CN105543210A - 一种制备多孔酶微球的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种制备多孔酶微球的方法，包括以下步骤：(1)将酶溶液、牛血清白蛋白溶液和硫酸锰溶液加入到反应器中得到混合液，然后向混合液中加入碳酸氢铵溶液，制得酶-碳酸锰共沉淀颗粒；(2)向所得的酶-碳酸锰共沉淀颗粒中加入二硫苏糖醇溶液；离心分离后沉淀重新浸没于磷酸盐缓冲液中，室温条件下震荡反应，离心分离，得自组装沉淀颗粒；(3)将步骤(2)中得到的自组装沉淀颗粒加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，室温条件下震荡反应，离心分离，沉淀用磷酸盐缓冲液充分洗涤，此沉淀即为多孔酶微球。本发明采用新型固定化酶技术，提高了酶的活性、稳定性和粒度的可控性，温和条件下，廉价、高效。

Description

一种制备多孔酶微球的方法
技术领域
本发明属于固定化酶领域，特别是一种制备多孔酶微球的方法。
背景技术
面对越来越严重的环境危机和能源危机，环境友好型的催化剂逐渐被大家认同。酶催化因其具有反应条件温和、专一性强、效率高等优势而得到越来越多的关注。但是，游离酶对所处环境十分敏感，在强碱、强酸、高温及部分有机溶剂中不够稳定，容易变性失活。而酶的固定化不仅可提高酶的稳定性，还有利于酶的回收和重复利用及连续自动化生产，这对降低生产成本，提高生产效率具有重要意义。酶的固定化分为载体固定化与无载体固定化两大类。通常来说，载体固定化酶可提高酶的机械强度和稳定性，但由于大量惰性载体的存在，严重降低了单位体积内酶的浓度，还存在传质阻力大、酶的活性不高等问题。另外，固载化材料的制备过程较复杂，成本较高，对于某些特殊载体，不但价格昂贵，而且对生产设备和生产条件要求也很苛刻，不利于大规模工业化生产。因此，无载体酶固定化技术就显得很有吸引力。
无载体酶固定化技术中，交联酶聚集体方法因其操作简单，对实验条件要求低，酶的固载效率和回收率高，且适用于大多数酶的固定化而被广泛应用，但该方法制备的无载体固定化酶也存在一定问题，如交联酶聚集体颗粒大小不均，可控制备性差，不利于交联酶聚集体工业化应用中高催化活性的发挥和后期的分离等；针对这些问题，Brady等(BMCBiotechnol.,2008,8,8～18)提出了球化无载体固定化酶技术，利用乳化法可以制备出0.5-10μm的球形脂肪酶微粒，此球形微粒可进一步团聚形成100μm左右的团聚体，在一定程度上实现了无载体固定化酶的可控制备，颗粒呈现球形，形貌规则，但是该脂肪酶微粒为无孔结构。Lopez-Serrano等(Biotechnol.Lett.,2002,24,1379～1383)在制备脂肪酶交联酶聚集体时，添加十二烷基硫酸钠、辛基酚聚氧乙烯醚和冠醚添加剂，沉淀交联后，添加剂被去除，得到有孔的交联酶聚集体，但孔径很小且不可控。王梦凡等(BioresourceTechnol.,2011,102(3),3541～3545)采用大分子淀粉为致孔剂，制备得到多孔化交联酶聚集体，该多孔化结构有利于降低交联酶聚集体对底物分子的传质限制，提高了无载体固定化酶的催化效率，但该方法制备的固定化酶微粒孔径和粒径可控性差。为避免这些缺陷，一种新的方法应运而生---模板法制备多孔固定化酶微粒。该方法因其固定化酶制备简单、重复率高、形态可控、适用面广而被广泛应用于固定化生物分子(Chem.Mater.,2008,20(3),738～755)。生物分子通过渗透入到模板内部，其后去除模板，而获得精确复制模板形貌的多孔生物分子颗粒，且生物分子颗粒的性质可以通过简单选择不同形式的模板来调控。然而该方法也有一定缺陷，即模板去除过程通常涉及苛刻的条件，如聚合物(TopicsinCurrentChemistry-TemplatesinChemistryⅢ,2009,287,135～180)或二氧化硅模板的去除(Adv.Mater.,2006,18(6),795～800)需经过高温分解或氢氟酸来去除，还有一些模板的去除涉及到有机溶剂，这些条件或试剂会破坏生物分子的结构，造成其不可逆失活，同时也会由于溶胀或坍塌而破坏模板的支架。因此，要想利用模板技术获得功能化的生物分子颗粒，需要找到一种可以在水相温和条件下去除的合适的模板。多孔碳酸钙或碳酸锰颗粒具有生物相容性，不仅价廉易得，还有良好的稳定性，同时也可以在温和条件下溶解。此外，通过对两种颗粒的粒度分布和内部形貌的研究发现，其适合作为生物分子的模板。Volodkin课题组利用层层自组装技术在温和的模板去除条件下制备了聚合物微囊(J.Mater.Chem.,2004,14(14),2073～2081)。该课题组(Adv.Funct.Mater.,2013,23(1),116～123)又在制备介孔碳酸钙模板的基础上，加入蛋白质，蛋白质分子靠水分子的蒸发以及毛细管作用进入到碳酸钙孔道内部，而后经戊二醛交联和模板去除等步骤制备了多孔性蛋白质微粒，该方法制备的多孔蛋白质微粒形貌更规整，适用于大多数蛋白质(或酶)的多孔微粒制备。但该制备过程比较复杂、孔状蛋白质微粒易塌陷，且过程中加入了戊二醛交联剂交联蛋白质分子，戊二醛的存在会导致酶的活性降低，微粒形貌、粒径可控制备性差。
发明内容
本发明的目的是针对当前技术存在的不足，提供一种制备多孔酶微球的工艺方法。该方法以碳酸锰为模板，二硫苏糖醇为还原剂，牛血清白蛋白为保护剂，通过共沉淀法来制备多孔酶微球，得到了形貌、孔径可控的多孔酶微球。该方法采用新型固定化酶技术，提高了酶的活性、稳定性和粒度的可控性，温和条件下，廉价、高效。
本发明的技术方案是：
一种制备多孔酶微球的方法，包括以下步骤：
(1)将酶溶液、牛血清白蛋白溶液和硫酸锰溶液加入到反应器中得到混合液，然后向混合液中加入碳酸氢铵溶液，磁力搅拌10～15秒后，静置10～15min，在高速离心分离后，将沉淀用蒸馏水洗涤，即得酶-碳酸锰共沉淀颗粒；
其中，混合液中，酶浓度为1～4mg/mL,牛血清白蛋白浓度为6～9mg/mL，且酶和牛血清白蛋白浓度之和为10mg/mL，硫酸锰的浓度为0.15～0.25M，摩尔比硫酸锰与碳酸氢铵为1:1～5；
(2)向所得的酶-碳酸锰共沉淀颗粒中加入pH值为7.5的二硫苏糖醇溶液，磁力搅拌10～30min，高速离心分离后，将沉淀用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液充分洗涤；将沉淀重新浸没于pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，室温下磁力搅拌1h，其后高速离心得到自组装沉淀颗粒；
其中，二硫苏糖醇溶液的浓度为0.1～0.5mM，体积比二硫苏糖醇溶液：步骤(1)中混合液＝1:1；
(3)在步骤(2)得到的自组装沉淀颗粒中加入乙二胺四乙酸二钠溶液，室温条件下震荡反应30min～1h，离心分离，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，即得多孔酶微球。
其中，乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度为0.1～0.3M，乙二胺四乙酸二钠与硫酸锰的摩尔比为2～5:1。
所述的酶溶液中，酶为辣根过氧化物酶或脂肪酶，溶剂为pH值为7.0的磷酸盐缓冲液。
所述的步骤(1)、(2)和(3)中的高速离心的速度为5000～10000r/min。
本发明的实质性特点为：
①本发明基于无载体固定化酶的优缺点，提出了模板法制备多孔酶微球。本发明以辣根过氧化物酶和脂肪酶为模型酶，在模板法制备酶-碳酸锰微球时加入牛血清白蛋白保护剂，实现了高性能生物催化剂的制备；基于碳酸锰有致孔作用，提出了无载体固定化酶制备时以碳酸锰为模板，实现了新型高效多孔酶微球形貌、粒径、孔径等的可控制备，进而提高了固定化酶的活性和重复使用性；
②基于二硫苏糖醇能断裂酶分子内的二硫键，当其被去除后，酶分子能自组装成固定化酶微粒的特点，结合模板法和碳酸锰的多孔结构，提出了无交联碳酸锰模板法制备多孔酶微球，实现了新型多孔固定化酶微球的制备。另外，因酶分子内二硫键含量较少或处于酶分子结构内部，如直接用二硫苏糖醇的加入和去除来组装酶微粒，易造成微粒形貌、粒径等不可控且不稳定，牛血清白蛋白的添加除具有保护酶分子结构外，还有助于酶分子自组装成酶微粒。
本发明的有益效果是：
1.本发明制备多孔酶微球的方法，固定化酶微球的形貌、孔径可控(通过改变硫酸锰与碳酸氢铵的化学计量比来调控形貌和孔径的大小)，且有效提高了酶的稳定性，相对于游离酶，其有更宽的pH适用范围，且热力学稳定性更高(如游离的辣根过氧化物酶在60℃的磷酸缓冲液中孕育120min后，其活性仅剩初始酶活的5％，而多孔辣根过氧化物酶微球仍能保留其初始酶活的40％左右；2.碳酸锰是一种良好的模板材料，价廉易得，有良好的稳定性且易于去除；3.本发明的制备工艺简单，重复率高(重复使用7次后，其酶活仍能达到初始酶活的80％以上)、形态可控、适用面广。
附图说明
图1为实施例1中模板碳酸锰的N2吸附-脱附等温线和孔径分布图；(其中，大图是碳酸锰的N2吸附-脱附等温线；中间的小图是碳酸锰的孔径分布图)；
图2为实施例1中多孔酶微球的电镜图片；
图3为实施例1和4中多孔辣根过氧化物酶微球和多孔脂肪酶微球的重复使用性图。
具体实施方式
本发明所用的脂肪酶、牛血清白蛋白和二硫苏糖醇均购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
本发明所用的辣根过氧化物酶购于上海源叶生物科技有限公司。
本发明所用的乙二胺四乙酸二钠购自天津江天化工技术有限公司。
本发明所述的磷酸盐缓冲溶液为Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液，不同pH值的缓冲液按如下方法配制得到：分别配制0.1M的Na2HPO4溶液和NaH2PO4溶液，将两者混合，通过调整两者的体积比，即可得到所需的pH(用pH计标定)。如：25℃下pH值为7.0的磷酸盐缓冲液(0.1M)的配制：取61mL的Na2HPO4溶液(0.1M)和39mL的NaH2PO4溶液(0.1M)混合即可；25℃下pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(0.1M)的配制：取84mL的Na2HPO4溶液(0.1M)和16mL的NaH2PO4溶液(0.1M)混合即可。
所述的乙二胺四乙酸二钠溶液的配制过程是将0.1～0.3mol的乙二胺四乙酸二钠溶解于1L蒸馏水中，溶解时需做加热处理，待其完全溶解后加入氢氧化钠颗粒调节pH值至7.0。
所述的二硫苏糖醇溶液的配制过程是首先将100mg的二硫苏糖醇溶于0.65mL的磷酸盐缓冲液(pH7.5)中配制成1M的二硫苏糖醇溶液，然后用磷酸盐缓冲液(pH7.5)对其稀释，直至所需浓度。
实施例1：
模板碳酸锰的制备：取1mL0.25M的硫酸锰加入到反应器中，其后加入等体积的0.5M的碳酸氢铵溶液，室温条件下水浴锅中磁力搅拌(650rpm)10s，静置10min使其形成稳定的沉淀，10000r/min离心2min，并用蒸馏水洗涤5次即得碳酸锰模板。因为由吸附-脱附等温线的形状可以测定材料的结构特征(如材料的三维结构、内部孔直径、孔的大小分布等)，所以对碳酸锰模板进行了N2吸附-脱附表征，实验结果表明，该碳酸锰模板具有典型的第Ⅴ型吸附-脱附等温线，在高压区吸附曲线呈直线型上升，是典型的H3滞后环，说明介孔是堆积形成的狭缝孔。通过BJH模型计算，该模板的孔径主要为28.12nm(图1)，说明孔径大于10nm的碳酸锰可以作为一种介孔模板。
多孔辣根过氧化物酶微球的制备：①取1mL含有1mg/mL辣根过氧化物酶溶液、9mg/mL牛血清白蛋白和0.25M硫酸锰的混合液加入到反应器中，其后在混合液中加入1mL0.5M的碳酸氢铵溶液，室温条件下水浴锅中磁力搅拌(650rpm)10s，静置10min使其形成稳定的球形碳酸锰，10000r/min离心2min，并用蒸馏水洗涤5次即得辣根过氧化物酶-碳酸锰共沉淀颗粒；②在沉淀颗粒中，加入1mL二硫苏糖醇溶液(pH7.5，0.3mM)，磁力搅拌反应15min，10000r/min离心2min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤3次以去除二硫苏糖醇，得到沉淀颗粒；为使酶分子内或分子间游离的巯基形成新的二硫键，向沉淀颗粒中加入1mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)(使其被浸没即可)，室温下磁力搅拌自组装1h，其后10000r/min离心2min,弃去上清液，得自组装沉淀颗粒；③向②中所得的自组装沉淀颗粒中加入5mL0.25M乙二胺四乙酸二钠溶液，室温条件下震荡反应30min，去除碳酸锰模板，10000r/min离心分离2min，弃去上清液，得沉淀；以上去除碳酸锰模板操作重复3次。去除碳酸锰模板后沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤3次，即可获得多孔辣根过氧化物酶微球，于4℃冰箱中保存使用。将此多孔酶微球冷冻干燥后进行电镜表征，如图2所示，从电镜照片中可以看出多孔辣根过氧化物酶微球具有球形形貌，平均直径为1.6μm。该多孔酶微球的酶活回收率为31.9％，绝对酶活为73U/g，其重复使用性如图3所示，由图知，该多孔微球重复使用7次后，其酶活仍能达到初始酶活的85％，有很好的重复使用性。
多孔辣根过氧化物酶微球活性的测定：采用Worthington法，苯酚和H2O2作为底物，4-氨基安替比林作为显色剂。具体测定过程：取1.4mLA液和1.5mLB液混合均匀后，于25℃下预反应10min，加入一定量酶，漩涡振荡反应3min后，过滤，收集滤液，在510nm下测定OD值。单位酶活的定义：在25℃，pH7.0条件下，每min分解1μmolH2O2所需要的辣根过氧化物酶的量定义为1U。(A液(0.0025M4-氨基安替比林和0.17M苯酚)：称取810mg苯酚和25mg4-氨基安替比林溶于40mL蒸馏水中并定容至50mL；B液(0.0017MH2O2)：量取1g质量分数为30％的H2O2，用蒸馏水稀释至100mL，取1mL稀释液用pH7.0的磷酸盐缓冲液定容至50mL(现配现用)。)
实施例2：
多孔辣根过氧化物酶微球的制备：①取1mL含有3mg/mL辣根过氧化物酶溶液、7mg/mL牛血清白蛋白和0.25M硫酸锰的混合物加入到反应器中，其后在混合物中加入1mL0.75M的碳酸氢铵溶液，室温条件下水浴锅中磁力搅拌(650rpm)15s，静置15min使其形成稳定的球形碳酸锰，10000r/min离心2min，并用蒸馏水洗涤5次即得辣根过氧化物酶-碳酸锰共沉淀颗粒；②在沉淀颗粒中，加入1mL二硫苏糖醇溶液(pH7.5，0.5mM)，磁力搅拌反应30min，10000r/min离心2min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤3次以去除二硫苏糖醇，得到沉淀颗粒；为使酶分子内或分子间游离的巯基形成新的二硫键，向沉淀颗粒中加入1mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)(使其被浸没)，室温下磁力搅拌自组装1h，其后10000r/min离心2min,弃去上清液，得自组装沉淀颗粒；③向②中所得自组装沉淀颗粒加入5mL0.2M乙二胺四乙酸二钠溶液，室温条件下震荡反应1h，去除碳酸锰模板，10000r/min离心分离2min，弃去上清液，得沉淀，以上去除碳酸锰模板操作重复3次。去除碳酸锰模板后沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤3次，即可获得多孔辣根过氧化物酶微球，于4℃冰箱中保存使用。在此制备条件下，该多孔酶微球的酶活回收率为54.6％，绝对酶活为111U/g。
酶活测定方法同实例1。
实施例3：
多孔脂肪酶微球的制备：①取1mL含有2mg/mL脂肪酶溶液、8mg/mL牛血清白蛋白和0.25M硫酸锰的混合液加入到反应器中，其后在反应器中加入1mL1M的碳酸氢铵溶液，室温条件下水浴锅中磁力搅拌(650rpm)10s，静置10min使其形成稳定的球形碳酸锰，10000r/min离心2min，并用蒸馏水洗涤5次即得脂肪酶-碳酸锰共沉淀颗粒；②在此共沉淀颗粒中，加入1mL二硫苏糖醇溶液(pH7.5，0.1mM)，室温下磁力搅拌反应15min，10000r/min离心2min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤3次以去除二硫苏糖醇，得到沉淀颗粒；为使在酶分子内或分子间游离的巯基形成新的二硫键，向沉淀颗粒中加入1mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)(使其被浸没)，室温下磁力搅拌自组装1h，其后10000r/min离心2min,弃去上清液，得自组装沉淀颗粒；③向②中所得自组装沉淀颗粒加入5mL0.1M乙二胺四乙酸二钠溶液，室温条件下震荡反应30min，去除碳酸锰模板，10000r/min离心分离2min，弃去上清液，得沉淀，以上去除碳酸锰模板操作重复3次。去除碳酸锰模板后沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤3次，即可获得多孔脂肪酶微球，于4℃冰箱中保存使用。此多孔酶微球的酶活回收率为31.2％，绝对酶活为42U/g。
多孔脂肪酶微球活性的测定：使用四硝基苯基乙酸酯(4-NPA)作为底物(二甲基亚砜配制)，通过测定对硝基苯酚的释放速率来表征酶活性的大小。具体测定过程：将一定量固定化酶悬浮于2mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，在25℃下恒温5min，加入100μL四硝基苯基乙酸酯(150mM)开始反应。振荡反应3min后，加入1mL磷酸盐缓冲液，过滤，取上清。在405nm下测定反应液的OD值。单位酶活定义：在25℃，pH7.0条件下，每min释放1μmol四硝基苯基所需的脂肪酶量定义为1U。
实施例4：
多孔脂肪酶微球的制备：①取1mL含有4mg/mL脂肪酶溶液、6mg/mL牛血清白蛋白和0.25M硫酸锰的混合液(现配现用)，在混合液中加入1mL0.5M碳酸氢铵溶液，室温条件下水浴锅中磁力搅拌(650rpm)15s，静置15min使其形成稳定的球形碳酸锰，10000r/min离心2min，并用蒸馏水洗涤5次即得脂肪酶-碳酸锰共沉淀颗粒；②在共沉淀颗粒中，加入1mL二硫苏糖醇溶液(pH7.5，0.5mM)，室温下磁力搅拌反应15min，10000r/min离心2min，弃上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤3次以去除二硫苏糖醇，得到沉淀颗粒；为使在酶分子内或分子间游离的巯基形成新的二硫键，向沉淀颗粒中加入1mL磷酸盐缓冲液(pH7.5)(使其被浸没)，室温下磁力搅拌自组装1h，其后10000r/min离心2min,弃去上清液，得自组装沉淀颗粒；③向②中所得自组装沉淀颗粒加入5mL0.2M乙二胺四乙酸二钠溶液，室温条件下震荡反应1h，去除碳酸锰模板，10000r/min离心分离2min，弃去上清液，得沉淀，以上去除碳酸锰模板操作重复3次。去除碳酸锰模板后沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤3次，即可获得多孔脂肪酶微球，于4℃冰箱中保存使用。此多孔酶微球的酶活回收率为45.9％，绝对酶活为60U/g。对该多孔脂肪酶微球的重复使用性进行了测定，如图3所示，由图知，该多孔酶微球重复使用7次后，其酶活仍能达到初始酶活的82％，有很好的重复使用性。
酶活测定方法同实例3。
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (3)

1.一种制备多孔酶微球的方法，其特征为包括以下步骤：
(1)将酶溶液、牛血清白蛋白溶液和硫酸锰溶液加入到反应器中得到混合液，然后向混合液中加入碳酸氢铵溶液，磁力搅拌10～15秒后，静置10～15min，在高速离心分离后，将沉淀用蒸馏水洗涤，即得酶-碳酸锰共沉淀颗粒；
其中，混合液中，酶浓度为1～4mg/mL,牛血清白蛋白浓度为6～9mg/mL，且酶和牛血清白蛋白浓度之和为10mg/mL，硫酸锰的浓度为0.15～0.25M，摩尔比硫酸锰与碳酸氢铵为1:1～5；
(2)向所得的酶-碳酸锰共沉淀颗粒中加入pH值为7.5的二硫苏糖醇溶液，磁力搅拌10～30min，高速离心分离后，沉淀用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液洗涤；再将沉淀重新浸没于pH值为7.5的磷酸盐缓冲液中，室温下磁力搅拌1h，其后高速离心得自组装沉淀颗粒；
其中，二硫苏糖醇溶液的浓度为0.1～0.5mM，体积比二硫苏糖醇溶液：步骤(1)中混合液＝1:1；
(3)将步骤(2)中得到的自组装沉淀颗粒加入乙二胺四乙酸二钠溶液，室温条件下震荡反应30min～1h，离心分离，弃去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤，即得多孔酶微球；
其中，乙二胺四乙酸二钠溶液的浓度为0.1～0.3M，乙二胺四乙酸二钠与硫酸锰的摩尔比为2～5:1。
2.如权利要求1所述的制备多孔酶微球的方法，其特征为所述的酶溶液中，酶为辣根过氧化物酶或脂肪酶，溶剂为pH值为7.0的磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的制备多孔酶微球的方法，其特征为所述的步骤(1)、(2)和(3)中的高速离心的速度为5000～10000r/min。
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