3)二级种子液制备：将步骤2)制备的假单胞菌VT-B5一级种子液按体积质量比2.0％的接种量接种至经121℃高温高压灭菌20min后冷却的糖蜜培养基中，发酵温度为25℃、搅拌转速180r/min，通气量保持1.4VVM，培养2天。菌种液体培养OD₆₀₀值4.0时停止培养，制得二级级种子液；

4)固态发酵：以麦麸、豆粕和谷壳为固态发酵培养基主要原料，固态培养基初始含水量为55％，初始pH为7.0，经125℃高温高压灭菌60min，冷却后按3％的体积质量比接种二级种子液，搅拌均匀，于温度为25℃、湿度为60％～80％条件下，静态培养3天，得到固态低温菌产物；

5)后处理：将发酵结束的固态低温菌产物转移至干燥室，进行45℃低温干燥处理至含水量为10％后进行粉碎，粉碎同时添加微生物菌剂常用稳定价和助剂，具体为甘露醇，添加量为质量百分含量3％，混合均匀，包装。

通过以上步骤，最终获得的菌剂活菌数达2.2×10¹⁰cfu/g。

实施例3低温生防菌剂的应用

本发明低温生防菌剂适用于北方作物种植以及南方冬季作物种植全生育期，在作物移植前与有机肥混合均匀后撒施或在作物移栽穴施作物根际周围。

根据要求生产出来的低温生防菌剂在北京、河北、山东、云南等地的大棚番茄、芹菜、草莓、辣椒等蔬菜作物上对比示范试验。

试验结果表明：低温生防菌剂对蔬菜作物的炭疽病、白绢病、枯萎病等有也十分显著的效果，而且提高了作物产量、产品品质也十分优良。

本次在番茄种植过程中使用实施例1制备的低温生防菌剂，使用量为5kg/亩，随底肥施入土壤中，试验中统计产量、平均株高和炭疽病、白绢病、枯萎病的发病率，试验效果如下：

表1本发明低温生防菌剂的使用效果

项目	不施菌剂	施菌剂
			亩产量	0.65万斤	0.85万斤
发病率	20％	3％
			平均株高	80.1cm	87.2cm
亩产量提高	-	30.08％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种低温生防菌剂，其特征在于，其有效成分为假单胞菌VT-B5，有效活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g及以上。

2.制备权利要求1所述的固态发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)菌种活化；

2)一级种子液制备：将假单胞菌VT-B5接种至液体培养基进行一级种子液制备；

3)二级种子液制备：以糖蜜培养基进行假单胞菌VT-B5二级种子液制备；

4)固态发酵：利用以麦麸、豆粕和谷壳为主要原料的固态发酵培养基，接种假单胞菌VT-B5二级种子液进行固态发酵，制备低温微生物菌剂；

5)发酵产物经干燥处理后添加稳定剂和助剂，粉碎、包装，得到低温生防菌剂。

3.根据权利要求2所述的固态发酵方法，其特征在于，所述以麦麸、豆粕和谷壳为主要原料的固态发酵培养基，由如下重量份的原料混合而成：豆粕400份、麦麸300份、谷壳100份、葡萄糖50份、磷酸二氢钾5份、硫酸铵10份、甘油10份、水750～850份。

4.根据权利要求2所述的固态发酵方法，其特征在于，所述糖蜜培养基，由如下重量份的原料制成：糖蜜30.0份、玉米浆粉20.0份、磷酸二氢钾0.5份、氯化钠4.0份、七水硫酸镁0.2份、硫酸锰0.05份，水1000.0份。

5.根据权利要求2～4任意一项所述的固态发酵方法，其特征在于，具体步骤为：

1)菌种活化：将假单胞菌VT-B5接种至NA固体培养基斜面，于20～25℃条件下培养1～2天；

2)一级种子液制备：将步骤1)培养得到的单菌落接种于50mL/250mLNA液体培养基，20℃～25℃、120～170r/min培养至OD₆₀₀值3.0-4.0，制得一级种子液；

3)二级种子液制备：将一级种子液按体积质量比2.0％～3.0％的接种量接种至糖蜜培养基中，20℃～25℃、150～200r/min，通气量1.2～1.5VVM培养至OD₆₀₀值3.0-4.0，制得二级种子液；

4)固态发酵：将二级种子液按3.0％～4.0％的体积质量比接种到以麦麸、豆粕和谷壳为主要原料的固态发酵培养基上，于20℃～25℃、相对湿度为60％～80％条件下，静态培养2～3天，得到固态低温菌产物；

5)后处理：将固态低温菌产物低温干燥后粉碎，粉碎同时添加稳定剂和助剂，混匀，包装，得到低温生防菌剂。

6.根据权利要求5所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤3)所用糖蜜培养基，先在115℃～125℃高温高压灭菌20～30min，冷却后使用。

7.根据权利要求5所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤4)所用固态发酵培养基，初始质量百分含水量为50％～55％，初始pH为6.5～7.0，经115℃～125℃高温高压灭菌40～60min，冷却后使用。

8.根据权利要求5所述的固态发酵方法，其特征在于，步骤5)所述低温干燥为40℃～50℃低温干燥至质量百分含水量10％。

9.权利要求1所述低温生防菌剂在作物种植中的应用。

10.权利要求2-8任一项所述制备低温生防菌剂的固态发酵方法在微生物菌剂生产中的应用。