CN105561957B - 钛‑锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料及其合成方法和应用 - Google Patents

钛‑锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米材料与检测技术领域，具体为一种基于花粉为模板的钛‑锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法及其应用。本发明利用一锅法合成包聚有钛‑锆双金属氧化物的花粉粒子，在高温下煅烧后形成以花粉粒子为模板的双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料。该材料具有大的比表面积，强亲水性和较好的生物相容性，煅烧除去模板花粉的同时发生了钛‑锆双金属原子水平掺杂形成双金属氧化物，使得复合材料能够与含有负电荷的磷酸根的磷酸化肽段更好的发生配位作用，从而实现对低丰度磷酸化肽混合样品的高效分离富集。本发明新颖简便，成本低廉，实用高效，重复性好，稳定性高，具有广阔宽的应用前景。

Description

钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料及其合成 方法和应用
技术领域
本发明属于先进纳米材料与检测技术领域，具体涉及一种钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料及其合成方法和应用。
技术背景
随着人类基因组测序计划的完成，对蛋白质组学的研究已成为生命科学领域研究的重点。蛋白的可逆磷酸化是生物细胞内最普遍的一种蛋白的翻译后修饰，在细胞发育、新陈代谢、疾病监控、信号传导、酶活性调控、基因表达等生命过程中起着不可替代的作用。目前，生物质谱技术被广泛应用于蛋白翻译后修饰分析中，但由于磷酸化蛋白/肽段的低丰度和较低的电离效率，以及磷酸化肽的质谱信号往往被非磷酸化肽所抑制，导致直接用质谱进行分析检测将会面临巨大挑战。因此对于复杂生物样品中的磷酸化蛋白/肽段在质谱分析前进行选择性分离、富集，是成功鉴定磷酸化蛋白/肽段的重要过程。
近年来，多种方法策略被开发用来选择性分离富集磷酸化蛋白/肽段，其中金属氧化物亲和色谱方法（MOAC）成为研究的热点，MOAC方法相比于其它方法显示出诸多优越性，例如：快速富集、操作简便、成本低廉的特性。其中二氧化钛和二氧化锆都是对于磷酸化蛋白/肽段高效分离、富集的金属氧化物，但将钛-锆两种氧化物进行混合，不仅仅是发生物理混合，而是在材料合成过程中发生了原子层面掺杂，形式新型的双金属氧化物，能够更好地发挥其在磷酸化蛋白/肽段高效分离、富集的协同作用。
花粉做为一种自然界中广泛存在天然产物，由于其独特的生物结构，表面含有大量固有官能团，高比表面积以及良好的生物兼容性，被广泛应用于诸多领域。结合花粉颗粒这一独特结构，本发明设计了一种基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料，合成方法简单新颖。以花粉颗粒为模板，外面包裹形成钛-锆双金属氧化物，在高温煅烧下，除去花粉模板的同时，钛-锆双金属原子发生水平掺杂，形成了蜂窝状介孔复合材料。该合成材料对于低丰度磷酸化蛋白/肽段的鉴定达到了令人满意的结果。
发明内容
本发明目的在于提供一种合成成本低、稳定性好、重复率高的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料及其合成方法，以及其在磷酸化肽分离、富集与MALDI-TOF-MS检测中的应用。
本发明提供的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法，是基于花粉为模板的，具体步骤如下：
（1）花粉样品的处理：将氯仿和甲醇溶液按照1:（3-4）体积比均匀混合；将研磨后的花粉颗粒（PGs）浸泡在上述混合溶液中，过夜；过滤除去混合溶液后，将花粉颗粒在80-100℃的甲醇溶液中加热回流24-30小时；冷却后离心分离，并用去离子水充分洗涤，40-60℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物PGs分散在异丙醇溶液中，超声0.5-1.0小时；
（3）将异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺加入到步骤（2）所得混合溶液中，充分搅拌0.5-1.0小时；
（4）将步骤（3）所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220℃下加热22-24小时；
（5）将步骤（4）中高压反应釜冷却至室温，所得产物经过离心分离，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料，40-60℃下真空干燥；
（6）将步骤（5）所得产物在600-800℃下高温煅烧2-3小时，即得到钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料，记为PGs@(Ti-Zr)O4。
本发明中，步骤（1）中氯仿和甲醇溶液的体积比优选为：1：3.5。
本发明中，步骤（2）中PGs的用量为70-75mg，异丙醇溶液体积为85-90mL。
本发明中，步骤（3）中异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺的比例为（1.5-2.0mL）：（1.0-1.5g）：（0.04-0.05mL）。
本发明中，步骤（5）中高温煅烧温度优选600-700℃。
本发明制备的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料可用于磷酸化肽分离、富集与质谱鉴定中，具体操作如下：将产物基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料与目标磷酸化肽溶液充分混合，加入40-60%乙腈/0.05-0.15%三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在37-38℃酶解仪中孵育；通过离心分离出复合材料，用40-60%乙腈/0.05-0.15%三氟乙酸缓冲液洗涤复合材料3-4次，用0.3-0.5M氨水洗脱；取0.8-1.5μL洗脱液点在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8-1.5μL浓度为15-25 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。
将原本得不到磷酸化肽段鉴定信号的蛋白酶解液，利用该合成的复合材料进行富集后进行质谱检测，可以得到清晰、信噪比高的磷酸化肽段信号峰，该富集策略已经实践于β-casein蛋白酶解液、β-casein与牛血清白蛋白混合溶液酶解液、正常人血清、脱脂牛奶酶解液和小鼠鼠肝等多项实验中。
本发明的有益效果在于：所提供的花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法简单，制备所得复合材料具有良好的亲水性孔道结构、优异的生物相容性和大比表面积，对磷酸化肽的富集具有很强的选择性和卓越的灵敏度，可作为一种有效的固相微萃取材料应用于磷酸化肽的富集分离。该材料设计结合以花粉颗粒这一独特结构为模板，外面包裹形成钛-锆双金属氧化物，在高温煅烧下，除去花粉模板的同时，钛-锆双金属原子发生水平掺杂，形成了蜂窝状介孔复合材料。该合成材料对于低丰度磷酸化蛋白/肽段的鉴定达到了令人满意的结果。实验结果充分证明，本发明制得的复合材料合成成本低、稳定性好、重复率高，适用于各种复杂生物样品中，在大规模分析磷酸化肽样品中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成流程图。
图2为实施例1的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的透射电子显微镜（a）和能量谱图（b）照片。
图3为实施例1的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的元素分析谱图。
图4为实施例2中100 nM的β-casein酶解液（a）和（b）经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。
图5为实施例3中质量比为1：1500的β-casein和BSA蛋白酶解混合溶液（a）选择性富集前和（b）经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。
图6为实施例4中质量比为1：1000: 1000的β-casein蛋白酶解液、α-casein蛋白和BSA蛋白混合溶液（a）、（b）选择性富集前和（c）、（d）经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集前的质谱图。
图7为实施例5中0.1fmol/μL的β-casein酶解液（a）选择性富集前和（b）经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。
图8 为实施例6中正常男性/女性（同岁）血清溶液中的肽段（a）和（b）经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。
图9 为实施例7中脱脂牛奶溶液中的肽段（a）和（b）经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料选择性富集后的质谱图。
具体实施方式
实施例1：一种基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成。
（1）花粉样品的处理：将氯仿和甲醇溶液按照1:3.5体积比均匀混合，之后将研磨后的花粉颗粒（PGs）浸泡在上述混合溶液，浸泡过夜；过滤除去混合溶液后，在80 ℃下，将花粉颗粒在甲醇溶液中加热回流24小时；冷却后离心分离，并用去离子水充分洗涤5次，50℃下真空干燥；
（2）将步骤（1）所得产物PGs 70 mg分散在90 mL异丙醇溶液中，超声0.5小时；
（3）加入异丙醇钛（1.5 mL）、异丙醇锆（1.0 g）和二乙胺（0.04 mL）到步骤（2）所得混合溶液中，充分搅拌1.0小时；
（4）将步骤（3）所得混合溶液充分搅拌后转移至水热反应釜中，200 ℃下加热24小时；
（5）将步骤（4）中高压反应法冷却至室温，所得产物经过离心分离，并用去离子水和无水乙醇各分别洗涤5次以除去多余的原料，50 ℃下真空干燥；
（6）将步骤（5）所得产物在600 ℃高温下煅烧2小时，制得PGs@(Ti-Zr)O4。
图1为所得的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成流程图。
图2为所得的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的透射电子显微镜照片。a为使用的透射电子显微镜型号为日本株式会社2011显微镜；b为使用的场发射透射电子显微镜型号为FEI Tecnai G2 F20 S-Twin。
图3为所得的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的元素分析谱图，使用的场发射透射电子显微镜型号为FEI Tecnai G2 F20 S-Twin。
实施例2：将基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料应用于标准β-casein酶解液中磷酸化肽的富集与MALDI-TOF-MS检测，具体步骤如下：
（1）标准β-casein蛋白酶解液的制备：准确称取1 mg标准蛋白β-casein溶于25 mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，用25 mM碳酸氢铵缓冲液稀释到1 mg/mL，然后按照与蛋白质量比1：40加入适量的胰蛋白酶，37 ℃下酶解16小时；
（2）将10 mg钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料用含50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤3次，之后分散于1 mL的50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，超声分散至均匀，配置成10 mg/mL溶液；
（3）试样的富集：取50 μL步骤（2）所得溶液，加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液（50 μL）；之后加入β-casein标准蛋白酶解液，使得肽段浓度为100 nM，在37 ℃下孵育反应30分钟；通过离心分离出复合材料，用200 μL 0.1 %的50 %乙腈缓冲液洗涤三次后，用10 μL 0.4M氨水洗脱15分钟，离心分离；
（4）点靶：取1μL步骤（3）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL, 含1% H3PO4的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图4可以看出，在富集前，浓度为100 nM的β-casein标准蛋白酶解液中难以鉴定到磷酸化肽段（图4a），然而经过基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料富集之后，质谱图中出现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 3122,m/z= 2556和m/z= 2061）和三条源于α-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 1660，m/z=1466和m/z= 1278）以及一些去磷酸化碎片峰，磷酸化肽段的信号峰得到了显著提升（图4b）。
实施例3：将实施例1得到的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料应用于β-casein酶解液和牛血清白蛋白（BSA）酶解液混合溶液的富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取1mg标准蛋白β-casein和10mg标准蛋白BSA分别溶于1 mL的25 mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，按照与蛋白质量比1：40向1 mg/mLβ-casein蛋白溶液和10 mg/mL BSA蛋白溶液中加入适量的胰蛋白酶，37℃下酶解16小时。
（2）试样的富集：按蛋白质量比1:1500将β-casein酶解液与BSA酶解液混合，取2μL标准蛋白酶解液混合溶液加到150μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，再加入50μL的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的分散液（浓度为10 mg/mL），37℃下孵育混旋30分钟；通过离心分离出材料，用200μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10 μL 0.4M氨水洗脱15分钟，离心分离。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL, 含1% H3PO4的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图5可以看出，在富集前，质量比为1：1500的β-casein和BSA蛋白酶解液混合溶液中出现大量BSA酶解肽段峰，难以鉴定到磷酸化肽段（图5a）；然而蛋白酶解液混合溶液经过基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 3122.27, m/z= 2556.09和m/z=2061.83）和四条去磷酸化峰（m/z= 3041，3024，2458，1963）以及一条源于α-casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z=1466.51)（图5b）。
实施例4：将实施例1得到的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料应用于β-casein酶解液及α-casein蛋白和牛血清白蛋白（BSA）混合溶液的富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取1mg标准蛋白β-casein和10mg标准蛋白BSA分别溶于1 mL的25 mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，按照与蛋白质量比1：40向1 mg/mLβ-casein蛋白溶液和10 mg/mL BSA蛋白溶液中加入适量的胰蛋白酶，37℃下酶解16小时。
（2）试样的富集：按质量比1:1000:1000将β-casein酶解液与α-casein蛋白和BSA蛋白进行混合，取2μL混合溶液加到150μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，再加入50μL的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的分散液（浓度为10mg/mL），37℃下孵育混旋30分钟；通过离心分离出材料，用200μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10 μL 0.4M氨水洗脱15分钟，离心分离。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述洗脱液和步骤（2）中富集后的上清液分别点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，分别各再取1μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL, 含1% H3PO4的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图6可以看出，在富集前，质量比1:1000:1000将β-casein酶解液与α-casein蛋白和BSA蛋白混合溶液中难以鉴定到磷酸化肽段（图6a）；然而混合溶液经过基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了三条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 3122.27, m/z= 2556.09和m/z= 2061.83）和四条去磷酸化峰（m/z= 3041，3024，2458，1963）以及一条源于α-casein蛋白的磷酸化肽峰(m/z=1466.51)（图6c）。在质谱线性模式下，富集后的上清液中鉴定到α-casein蛋白和BSA蛋白（图6b），而在富集后的洗脱液中未能鉴定到任何蛋白的信号峰（图6d）。
实施例5：将实施例1得到的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料应用于超低浓度的β-casein酶解液的富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）试样的富集: 50 μL基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的分散液（浓度为10 mg/mL），加到50 μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中；用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释标准蛋白酶解液，使得蛋白酶解液的终浓度为0.1fmol/μL; 37℃下孵育混旋30分钟；通过离心分离，用200 μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10 μL 0.4M氨水洗脱15分钟，离心分离。
（2）点靶：取1 μL步骤（1）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1 μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL, 含1% H3PO4的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图7可以看出，在富集前，由于β-casein蛋白酶解液浓度极低导致难以鉴定到磷酸化肽段（图7a）；然而经过基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料富集后，质谱中清楚地呈现了二条源于β-casein蛋白的磷酸化肽峰（m/z= 2556.09和m/z= 2061.83）（图7b）。
实施例6：将实施例1得到的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料应用于正常男性/女性（同岁）血清溶液中磷酸化肽的富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）试样的准备：分别取2μL正常男性/女性（同岁）的血清加到150μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中。
（2）试样的富集：向含有正常男性/女性（同岁）的血清的50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中加入50μL基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的分散液，37℃下孵育混旋30分钟；通过离心分离出材料，用200μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10μL 0.4M氨水洗脱15分钟，离心分离。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL, 含1% H3PO4的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
（4）质谱分析以基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料作为吸附剂从正常男性/女性（同岁）血清溶液中富集到的磷酸化肽，同时与富集之前正常男性/女性（同岁）血清溶液中肽段的质谱图进行对比。
如图8可以看出，正常男性/女性（同岁）血清溶液富集前，磷酸化肽在质谱中的信号受到非磷酸化肽的严重干扰而无法检测到（图8a、c）；经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料富集后（图8b、d），质谱分析结果显示只有四条正常人的磷酸化肽特征峰（m/z= 1389,1460,1545,1616）。
实施例7：将实施例1得到的基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料应用于脱脂牛奶酶解溶液中磷酸化肽的富集与MALDI-TOF-MS检测。
（1）试样的准备：30 μL脱脂牛奶用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释到900 μL，在16000rmp转速下离心15分钟。收集上清液，煮沸10分钟，按照与蛋白质量比1：40向上清液中加入适量的胰蛋白酶，37℃下酶解16小时。
（2）试样的富集：取2 μL脱脂牛奶的酶解液和 50 μL基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的分散液（浓度为10 mg/mL），加到150 μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中，37 ℃下孵育混旋30分钟；通过离心分离，用200 μL 50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10 μL 0.4M氨水洗脱15分钟，离心分离。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1μL的 2,5-二羟基苯甲酸溶液(20 mg/mL, 含1% H3PO4的50% ACN溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
（4）质谱分析以基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料作为吸附材料从脱脂牛奶酶解溶液中富集到的磷酸化肽，同时与富集之前脱脂牛奶酶解液中肽段的质谱图进行对比。
如图9可以看出，脱脂牛奶酶解溶液富集前，磷酸化肽在质谱中的信号受到非磷酸化肽的严重干扰（图9a）；经基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料富集后（图9b），质谱分析结果显示有大量的磷酸化肽特征峰被检测到。

Claims (5)

1.一种基于花粉为模板的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）花粉样品的处理：将氯仿和甲醇溶液按照1:（3-4）体积比均匀混合；将研磨后的花粉颗粒PGs浸泡在上述混合溶液中，过夜；过滤除去混合溶液后，将花粉颗粒在80-100℃的甲醇溶液中加热回流24-30小时；冷却后离心分离，并用去离子水充分洗涤，40-60℃下真空干燥，得到处理后的PGs；
（2）将步骤（1）所得处理后的PGs分散在异丙醇溶液中，超声0.5-1.0小时；
（3）将异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺加入到步骤（2）所得混合溶液中，充分搅拌0.5-1.0小时；
（4）将步骤（3）所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220℃下加热22-24小时；
（5）将步骤（4）中高压反应釜冷却至室温，所得产物经过离心分离，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料，40-60℃下真空干燥；
（6）将步骤（5）所得产物在600-800℃下高温煅烧2-3小时，即得到钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料，记为PGs@(Ti-Zr)O4。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中PGs的用量为70-75mg，异丙醇溶液体积为85-90mL。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（3）中异丙醇钛、异丙醇锆和二乙胺的比例为（1.5-2.0mL）：（1.0-1.5g）：（0.04-0.05mL）。
4.由权利要求1-3之一所述合成方法得到的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料。
5.如权利要求4所述的钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料在磷酸化肽分离、富集与质谱鉴定中的应用，其特征在于：将钛-锆双金属原子水平掺杂的蜂窝状介孔复合材料与目标磷酸化肽溶液充分混合，加入40-60%乙腈/0.05-0.15%三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在37-38℃酶解仪中孵育；通过离心分离出复合材料，用40-60%乙腈/0.05-0.15%三氟乙酸缓冲液洗涤复合材料3-4次，用0.3-0.5M氨水洗脱；取0.8-1.5μL洗脱液点在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8-1.5μL浓度为15-25 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。
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