CN105543205B - 一种降解多环芳烃的微生物膜菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及涉及一种降解污染土壤中多环芳烃的高效微生物膜菌剂及其制备方法。本发明采用胡敏素为载体，附着微生物并形成微生物膜，得到微生物膜菌剂。本发明所述微生物膜菌剂制备方法简单，操作方便，发酵周期短，生长速度快、酶活力高等特点，具有高效利用和降解多环芳烃的特性，是一种高效去除污染环境中多环芳烃的生物技术。

Description

一种降解多环芳烃的微生物膜菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及降解多环芳烃的微生物膜菌剂构建技术，特别涉及一种降解污染土壤中多环芳烃的高效微生物膜菌剂及其制备方法。
技术背景
随着我国工业化、农业集约化、城市化和交通现代化等的快速发展，多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)排放量激增，致使土壤PAHs污染日趋严重，严重威胁了土壤生态环境、农产品安全和人体健康，并影响到我国社会经济的可持续发展。因此，针对土壤污染特点，调控影响土壤净化功能的关键过程，研发PAHs污染土壤修复技术是改善土壤环境质量的有效措施。
污染土壤方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法。生物修复，尤其微生物修复有机物污染土壤比其它方法更加廉价高效。它主要是利用经筛选、驯化的专性微生物或基因工程菌降解或生物代谢土壤中的毒害污染物。但是，外源功能菌由于不适应场地条件和复杂的自然环境，难以同土著菌竞争，其数量或活性通常迅速衰减乃至消失；菌体易流失；有效菌浓度低；导致生化反应启动速度慢；环境耐性差；最终不能确保持续较高的修复效率。因此，确保外源菌的成活是决定多环芳烃污染土壤微生物修复效果的关键因素。微生物膜表面胞外聚合物含有多糖、蛋白质、核酸等有机组分，其组成与微生物膜的种类、载体表面特性和外界环境条件等密切相关，能够使微生物固定在某一特定的位置，从而使微生物在底物的选择和利用方面专一性更强，并能够在长时间内保持稳定的较强的代谢活性。因而，将微生物膜技术引入生物修复技术领域能够加快微生物利用多环芳烃的速率。
发明内容
本发明目的是提供一种可利用和降解多环芳烃的微生物膜菌剂及其制备方法，该微生物菌剂具有制备方法简单，对特定多环芳烃具有高降解活性，特别是对污染土壤中的多环芳烃降解具有高活性。
本发明的技术方案是：将微生物发酵，与经过处理后的胡敏素共混在好氧条件下培养，至胡敏素颗粒表面形成特定的微生物膜，即得到所述的多环芳烃降解菌剂。具体步骤包括：
(1)微生物发酵液的制备：首先将微生物接种至无机盐培养液中，以菲为碳源，培养24～72h至指数生长期；调节微生物OD600值至0.7～0.8，按照1～2:100转入罐发酵13～15h。
(2)胡敏素处理：将胡敏素在280℃下烘烤2～3h，然后研磨成粒径小于100μm的细小颗粒，得到经处理后的胡敏素。
(3)将微生物发酵液与经过处理后的胡敏素按重量比(1～4):1混合，在好氧条件下培养，至胡敏素颗粒表面形成微生物膜，即得到所述的多环芳烃降解菌剂。
所述步骤(1)的微生物菌株由多环芳烃污染土壤中筛选、分离得到，具体为Mycobacterium sp.NJS-P，Mycobacterium sp.NJS-1,Sphingobium sp.PHE3，Micrococcussp.PHE9中的一种或者组合。
所述步骤(1)中发酵温度25-30℃、压力0.03-0.05MPa、通气量为0.1-1.0V V-1min-1、搅拌速度300rpm min-1。
所述步骤(2)经过处理后胡敏素中C、H、N、S元素的含量分别为51.30～52.28％，2.69～2.75％，1.27～1.32％，0.47～0.56％。
所述步骤(3)中好氧培养温度28～35℃，摇床转速90～100r min-1，培养时间10～12h。
所述微生物菌剂按照重量比1:100分散于磷酸缓冲液，胞外蛋白、多糖含量分别为55.4～85.8mg L-1和10.3～13.6mg L-1。
本发明的特点在于：
1、该微生物膜菌剂制备过程简单，操作方便，发酵周期短。
2、本方法制备的微生物膜菌剂，经过生长特性及酶活测定，具有生长速度快、酶活力高等特点。
3、本微生物膜菌剂具有利用和降解多环芳烃的功效，可作为常年除去污染土壤中多环芳烃的手段。
4、本微生物膜菌剂的胞外蛋白、多糖能够吸附多环芳烃，减少多环芳烃的毒性。
具体实施方式
本发明中所涉及的生物材料均为已公开的生物材料，可向相关保藏机构获取。
Mycobacterium sp.NJS-P,Mycobacterium sp.NJS-1(Zeng J.,Lin X.G.,ZhangJ.,Zhu H.,Chen H.and Wong M.H.2013.Successive transformation of benzo[a]pyrene by laccase of Trametes versicolor and pyrene-degrading Mycobacteriumstrains,97:3183-3194.)保藏号分别为：No.CCTCC M 2011011，No.CGMCC 1.10964,
Sphingobium sp.PHE3,Micrococcus sp.PHE9(Zhang,Y.P.,Wang F.,Yang X.L.,Gu C.G.,Kengara F.O.,Hong Q.,Lv,Z.Y.,and Jiang X.,2011.Extracellularpolymeric substances enhanced mass transfer of polycyclic aromatichydrocarbons in the two-liquid-phase system for biodegradation.AppliedMicrobiology and Biotechnology,90:1063-1071.)保藏号分别为：No.CCTCC AB2010361,No.CCTCC AB 2010362
实施例1
1-1、微生物膜菌剂的制备
将菌株Mycobacterium sp.NJS-P活化，然后接种于250mL无机盐培养基中，以浓度3g L-1的菲为碳源，在温度30℃，转速160r min-1条件下培养72h。然后采用无机盐清洗并调节OD600值至0.7，体积约为200mL。随后，按照比例1:50转入发酵罐，维持温度30℃、压力0.05MPa、通气量为0.4V V-1min-1、搅拌速度300rpm min-1、发酵15h，既得微生物发酵菌悬液。然后，取100g胡敏素于280℃烘烤2h，冷却后添加300mL微生物发酵菌悬液，随后振荡培养12h，培养温度是28℃，转速设置为100r min-1，最终得到微生物膜菌剂。
1-2、微生物膜菌剂降解多环芳烃
在烧杯中加入芘50mg，土壤500g，搅拌均匀，保持田间持水量约60％，置于培养箱中平衡24h。随后，添加微生物膜菌剂25g，再次混合均匀，置于培养箱中，常温下进行降解实验。设置两组对照，一组不接种微生物对照，测定芘的挥发量。另一组接种游离单株菌悬液300mL，确定游离单株菌降解芘的量。培养14天后，测定土壤中芘的残留量、土壤水分、计算降解芘的量。结果见附表1。
表1：菌株Mycobacterium sp.NJS-P降解土壤中的芘
处理方式 残留浓度(mg g<sup>-1</sup>) 降解率
未接种 0.087 13％
接种游离单菌 0.059 41％
接种微生物膜菌剂 0.036 64％
实施例2
2-1、微生物膜菌剂的制备
生物膜菌剂制备过程：将菌株Mycobacterium sp.NJS-1活化，然后接种于250mL无机盐培养基中，以浓度3g L-1的菲为碳源，在温度30℃，转速160r min-1条件下培养72h。然后采用无机盐清洗并调节OD600值至0.7，体积约为200mL。随后，按照比例1:100转入发酵罐，维持温度30℃、压力0.03MPa、通气量为0.4V V-1min-1、搅拌速度300rpm min-1、发酵15h，既得微生物发酵菌悬液。然后，取100g胡敏素于280℃烘烤3h，冷却后添加400mL微生物发酵菌悬液，随后振荡培养12h，培养温度是28℃，转速设置为100r min-1，最终得到微生物膜菌剂。
2-2、微生物膜菌剂降解多环芳烃
实验方法：在烧杯中加入芘50mg，土壤500g，搅拌均匀，保持田间持水量约60％，置于培养箱中平衡24h。随后，添加微生物膜菌剂25g，再次混合均匀，置于培养箱中，常温下进行降解实验。设置两组对照，一组不接种微生物对照，测定芘的挥发量。另一组接种游离单株菌悬液400mL，确定游离单株菌降解芘的量。培养14天后，测定土壤中芘的残留量、土壤水分、计算降解芘的量。结果见附表2。
表2：菌株Mycobacterium sp.NJS-1降解土壤中的芘
处理方式 残留浓度(mg g<sup>-1</sup>) 降解率
未接种 0.087 13％
接种游离单菌 0.058 42％
接种微生物膜菌剂 0.031 69％
实施例3
3-1、微生物膜菌剂的制备
生物膜菌剂制备过程：将菌株Sphingobium sp.PHE3活化，然后接种于250mL无机盐培养基中，以浓度3g L-1的菲为碳源，在温度28℃，转速160r min-1条件下培养24h。然后采用无机盐清洗并调节OD600值至0.8，体积约为200mL。随后，按照比例1:50转入发酵罐，维持温度28℃、压力0.03MPa、通气量为0.4V V-1min-1、搅拌速度300rpm min-1、发酵15h，既得微生物发酵菌悬液。然后，取100g胡敏素于280℃烘烤2h，冷却后添加300mL微生物发酵菌悬液，随后振荡培养12h，培养温度是28℃，转速设置为100r min-1，最终得到微生物膜菌剂。
3-2、微生物膜菌剂降解多环芳烃
实验方法：在烧杯中加入菲50mg，土壤500g，搅拌均匀，保持田间持水量约60％，置于培养箱中平衡24h。随后，添加微生物膜菌剂25g，再次混合均匀，置于培养箱中，常温下进行降解实验。设置两组对照，一组不接种微生物对照，测定芘的挥发量。另一组接种游离单株菌悬液300mL，确定游离单株菌降解芘的量。培养3天后，测定土壤中菲的残留量、土壤水分、计算降解菲的量。结果见附表3。
表3：菌株Sphingobium sp.PHE3降解土壤中的菲
处理方式 残留浓度(mg g<sup>-1</sup>) 降解率
未接种 0.069 31％
接种游离单菌 0.037 63％
接种微生物膜菌剂 0.008 92％
实施例4
4-1、微生物膜菌剂的制备
生物膜菌剂制备过程：将菌株Micrococcus sp.PHE9活化，然后接种于250mL无机盐培养基中，以浓度3g L-1的菲为碳源，在温度28℃，转速160r min-1条件下培养24h。然后采用无机盐清洗并调节OD600值至0.8，体积约为200mL。随后，按照比例1:50转入发酵罐，维持温度28℃、压力0.03MPa、通气量为0.4V V-1min-1、搅拌速度300rpm min-1、发酵15h，既得微生物发酵菌悬液。然后，取100g胡敏素于280℃烘烤3h，冷却后添加400mL微生物发酵菌悬液，随后振荡培养12h，培养温度是28℃，转速设置为100r min-1，最终得到微生物膜菌剂。
4-2、微生物膜菌剂降解多环芳烃
实验方法：在烧杯中加入菲50mg，土壤500g，搅拌均匀，保持田间持水量约60％，置于培养箱中平衡24h。随后，添加微生物膜菌剂25g，再次混合均匀，置于培养箱中，常温下进行降解实验。设置两组对照，一组不接种微生物对照，测定芘的挥发量。另一组接种游离单株菌悬液400mL，确定游离单株菌降解芘的量。培养3天后，测定土壤中菲的残留量、土壤水分、计算降解菲的量。结果见附表4。
表4：菌株Micrococcus sp.PHE9降解土壤中的菲
处理方式 残留浓度(mg g<sup>-1</sup>) 降解率
未接种 0.069 31％
接种游离单菌 0.035 65％
接种微生物膜菌剂 0.004 96％

Claims (5)

1.一种降解多环芳烃的微生物膜菌剂，该菌剂是将微生物固定在胡敏素上形成微生物膜，其特征是通过如下方法制得：
(1)微生物发酵液的制备：将微生物接种至无机盐培养液中，以菲为碳源，培养24～72h至指数生长期；调节微生物OD600值至0.7～0.8，按照1～2:100转入罐发酵13～15h；所述的微生物是CCTCC AB 2010361、CCTCC AB 2010362中的一种或者组合；
(2)胡敏素处理：将胡敏素在280℃下烘烤2～3h，然后研磨成粒径小于100μm的细小颗粒，得到经处理后的胡敏素；经过处理后胡敏素中C、H、N、S元素的含量分别为51.30～52.28％，2.69～2.75％，1.27～1.32％，0.47～0.56％；
(3)将微生物发酵液与经处理后的胡敏素按重量比(1～4):1混合，在好氧条件下培养，至胡敏素颗粒表面形成微生物膜，即得到所述的多环芳烃降解菌剂。
2.一种权利要求1所述降解多环芳烃的微生物膜菌剂的制备方法，
其特征是通过如下方法制得：
(1)微生物发酵液的制备：将微生物接种至无机盐培养液中，以菲为碳源，培养24～72h至指数生长期；调节微生物OD600值至0.7～0.8，按照1～2:100转入罐发酵13～15h；所述的微生物是CCTCC AB 2010361、CCTCC AB 2010362中的一种或者组合；
(2)胡敏素处理：将胡敏素在280℃下烘烤2～3h，然后研磨成粒径小于100μm的细小颗粒，得到经处理后的胡敏素；经过处理后胡敏素中C、H、N、S元素的含量分别为51.30～52.28％，2.69～2.75％，1.27～1.32％，0.47～0.56％；
(3)将微生物发酵液与经处理后的胡敏素按重量比(1～4):1混合，在好氧条件下培养，至胡敏素颗粒表面形成微生物膜，即得到所述的多环芳烃降解菌剂。
3.根据权利要求2所述的降解多环芳烃的微生物膜菌剂制备方法，其特征在于：步骤(1)中发酵温度25-30℃、压力0.03-0.05MPa、通气量为0.1-1.0V V-1min-1、搅拌速度300rpmmin-1。
4.根据权利要求2所述降解多环芳烃的微生物膜菌剂制备方法，其特征在于：步骤(3)中好氧培养温度28～35℃，摇床转速90～100r min-1，培养时间10～12h。
5.根据权利要求2所述降解多环芳烃的微生物膜菌剂制备方法，其特征在于：所制备微生物膜菌剂按照重量比1:100分散于磷酸缓冲液，胞外蛋白、多糖含量分别为55.4～85.8mgL-1和10.3～13.6mg L-1。
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