CN105561914A - 一种用于核酸纯化的纳米磁珠 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于核酸纯化的纳米磁珠，其制备方法包括纳米微球的制备和表面修饰的过程。本发明通过水相反应得到一定大小的生物磁性微球，在其表面引入能吸附核酸的基团，利用二氧化硅带电性吸核酸的性质，能高效纯化多种复杂样品，从而实现核酸纯化的自动化，大大减少工作人员的工作量。并且本发明纳米磁珠具有分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强的特点，能有效用于诊断试剂前期纯化以及临床核酸检测，在测序领域、生物磁性微球靶向治疗、生物医药开发领域有着广泛的应用前景和社会经济效益。

Description

一种用于核酸纯化的纳米磁珠
技术领域
本发明涉及材料科学领域，特别涉及一种用于核酸纯化的纳米磁珠。
背景技术
近年来，纳米磁珠(简称磁珠)越来越受到人们的青睐，现已广泛用于细胞分离、酶的固定、核酸纯化等多个领域。磁珠是指通过物理学、化学或生物学等方法将磁性无机粒子与有机高分子特异性结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合高分子微球。磁珠法是先通过裂解细胞，将游离出来的核酸分子特异性吸附到磁性颗粒表面，同时使蛋白质等杂质留在溶液中。而后在磁场作用下，磁性颗粒与液体分开，弃除液体后再经洗脱即可得到纯净的核酸。相较于其他传统提取核酸的方法，使用磁珠提取核酸具有无法比拟的独特优势。主要表现在磁珠提取核酸的高效性、高特异性、高稳定性。此外，磁珠简便通用，可直接从血液、组织等多种样本中快速提取核酸，且成本低廉，便于广泛应用。使用磁珠法提取核酸，步骤简单，无需离心，且能有效去除大多数干扰PCR等后续反应的抑制因子，如蛋白质、多糖类物质，降低假阴性率，提高核酸提取的纯度与精度，保证检测结果的真实可靠。
目前用于核酸提取的磁珠多种多样，较常采用的有金属合金如铁、镍等、氧化铁、铁氧体等。它们通过在磁珠表面包裹不同的活性功能基团，使其具有吸附核酸的功能。用于核酸提取的磁珠主要分为羧基磁性微球、氨基磁性微球、二氧化硅磁性微球等。二氧化硅磁性微球吸附核酸的原理与传统固相硅类介质相同，可以在特定的pH及盐离子浓度下有效吸附核酸，所得到的核酸完整性好，纯度高。
以上充分说明了磁珠在提取核酸方法中将占有越来越重要的地位。但是在现有技术中，核酸纯化试剂市场操作复杂，工艺落后，市场上销售的磁珠存在不稳定，表面基团修饰不完全，需要有机溶剂分散，颗粒不规则，吸附率量小，自动化程度低的缺点。因此如何保证磁珠可以充分发挥性能，有效完全的吸附核酸成为亟待解决的重要问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的磁珠存在不稳定，表面基团修饰不完全，需要有机溶剂分散，颗粒不规则，吸附率量小，自动化程度低的缺点，提供了一种分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强的用于核酸纯化的纳米磁珠。
为了解决上述技术问题，本发明的一个方面所提供的技术方案为：
一种用于核酸纯化的纳米磁珠，所述纳米磁珠由以下步骤制备而成：
步骤A)纳米微球的制备：
在氩气保护下，在含有13～17g硫酸亚铁七水合物和8～12g三氯化铁六水合物的水溶液中，每间隔10分钟滴加1ml0.4M～0.6M氢氧化钠溶液；当反应溶液变为胶状乳浊液时，每间隔20分钟滴加1ml0.2M～0.3M氢氧化钠溶液，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，待出现磁性后，继续在氩气保护下反应4～10小时；随后在所得溶液中加入氯化钠，使氯化钠终浓度为0.5M～1M；室温静置18～36小时后使用去离子水漂洗至溶液pH为7；再使用0.2M～0.3M的氢氧化钠溶液配成磁珠体积百分比为20％～40％的磁珠悬液，即得；
步骤B)通过表面修饰制备纳米磁珠：
将步骤A)所得磁珠悬液在50℃～60℃条件下通入氩气并均匀搅拌；加入60g九水硅酸钠搅拌至完全溶解，每3min滴加0.5ml冰乙酸，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，搅拌2h；当pH值为6～8时，使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M氯化钠溶液漂洗5次，再使用0.3M氯化钠溶液配制成磁珠体积百分比为20％～40％的磁珠悬液；在得到的磁珠悬液中加入30gPEG-1750，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，搅拌24h；使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M的氯化钠溶液漂洗5次；再使用0.3M氯化钠溶液和叠氮钠配制成磁珠体积百分比为40％-60％的磁珠悬液，即得所述纳米磁珠。
本发明提供的一种用于核酸纯化的纳米磁珠是在水相反应中修饰制备而成，其不仅适应性广，能用于多种核酸纯化样本的纯化，而且分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强。
本发明用于核酸纯化的纳米磁珠是根据以下式I制得：
在本发明的步骤A)中，当含有13～17g硫酸亚铁七水合物和8～12g三氯化铁六水合物的水溶液中溶液变为胶状乳浊液时，应改变滴定的间隔时间，并且每间隔20min滴加1ml的0.2M～0.3M氢氧化钠溶液，直至颗粒出现，从而通过不同的滴定量可以得到不同大小的纳米微球。
作为优选，步骤A)所述含有硫酸亚铁七水合物和三氯化铁六水合物的水溶液的溶剂为脱氧去离子水，这样能够有效防止二价铁离子被氧化。
作为优选，，步骤A)所述含有硫酸亚铁七水合物和三氯化铁六水合物的水溶液中硫酸亚铁七水合物的质量为15g，三氯化铁六水合物的质量为10g。
作为优选，步骤A)所述使用0.2M～0.3M氢氧化钠溶液配成的磁珠悬液中磁珠体积百分比为30％。
在本发明中，发明人通过直接使用去离子水溶解硫酸亚铁七水合物及三氯化铁六水合物，在不改变离子环境的前提下，为后续操作提供液体的反应环境，并且通过控制碱性溶液的滴定量可以得到不同大小的纳米微球。同时，氯化钠的使用可以增加液体中的离子浓度，使磁珠获得良好的悬浮性及分散性。同时防止细菌的滋生及有效去除磁珠悬液中的蛋白。
在本发明的步骤B)中，发明人同样在水相条件下对步骤A)得到的纳米微球进行表面修饰。首先，在50℃～60℃条件下进行反应，可加快反应速度，缩短磁珠表面修饰时间。
作为优选，步骤B)所述通入氩气并均匀搅拌是在55℃条件下进行的。
作为优选，步骤B)中所述滴加酸性溶液过程中可以通过控制所述酸性溶液的加入量，得到不同修饰程度的表面修饰颗粒。
作为优选，步骤B)中使用0.3MNaCl及叠氮钠配制成50％磁珠悬液，这样可以增加液体中的离子浓度，使磁珠获得良好的悬浮性及分散性。同时防止细菌的滋生及有效去除磁珠悬液中的蛋白。
本发明的另一个方面是提供了一种核酸纯化试剂盒，该试剂盒包含上述过程制备的纳米磁珠。
本发明的有益效果为：
本发明通过水相反应得到一定大小的生物磁性微球，在其表面引入能吸附核酸的基团，利用二氧化硅带电性吸核酸的性质，能高效纯化多种复杂样品，从而实现核酸纯化的自动化，大大减少工作人员的工作量。并且本发明纳米磁珠具有分散性好，成本低，颗粒均一性好，磁珠大小可控性强的特点，能有效用于诊断试剂前期纯化以及临床核酸检测，在测序领域、生物磁性微球靶向治疗、生物医药开发领域有着广泛的应用前景和社会经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的纳米磁珠的电镜图；
图2为利用实施例1制备的纳米磁珠进行核酸纯化后进行HBVDNA的实时荧光定量PCR检测结果图；
图3为分别利用本发明和市售纳米磁珠进行核酸纯化后进行HBVDNA的实时荧光定量PCR检测结果对比图。
具体实施方式
本发明公开了一种用于核酸纯化的纳米磁珠，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
本发明中使用的术语“磁珠”，是指磁性微球(简称磁珠)，现已广泛用于细胞分离、酶的固定、核酸纯化等多个领域。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实验材料与仪器
以下实施例中所使用的化学试剂均为市售分析纯试剂。
以下实施例中所用的PCR扩增仪器为上海宏石医疗科技有限公司生产的实时荧光定量PCR仪。
实施例1：用于核酸纯化的纳米磁珠的制备
步骤A)纳米微球的制备：
在氩气的保护下，在含有15g硫酸亚铁七水合物和10g三氯化铁六水合物的水溶液中每间隔10分钟滴加1ml0.5M的氢氧化钠溶液。当反应溶液变为胶状乳浊液时，每间隔20分钟滴加1ml的0.25M的氢氧化钠，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，待出现磁性后，继续氩气保护下反应4～10小时。随后按照磁珠体积，加入氯化钠，使其终浓度为1M。室温静置18～36小时后使用去离子水漂洗，至溶液pH接近7。使用0.25M的氢氧化钠配成30％的磁珠悬液；
步骤B)纳米磁珠的表面修饰：
将步骤A)在55℃条件下通入氩气并均匀搅拌。加入60克九水硅酸钠搅拌至完全溶解，每3min滴加0.5ml的纯冰乙酸，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，持续搅拌2h。待pH值6～8时，使用3倍磁珠悬液体积的0.3M的NaCl漂洗5次，使用0.3MNaCl配制成30％磁珠悬液。加入30gPEG-1750，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，持续搅拌24h。使用3倍磁珠悬液体积的0.3M的NaCl漂洗5次。使用0.3MNaCl和叠氮钠配制成50％磁珠悬液。
用电镜观测制备的纳米磁珠的形态。结果如图1所示。从图中可以看出，磁珠呈规则球形，平均大小约为400nm，具有良好的分散性。磁珠表面修饰后，形成了厚度约为20nm的表面修饰包覆层，合成的磁性纳米微球具有良好的亲水性，是磁珠很容易的分散在水溶液中。
实施例2：HBVDNA的实时荧光定量PCR检测
利用与实施例1相同的方法进行磁珠的制备。
按照以下组分比例配制混合有磁珠的裂解液和洗涤液：
0.3N氢氧化钠、0.45M氯化钾、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠、5mMEDTA、0.45MTris-HCL、1％曲通X-100、3mMDTT和0.001wt％的溴酚蓝。
按照磁珠和裂解液的体积比为1：100加入自然沉淀24小时的磁珠，混匀。
洗涤液：0.3M氯化钾、0.001wt％的石绿、用乙酸将pH值调至4。
使用以上裂解液和洗涤液对临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为5IU/ml、10IU/ml、20IU/ml、2×102IU/ml、2×103IU/ml、2×104IU/ml、2×105IU/ml、2×106IU/ml、2×107IU/ml、2×108IU/ml、2×109IU/ml的乙肝患者血清进行如下步骤的操作：
(1)PCR裂解液的分装：将配制好的混有磁珠的裂解液按照每管100μl分装到专用PCR管中。
(2)加样：取100μl的血清加入到上述分装有混合有磁珠的裂解液的PCR管中，用吸头轻轻吹打混匀5次，室温静置5分钟。
(3)吸弃液体：将上述PCR管放置到八联排磁力架上，静置2分钟，用移液器在磁珠对侧将液体吸掉，注意勿吸掉磁珠。
(4)洗涤：从八联排磁力架上取下PCR管，并将已配制好的洗涤液每管加入200μl，重新放置到八联排磁力架上，无需等候时间直接用移液器或负压泵吸弃洗涤液，注意吸净残液。
(5)将2.0μl(1U/μl)单位的TaqDNA聚合酶与38.0μlPCR反应液(所述反应液为包括浓度40nmol/μl上下游引物和30nmol/μl探针；20nmol/μl的Tris碱；20mmol/μl氯化镁；50mmol/μl氯化钾、200umol/μl的dNTP和0.001wt％的石绿指示剂的荧光PCR扩增试剂混合液)混匀，加入到步骤(4)得到的PCR扩增管中，封盖，轻轻将磁珠弹下来，保证磁珠与PCR反应液彻底混匀。
其中正向引物序列为HBVF5’-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，反向引物序列为HBVR5’-GCACAGCTTGGAGGCTTGT-3’，探针序列为HBVP5’-TCACCTCTGCCTAATC-3’。
(6)离心：水平离心机3000RPM离心45秒。
(7)将上述得到的PCR管放置于PCR仪内进行扩增。
扩增程序：37℃，2min；95℃，5分钟；进行45-50循环的95℃，10秒钟和61℃，45秒钟，在61℃检测荧光信号。
实验结果如图所示，其中，从右至左的曲线依此代表浓度为5IU/ml、10IU/ml、20IU/ml、2×102IU/ml、2×103IU/ml、2×104IU/ml、2×105IU/ml、2×106IU/ml、2×107IU/ml、2×108IU/ml、2×109IU/ml的样品。结果表明，本发明可检测出浓度范围在5IU/ml～2×109IU/ml的HBVDNA样品，同时表明本发明方法的灵敏度可低至5IU/ml。
对比例1
分别使用实施例1中制备的纳米磁珠和传统方法制作的纳米磁珠，按照实施例2中的方法进行裂解液、洗液的配制，对临床诊断明确且经过检测HBVDNA定量值为10IU/ml、2×107IU/ml的乙肝患者血清进行病毒核酸的提取及扩增。
实验结果如图3所示，使用本发明纳米磁珠提取相同量的病毒核酸，其Ct值及效率均要高于市售的产品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于核酸纯化的纳米磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠由以下步骤制备而成：
步骤A)纳米微球的制备：
在氩气保护下，在含有13～17g硫酸亚铁七水合物和8～12g三氯化铁六水合物的水溶液中，每间隔10分钟滴加1ml0.4M～0.6M氢氧化钠溶液；当反应溶液变为胶状乳浊液时，每间隔20分钟滴加1ml0.2M～0.3M氢氧化钠溶液，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，待出现磁性后，继续在氩气保护下反应4～10小时；随后在所得溶液中加入氯化钠，使氯化钠终浓度为0.5M～1M；室温静置18～36小时后使用去离子水漂洗至溶液pH为7；再使用0.2M～0.3M的氢氧化钠溶液配成磁珠体积百分比为20％～40％的磁珠悬液，即得；
步骤B)通过表面修饰制备纳米磁珠：
将步骤A)所得磁珠悬液在50℃～60℃条件下通入氩气并均匀搅拌；加入60g九水硅酸钠搅拌至完全溶解，每3min滴加0.5ml冰乙酸，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，搅拌2h；当pH值为6～8时，使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M氯化钠溶液漂洗5次，再使用0.3M氯化钠溶液配制成磁珠体积百分比为20％～40％的磁珠悬液；在得到的磁珠悬液中加入30gPEG-1750，摇床持续摇匀，摇床速度100转/分钟，搅拌24h；使用3倍于所述磁珠悬液体积的0.3M的氯化钠溶液漂洗5次；再使用0.3M氯化钠溶液和叠氮钠配制成磁珠体积百分比为40％～60％的磁珠悬液，即得所述纳米磁珠。
2.根据权利要求1所述的用于核酸纯化的纳米磁珠，其特征在于，步骤A)所述含有硫酸亚铁七水合物和三氯化铁六水合物的水溶液的溶剂为脱氧去离子水。
3.根据权利要求1所述的用于核酸纯化的纳米磁珠，其特征在于，步骤A)所述含有硫酸亚铁七水合物和三氯化铁六水合物的水溶液中硫酸亚铁七水合物的质量为15g，三氯化铁六水合物的质量为10g。
4.根据权利要求1所述的用于核酸纯化的纳米磁珠，其特征在于，步骤A)所述使用0.2M～0.3M氢氧化钠溶液配成的磁珠悬液中磁珠体积百分比为30％。
5.根据权利要求1所述的用于核酸纯化的纳米磁珠，其特征在于，步骤B)所述通入氩气并均匀搅拌是在55℃条件下进行的。
6.根据权利要求1所述的用于核酸纯化的纳米磁珠，其特征在于，步骤B)中再使用0.3MNaCl和叠氮钠配制成磁珠体积百分比为50％的磁珠悬液。
7.一种核酸纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～10中任意一项所述的纳米磁珠。
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