CN105039297A - 一种多孔磁性微球及其固定化酶载体的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多孔磁性微球的制备方法，包括：制备Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；制备多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；制得多孔Fe3O4-多巴胺微球。并将该多孔Fe3O4-多巴胺微球应用于醇脱氢酶的固定化研究。本发明提出的制备方法的优点在于：多孔磁性微球制备过程简便，条件温和，避免有机溶剂和高温高pH的制备条件；所得磁性微球具有多孔特性，应用于固定化酶获得高的酶负载量为130～350mg酶/g载体，高的相对酶活力为26.1～43.4％及高NADH转化率为57.1～95.5％，通过改变微球制备过程中多巴胺浓度和搅拌速度实现多孔微球形貌的调控。
Description
技术领域
本发明涉及一种多孔磁性微球固定化酶载体的制备方法，属于多孔磁性微球及固定化酶的制备技术。
背景技术
近年来，由于酶在精细化工合成、生物传感器、药物和生物燃料电池等领域的应用，固定化酶引起了广泛的重视。相对于游离酶而言，固定化酶具有操作稳定性好，易于回收和再利用等优点。目前，固定化酶载体主要分为纳米材料(纳米颗粒、纳米管等)，微米材料(微球、微囊等)和凝胶。其中，多孔磁性微球用于固定化酶载体具有明显的优势：发达的孔结构有利于降低传质阻力，提高酶催化活性；独特的磁响应特性有利于简化分离过程，促进酶的回收利用。
多孔磁性微球的制备方法主要分为悬浮聚合法、种子溶胀法、原位法等。其中悬浮聚合法和种子溶胀法需有机溶剂作为致孔剂或溶胀剂，且制备过程较为繁琐。原位法多为高温高pH条件下在多孔微球表面及孔结构中原位合成磁性纳米粒子或在微球中合成磁性纳米粒子后采用致孔方法(例如煅烧)获得孔结构。这些制备过程均较繁琐，且制备条件较为苛刻。因此，亟需开发一种温和的、绿色的、通用的多孔磁性微球的制备方法。
多孔CaCO3微球不仅易于合成，具有良好的生物相容性，粒径相对均匀，而且可在温和条件下，通过与EDTA的螯合作用或弱酸条件而去除。此外，CaCO3微球可包埋各种客体分子及其发达的孔结构可为容纳客体分子提供较大的比表面积和更多的吸附位点。试想将其作为反向复制的模板，将多孔微球的制备提供一种绿色、温和、高效的方法。研究表明，以CaCO3为模板，可成功通过反向复制法构建3D多孔微球。但基于CaCO3微球反向复制技术，同时实现功能性和磁性的多孔微球暂时还没有报道。
发明内容
针对现有技术，本发明提供一种多孔磁性微球及其固定化酶载体的制备，该方法制备过程简便，制备条件温和绿色，所得磁性微球具有多孔特性，应用于固定化酶获得高的酶负载量(343.3mg酶/g载体)，高的相对酶活力(43.4％)及高NADH转化率(95.5％)，通过改变微球制备过程中多巴胺浓度和搅拌速度可实现多孔微球形貌的调控。
本发明提出的一种多孔磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向浓度为0.2～0.5M的氯化钙溶液中加入Fe3O4纳米颗粒配成溶液A；配制和氯化钙溶液等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在2000～3000r/min的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的溶液A中，反应20～30秒，去离子水和Tris-HCl缓冲液洗涤，在外加磁场条件下分离，得到Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；
步骤二、配制多巴胺质量浓度为2～8mg/ml的溶液B，其中所用的缓冲液为pH8.5，浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液；按照体积质量比为1:6将多巴胺溶液与步骤一制得的Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球均匀混合，搅拌5～8h，通过外部磁场分离、水洗至上清液为无色，得到多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；
步骤三、配制浓度为50mM的乙二胺四乙酸溶液，记为溶液C，将溶液C与步骤二制得的多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球均匀混合，去除碳酸钙，外部磁场分离，去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到多孔Fe3O4-多巴胺微球。
本发明提出的一种多孔磁性微球固定化酶的制备方法，是：配制1～4mg/ml醇脱氢酶溶液，记为溶液D，将溶液D与上述多孔磁性微球的制备方法制备的多孔Fe3O4-多巴胺微球均匀混合，混合比例为体积质量比1:2，搅拌2～3h得到固定化醇脱氢酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球，即为多孔磁性微球固定化酶。
本发明一种多孔磁性微球固定化酶的应用，其过程是，将还原型辅酶Ⅰ(NADH)溶解于Tris-HCl缓冲液配成NADH摩尔浓度为50～150μM的溶液E，按照摩尔比10～20:1，将溶液E与甲醛溶液混合均匀制得酶催化反应液F。将本发明中制备得到的多孔磁性微球固定化酶载体加入反应液F反应3～5min,检测反应液中NADH吸光值的变化，其酶负载量为130～350mg酶/g载体，相对酶活力为26.1～43.4％，NADH转化率为57.1～95.5％，通过改变微球制备过程中多巴胺浓度和搅拌速度实现多孔微球形貌的调控。
与现有技术相比，本发明提出的一种多孔磁性微球制备及其固定化酶的方法，过程简便，条件温和，避免有机溶剂和高温高pH的制备条件；所得磁性微球具有多孔特性，应用于固定化酶获得高的酶负载量(343.3mg酶/g载体)，高的相对酶活力(43.4％)及高NADH转化率(95.5％)，通过改变微球制备过程中多巴胺浓度和搅拌速度可实现多孔微球形貌的调控。
附图说明；
图1为实施例3制备的多孔Fe3O4-多巴胺微球扫描电镜(SEM)照片。
图2为实施例3制备的多孔Fe3O4-多巴胺微球透射电镜(TEM)照片。
图3为实施例3制备的多孔Fe3O4-多巴胺微球氮气吸附-脱附及孔径分布(BET)曲线；
图4为实施例1制备的多孔Fe3O4-多巴胺微球扫描电镜(SEM)照片；
图5为对比例1制备的巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子扫描电镜(SEM)照片；
图6为实施例3和对比例1制备的固定化酶载体的NADH转化率曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进一步详细描述，所描述的具体实施例仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。
实施例1
步骤一、向浓度为0.33M的氯化钙溶液中加入Fe3O4纳米颗粒配成溶液A；配制和氯化钙等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在2000r/min的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的溶液A中，反应30秒，去离子水和Tris-HCl缓冲液洗涤，在外加磁场条件下分离，得到Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；
步骤二、配制多巴胺质量浓度为2mg/ml的溶液B，其中，Tris-HCl缓冲液，pH8.5,50mM。将100ml多巴胺溶液与步骤一制得的Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球均匀混合，搅拌5h，通过外部磁场分离水洗至上清液为无色，得到多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；
步骤三、配制50mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，记为溶液C，将溶液C与步骤二制得的多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球微球均匀混合去除碳酸钙，外部磁场分离，去离子水洗涤至上清液中不含EDTA，得到多孔Fe3O4-多巴胺微球，其多孔Fe3O4-多巴胺微球的粒径为4.5μm，比表面积86.81m2/g，孔径21.22nm，孔隙率0.39cm3/g，该多孔Fe3O4-多巴胺微球扫描电镜(SEM)照片如图4所示。
步骤四、配制1mg/ml醇脱氢酶(YADH，Tris-HCl缓冲液，pH7.0,50mM)溶液，记为溶液D，将溶液D与步骤三制得的多孔Fe3O4-多巴胺微球均匀混合搅拌2h得到固定化醇脱氢酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球。
步骤五、将NADH溶解于Tris-HCl缓冲液配成NADH摩尔浓度为133μM的溶液E，按照摩尔比13:1，将溶液E与甲醛溶液混合均匀制得酶催化反应液F，将步骤四制得的固定化醇脱氢酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球加入反应液F反应3min,检测反应液中NADH吸光值的变化。
实施例2
本实施例2与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：多巴胺质量浓度由2mg/ml变为4mg/ml。所制得的多孔Fe3O4-多巴胺微球的粒径4.5μm，比表面积48.62m2/g，孔径26.31nm，孔隙率0.30cm3/g。
实施例3
本实施例3与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：多巴胺质量浓度由2mg/ml变为6mg/ml。所制得的多孔Fe3O4-多巴胺微球的粒径4.5μm，比表面积50.18m2/g，孔径16.28nm，孔隙率0.26cm3/g。该多孔Fe3O4-多巴胺微球扫描电镜(SEM)照片如图1所示，透射电镜(TEM)照片如图2所示，图3示出的该多孔Fe3O4-多巴胺微球氮气吸附-脱附及孔径分布(BET)曲线。实施例3制备得到的固定化醇脱氢酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球，其酶固载量为274.5mg酶/g载体，相对酶活性为43.4％及NADH转化率为95.5％。
实施例4
本实施例4与实施例1步骤基本相同，与其不同的是：多巴胺质量浓度由2mg/ml变为6mg/ml，机械搅拌速度由2000r/min变为3000r/min。所制得的多孔Fe3O4-多巴胺微球的粒径3.0μm，比表面积19.46m2/g，孔径23.61nm，孔隙率0.16cm3/g，实施例4制备得到的固定化醇脱氢酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球，其酶负载量为343.3mg酶/g载体，相对酶活性为32.6％。
对比例1
配制6mg/ml多巴胺-Tris-HCl缓冲液；将与实施例1中相同质量的Fe3O4纳米粒子与多巴胺溶液均匀混合，机械搅拌5h，磁性分离，水洗离心至上清液无色，得到多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子。所制得的多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子的粒径30～40nm。该多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子扫描电镜(SEM)照片如图5所示。
制备固定化醇脱氢酶的多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子，并进行检测：
配制1mg/ml醇脱氢酶(YADH，Tris-HCl缓冲液，pH7.0,50mM)溶液，记为溶液D，将溶液D与上述制得的多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子均匀混合搅拌2h得到固定化醇脱氢酶的多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子；将NADH溶解于Tris-HCl缓冲液配成NADH摩尔浓度为133μM的溶液E，按照摩尔比13:1，将溶液E与甲醛溶液混合均匀制得酶催化反应液F，将上述制得的固定化醇脱氢酶的多巴胺涂覆Fe3O4的纳米粒子加入反应液F反应3min，检测反应液中NADH吸光值的变化，其酶负载量为131.5mg酶/g载体，相对酶活性为26.1％及NADH转化率为57.1％。
图6示出了实施例3和对比例1制备的固定化酶载体的NADH转化率曲线。
尽管上面文字对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以做出很多变形，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (3)
1.一种多孔磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、向浓度为0.2～0.5M的氯化钙溶液中加入Fe3O4纳米颗粒配成溶液A；配制和氯化钙溶液等摩尔浓度的碳酸钠溶液，在2000～3000r/min的转速下将碳酸钠溶液迅速倒入等体积的溶液A中，反应20～30秒，去离子水和Tris-HCl缓冲液洗涤，在外加磁场条件下分离，得到Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；
步骤二、配制多巴胺质量浓度为2～8mg/ml的溶液B，其中所用的缓冲液为pH8.5，浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液；按照体积质量比为1:6将多巴胺溶液与步骤一制得的Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球均匀混合，搅拌5～8h，通过外部磁场分离、水洗至上清液为无色，得到多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球；
步骤三、配制浓度为50mM的乙二胺四乙酸溶液，记为溶液C，将溶液C与步骤二制得的多巴胺-Fe3O4纳米颗粒掺杂的多孔CaCO3微球均匀混合，去除碳酸钙，外部磁场分离，去离子水洗涤至上清液中不含乙二胺四乙酸，得到多孔Fe3O4-多巴胺微球。
2.一种多孔磁性微球固定化酶的制备方法，其特征在于，制备步骤是：
配制1～4mg/ml醇脱氢酶溶液，记为溶液D，将溶液D与权利要求1所述多孔磁性微球的制备方法制备的多孔Fe3O4-多巴胺微球均匀混合，混合比例为体积质量比1:2,搅拌2～3h得到固定化醇脱氢酶的多孔Fe3O4-多巴胺微球。
3.一种如权利要求1所述多孔磁性微球的制备方法制得的多孔磁性微球固定化酶的应用，其酶负载量为130～350mg酶/g载体，相对酶活力为26.1～43.4％，NADH转化率为57.1～95.5％，通过改变微球制备过程中多巴胺浓度和搅拌速度实现多孔微球形貌的调控。
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