CN105561330B - 一种人降钙素-葫芦脲复合制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人降钙素‑葫芦脲复合制剂，该复合制剂包括人降钙素‑葫芦脲超分子复合物、人降钙素和葫芦脲，其制备方法为：将人降钙素和葫芦脲在0～40℃的条件下溶解于pH值为7～8的水性溶剂中并混合均匀，即得到人降钙素‑葫芦脲复合制剂；或者将人降钙素和葫芦脲在0～40℃的条件下溶解于pH值为7～8的水性溶剂中并混合均匀，然后冷冻干燥，即得到人降钙素‑葫芦脲复合制剂。本发明所述复合制剂在使用过程不易发生纤维化，并且该复合制剂的生物活性较单独的人降钙素的生物活性更高，本发明有助于推进人降钙素的临床应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种人降钙素-葫芦脲复合制剂及其制备方法。
背景技术
降钙素(calcitonin，CT)为含有32个氨基酸的直线型多肽类激素，它是由脊椎动物的后鳃体和哺乳动物的甲状腺的滤泡旁细胞(parafollicular cells，又称C细胞)分泌的激素，在骨和肾都有其相应的受体，具有调节钙、磷代谢的作用，目前主要用于和低骨量相关的疾病的治疗。降钙素的分泌与流经甲状腺的血液中的钙浓度有关，因此血钙浓度的增加可引起降钙素分泌增加和抑制骨吸收，降低高血钙病人的血钙浓度。
不同来源的降钙素的氨基酸序列不同，对人都显示出生物活性，其中鲑鱼降钙素(sCT)、鳗鱼降钙素(eCT)和鸡降钙素(cCT)的活性最高，而人降钙素(hCT)由于会快速纤维化而活性最低。由于非人属来源的降钙素的氨基酸序列与人降钙素的氨基酸序列差异较大，例如，sCT与hCT的同源性仅为50％，对人体而言，非人属来源的降钙素是一种免疫反应原，人体对其产生的免疫反应会影响其临床应用价值。虽然目前临床治疗骨质疏松、高血钙症时多使用sCT，但由于其与hCT的同源性差，应用时产生的免疫反应和抗体会影响治疗效果。
虽然将hCT用于治疗骨质疏松、高血钙症，人体不会对其产生免疫反应，但hCT比sCT更容易纤维化，在水性溶剂中，hCT分子很容易相互聚集并发生纤维化，形成长纤维沉淀物，降钙素的长纤维沉淀物容易引发甲状腺肿瘤(Hazard JB,Hawk WA,Crile G.J ClinEndocr Metab.1959；19:152-61.)；降钙素分子的相互聚集还会造成其生物活性降低。上述问题导致hCT的临床应用面临着很大的困境，hCT目前尚未实现临床应用。因此，若能开发出可有效抑制hCT纤维化的方法，制备出不容易纤维化且具有较高生物活性的hCT产品，对于推进hCT的临床应用将产生重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人降钙素-葫芦脲复合制剂及其制备方法，以抑制人降钙素在使用过程中发生纤维化，同时提高人降钙素的生物活性，推进人降钙素的临床应用。
本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂，包括人降钙素-葫芦脲超分子复合物、人降钙素和葫芦脲，所述葫芦脲为葫芦脲7或者葫芦脲8。
本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的制备方法，操作如下：
按照人降钙素与葫芦脲的摩尔比为1:(10～50)计量人降钙素和葫芦脲，将人降钙素和葫芦脲在0～40℃的条件下溶解于pH值为7～8的水性溶剂中并混合均匀，即得到人降钙素-葫芦脲复合制剂；
或者按照人降钙素与葫芦脲的摩尔比为1:(10～50)计量人降钙素和葫芦脲，将人降钙素和葫芦脲在0～40℃的条件下溶解于pH值为7～8的水性溶剂中并混合均匀，然后冷冻干燥，即得到人降钙素-葫芦脲复合制剂；
所述水性溶剂的用量应使人降钙素的浓度为100～200μmol/L、葫芦脲的浓度为1～10mmol/L，所述葫芦脲为葫芦脲7或者葫芦脲8。
上述方法中，优选的技术方案为按照人降钙素与葫芦脲的摩尔比为1:(10～25)计量人降钙素和葫芦脲。
上述方法中，所述水性溶剂为去离子水、生理盐水或者磷酸盐缓冲液。
按照上述第一种方法制备的人降钙素-葫芦脲复合制剂在调节好浓度后可以注射给药的方式使用，按照上述第二种方法制备的人降钙素-葫芦脲复合制剂在使用水性溶剂溶解并调节好浓度后可以注射给药的方式使用。
本发明提供的人降钙素-葫芦脲复合制剂能抑制人降钙素纤维化并提高其生物活性的主要原因如下：葫芦脲7或葫芦脲8为环状大分子，其环状内腔为疏水性的，且葫芦脲7及葫芦脲8的环状腔体的尺寸与人降钙素多肽链上含苯环的氨基酸的尺寸匹配，在水性溶剂中，葫芦脲7或葫芦脲8的疏水内腔会包合人降钙素多肽链上含苯环的氨基酸并通过疏水相互作用使人降钙素的构象发生变化，构象变化后，人降钙素分子之间的相互聚集减少，从而有效抑制人降钙素因相互聚集而发生纤维化。同时，人降钙素分子之间相互聚集的减少能使水性溶剂中人降钙素单体的数量增加并保持稳定构象，而人降钙素单体的生物活性高于人降钙素聚集体的生物活性，因此本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂能提高人降钙素的生物活性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的人降钙素-葫芦脲复合制剂是一种新型的人降钙素制剂，在水性溶剂中，葫芦脲环状疏水内腔会包合人降钙素多肽链上含苯环的氨基酸并通过疏水作用使人降钙素的构象发生变化，进而使人降钙素分子之间相互聚集的机会减少、抑制人降钙素因分子间相互聚集而发生纤维化，实验表明，人降钙素与葫芦脲相互作用后，人降钙素的聚集形态发生了变化，不再形成成熟的纤维，因此，本发明所述复合制剂能降低人降钙素的长纤维沉淀物引发甲状腺肿瘤的可能性，比单独的人降钙素的用药安全性更高。
2.本发明提供的人降钙素-葫芦脲复合制剂中，由于葫芦脲与人降钙素的相互作用，使得人降钙素分子间的相互聚集的机会减少，从而增加了复合制剂中稳定构象的人降钙素单体的数量，人降钙素单体数量的增加可提高其生物活性，因此本发明所述复合制剂比单独的人降钙素具有更高的生物活性。细胞实验表明，与单独的人降钙素相比，本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的生物活性更高，且没有明显的细胞毒性。动物实验表明，本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的降血钙能力较单独的人降钙素明显更高，在相同浓度的条件下与鲑鱼降钙素的降血钙能力接近，且本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂不会因同源性的原因在临床应用时产生的免疫反应而影响治疗效果。由以上内容可知，本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂是具有临床应用前景的，本发明有助于推进人降钙素的临床应用。
3.本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的制备方法简单，工艺条件温和易于推广应用。
附图说明
图1是实施例1和对比例1中各样品与ThT染料作用后的荧光强度随搅拌时间的变化曲线。
图2是实施例1和对比例1中搅拌20h得到的各样品的透射电子显微镜照片，图中的标尺为100nm。
图3是实施例6采用等温滴定量热法测试人降钙素与葫芦脲7相互作用的结果图。
图4是实施例7中的细胞毒性测试结果图。
图5是实施例8中大鼠的血钙含量随时间的变化曲线。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂及其制备方法进行具体描述，有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据本发明的内容作出一些非本质的改进和调整进行具体实施，但这样的具体实施应仍属于本发明的保护范围。
下述各实施例中，磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的配制方法为：分别配制0.2mol/L的Na2HPO4和0.2mol/L的NaH2PO4母液，取19mL的NaH2PO4和81mL的Na2HPO4母液加入容器中，然后加入NaCl，加蒸馏水或去离子水至700～900mL并搅拌使氯化钠完全溶解，调节pH值至7.0～7.4后用蒸馏水或去离子水定容至1L即得PBS缓冲液，其中，NaCl的浓度为100mmol/L。
以下通过实施例1和对比例1说明单独的人降钙素和本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂中人降钙素的纤维化情况。
实施例1
将人降钙素(hCT)2.0mg、葫芦脲7(CB[7])6.9mg加入已装有搅拌子的1#管制瓶中，将hCT 2.0mg、CB[7]17.4mg加入已装有搅拌子的2#管制瓶中，将hCT 2.0mg、CB[7]34.8mg加入已装有搅拌子的3#管制瓶中，1～3#管制瓶中，hCT与CB[7]的摩尔比分别为1:10、1:25、1:50。
向1～3#管制瓶中分别加入pH值为7.4的PBS缓冲液3mL，置于冰浴中超声至hCT和CB[7]完全溶解和混匀，即得到hCT-CB[7]复合制剂，然后将所述1～3#管制瓶置于40℃的水浴中，使用恒温磁力搅拌器以200r/min的转速进行搅拌，从开始搅拌的第0～4h每间隔0.5h进行取样，从开始搅拌的第4～20h每间隔1h进行取样，搅拌20h后停止搅拌。
各样品取出后，立即加入硫代黄素T(ThT染料)与样品作用15min，然后测试荧光强度，结果如图1所示。搅拌20h后，1～3#管制瓶中所得样品的透射电子显微镜照片如图2(B)～(D)所示。
对比例1
将hCT2.0mg加入已装有搅拌子的管制瓶中，加入pH值为7.4的PBS缓冲液3mL，然后置于冰浴中超声至hCT完全溶解得到hCT溶液，然后所述管制瓶置于40℃的水浴中，使用恒温磁力搅拌器以200r/min的转速进行搅拌，从开始搅拌的第0～4h每间隔0.5h进行取样，从开始搅拌的第4～20h每间隔1h进行取样，搅拌20h后停止搅拌。
各样品取出后，立即加入ThT染料与样品作用15min，然后测试荧光强度，结果如图1所示。搅拌20h所得样品的透射电子显微镜照片如图2(A)所示。
由于ThT染料能特异性地与纤维化后的hCT结合并使其荧光急剧增强，因此由图1中各样品的荧光强度可判断各样品中hCT的纤维化情况。由图1可知，对比例1中，hCT在PBS缓冲液中会发生纤维化，而实施例1中，hCT-CB[7]复合制剂中hCT的纤维化程度明显降低或者不再发生纤维化。
由图2(A)可知，hCT在PBS溶液中搅拌20h，生成了大量成熟的纤维，并且hCT纤维会聚集在一起形成更粗的纤维，图2(A)中箭头标示出的单条纤维的直径约为8nm。由图2(B)～(D)可知，实施例1制备的hCT-CB[7]复合制剂的形态与图2(A)明显不同，说明实施例1制备的hCT-CB[7]复合制剂中，在hCT与CB[7]发生相互作用后，hCT的聚集形态发生了改变，不再相互聚集形成成熟的纤维。图2(B)中，按照hCT与CB[7]的摩尔比＝1:10的添加量制备的hCT-CB[7]复合制剂中，hCT与CB[7]相互作用后，不再有成熟的纤维生成，仅生成了少量纤维样的前聚体，并且形成了粒径为10～100nm的纳米微球；图2(C)(D)中，按照hCT与CB[7]的摩尔比＝1:25以及1:50的添加量制备的hCT-CB[7]复合制剂中，hCT与CB[7]相互作用后，不再有成熟的纤维和纤维样的前聚体生产，形成了大量粒径为10～100nm的纳米微球。
由图1和图2可知，hCT与CB[7]相互作用后，hCT的聚集形态发生了变化，本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂中的人降钙素不容易发生纤维化。
实施例2
按照hCT与CB[7]的摩尔比＝1:10计量hCT和CB[7]，将hCT与CB[7]加入已装有搅拌子的管制瓶中，在室温向管制瓶中加入去离子水，震荡管制瓶使hCT和CB[7]完全溶解，去离子水的用量应使hCT的浓度为100μmol/L、CB[7]的浓度为1mmol/L，然后在25℃使用磁力搅拌器以500r/min的转速搅拌20min，冷冻干燥，即得hCT-CB[7]复合制剂。
实施例3
按照hCT与CB[7]的摩尔比＝1:30计量hCT和CB[7]，将hCT与CB[7]加入已装有搅拌子的管制瓶中，在室温向管制瓶中加入pH值为7.4的PBS缓冲液，震荡管制瓶使hCT和CB[7]完全溶解，PBS缓冲液的用量应使hCT的浓度为100μmol/L、CB[7]的浓度为3mmol/L，然后将所述管制瓶置于40℃的水浴中使用恒温磁力搅拌器以100r/min的转速搅拌所述管制瓶30min，冷冻干燥，即得hCT-CB[7]复合制剂。
实施例4
按照hCT与CB[7]的摩尔比＝1:50计量hCT和CB[7]，将hCT与CB[7]加入已装有搅拌子的管制瓶中，在室温向管制瓶中加入pH值为7.4的PBS缓冲液，震荡管制瓶使hCT和CB[7]完全溶解，PBS缓冲液的用量应使hCT的浓度为200μmol/L、CB[7]的浓度为10mmol/L，然后在25℃使用恒温磁力搅拌器以100r/min的转速搅拌所述管制瓶40min，即得hCT-CB[7]复合制剂。
实施例5
按照hCT与葫芦脲8(CB[8])的摩尔比＝1:25计量hCT和CB[8]，将hCT与CB[8]加入已装有搅拌子的管制瓶中，在室温向管制瓶中加入生理盐水，震荡管制瓶使hCT和CB[8]完全溶解，生理盐水的用量应使hCT的浓度为100μmol/L、CB[8]的浓度为2.5mmol/L，然后将所述管制瓶置于冰浴中，使用恒温磁力搅拌器以50r/min的转速搅拌1h，即得hCT-CB[8]复合制剂。
实施例6
本实施例中，采用等温滴定量热法测试人降钙素与葫芦脲7的相互作用的情况。
(1)将hCT 2.0mg和CB[7]6.9mg分别加入两支试管中，然后向两支试管中分别加入pH值为7.4的PBS缓冲液3mL，晃动试管使hCT和CB[7]完全溶解得到hCT溶液和CB[7]溶液，调节hCT溶液和CB[7]溶液的pH值，使二者的pH值之差不超过0.1，再对二者进行脱气操作。
(2)取hCT溶液加入样品池中，取CB[7]溶液加入注射器中，将CB[7]溶液以每次2μL的量逐滴加入样品池中并以750r/min的转速搅拌样品池中的溶液，控制滴定过程中整个体系的温度恒定在25℃，测定滴定过程中的热量变化，结果如图3所示，由图3可知，CB[7]溶液滴加至hCT溶液中之后发生了放热反应，随着滴加量的增加，放热量逐渐趋于平缓，通过其放热过程的拟合曲线可知人降钙素与葫芦脲7发生了相互作用，而且ΔG＜0，说明hCT与CB[7]能自发地发生相互作用形成hCT-CB[7]超分子复合物，且该复合物中二者的结合常数为6.73×104，二者的结合比约为1。
实施例7
本实施例中，采用MTT法测定hCT以及本发明所述hCT-CB[7]复合制剂的细胞毒性。
(1)①取hCT，在室温用细胞培养基将hCT溶解配制成100mg/L的hCT溶液，再依次稀释至50、25、10、1mg/L并过滤除菌，记作hCT/CB[7]＝1:0；
②按hCT与CB[7]的摩尔比为1:10计量四组hCT和CB[7]样品，在室温用细胞培养基将各组样品溶解并混匀，制成hCT浓度分别为1、10、25、50、100mg/L的hCT-CB[7]复合制剂并过滤除菌，记作hCT/CB[7]＝1:10；
③按hCT与CB[7]的摩尔比为1:25计量四组hCT和CB[7]样品，在室温用细胞培养基将各组样品溶解并混匀，制成hCT浓度分别为1、10、25、50、100mg/L的hCT-CB[7]复合制剂并过滤除菌，记作hCT/CB[7]＝1:25；
④按hCT与CB[7]的摩尔比为1:50计量四组hCT和CB[7]样品，在室温用细胞培养基将各组样品溶解并混匀，制成hCT浓度分别为1、10、25、50、100mg/L的hCT-CB[7]复合制剂并过滤除菌，记作hCT/CB[7]＝1:50。
该步骤中，所述细胞培养基的配方为：体积分数90％的高糖型DMEM、10％的胎牛血清、100μ/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素，将各组分混合均匀后先用450nm微孔过滤膜过滤，然后用220nm微孔过滤膜过滤后使用。
(2)将步骤(1)配制的各个样品分别加入已铺均匀L929细胞的96孔板中，然后置于无菌孵箱中，在5％CO2浓度、95％相对湿度、37℃培养24h后加入噻唑蓝(MTT)，在无菌孵箱中按照前述条件继续培养5h，再向96孔板的各孔中加入二甲基亚砜(DMSO)溶解活细胞产生的结晶紫，然后用酶标仪检测其OD值并计算细胞活性，结果如图4所示。
由图4可知，当hCT浓度为1mg/mL时，hCT/CB[7]＝1:10以及hCT/CB[7]＝1:25与hCT/CB[7]＝1:0的细胞毒性相当，当hCT浓度为10～100mg/mL时，hCT/CB[7]＝1:10以及hCT/CB[7]＝1:25较hCT/CB[7]＝1:0的细胞毒性明显降低，当hCT浓度为25～100mg/mL时，hCT/CB[7]＝1:50较hCT/CB[7]＝1:0的细胞毒性明显降低。由上述内容可知，本发明提供的hCT-CB[7]复合制剂与单独的hCT相比，细胞毒性更小、生物活性更高。
实施例8
本实施例通过动物实验比较hCT，鲑鱼降钙素(sCT)以及本发明所述hCT-CB[7]复合制剂的降血钙能力，步骤如下：
(1)①取sCT，在室温用PBS缓冲液溶解形成sCT溶液；
②取hCT，在室温用PBS缓冲液溶解配制成hCT溶液；
③按hCT与CB[7]的摩尔比为1:10计量hCT和CB[7]，然后在室温用PBS缓冲液将hCT和CB[7]溶解并混匀制成hCT-CB[7]复合制剂；
④按hCT与CB[7]的摩尔比为1:25计量hCT和CB[7]，然后在室温用PBS缓冲液将hCT和CB[7]溶解并混匀制成hCT-CB[7]复合制剂；
步骤①～④中制备的各溶液和复合制剂中，sCT或者hCT的浓度为50μg/mL。
(2)将体重为220～240g的8周健康雄性SD大鼠20只随机分为5组，每组4只，各组均注射给药，注射前将大鼠禁食18h，按大鼠体重，注射量为0.2mL/100g。
第一组为空白对照组，注射PBS缓冲液；
第二组注射步骤(1)①配制的sCT溶液；
第三组注射步骤(1)②配制的hCT溶液；
第四组注射步骤(1)③制备的hCT-CB[7]复合制剂；
第五组注射步骤(1)④制备的hCT-CB[7]复合制剂；
分别在注射前，注射后0.5h、1h、2h、3h和24h对大鼠断尾取血，然后采用钙离子试剂盒测试每个血样的血钙含量，得到各组大鼠的血钙含量随时间的变化曲线，如图5所示。
由图5可知，注射hCT溶液的大鼠在注射后0～24h内的血钙含量与空白对照组基本一致，hCT几乎没有降血钙效果，相对于hCT，hCT-CB[7]复合制剂的降血钙能力明显更好，并且步骤(1)④制备的hCT-CB[7]复合制剂的降血钙能力与鲑鱼降钙素的降血钙能力接近，说明将人降钙素制备成本发明所述人降钙素-葫芦脲复合制剂，能提高人降钙素降血钙能力。
Claims (4)
1.一种人降钙素-葫芦脲复合制剂，其特征在于该复合制剂包括人降钙素-葫芦脲超分子复合物、人降钙素和葫芦脲，所述葫芦脲为葫芦脲7或者葫芦脲8。
2.权利要求1所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的制备方法，其特征在于操作如下：
按照人降钙素与葫芦脲的摩尔比为1:(10～50)计量人降钙素和葫芦脲，将人降钙素和葫芦脲在0～40℃的条件下溶解于pH值为7～8的水性溶剂中并混合均匀，即得到人降钙素-葫芦脲复合制剂；
或者按照人降钙素与葫芦脲的摩尔比为1:(10～50)计量人降钙素和葫芦脲，将人降钙素和葫芦脲在0～40℃的条件下溶解于pH值为7～8的水性溶剂中并混合均匀，然后冷冻干燥，即得到人降钙素-葫芦脲复合制剂；
所述水性溶剂的用量应使人降钙素的浓度为100～200μmol/L、葫芦脲的浓度为1～10mmol/L，所述葫芦脲为葫芦脲7或者葫芦脲8。
3.根据权利要求2所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的制备方法，其特征在于按照人降钙素与葫芦脲的摩尔比为1:(10～25)计量人降钙素和葫芦脲。
4.根据权利要求2或3所述人降钙素-葫芦脲复合制剂的制备方法，其特征在于所述水性溶剂为去离子水、生理盐水或者磷酸盐缓冲液。
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