CN105543202B - 一种提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法 - Google Patents

一种提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高L‑天冬氨酸α‑脱羧酶生物活性的方法，包括将L‑天冬氨酸α‑脱羧酶发酵菌液破碎，用纯水稀释；加入天冬氨酸氨水溶液；调节pH值为6.0‑8.0。本发明方法大大提高了L天冬氨酸α脱羧酶的活性，时空收率提高30％‑50％，选择性提高到98％以上。

Description

一种提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体地说，涉及一种提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法。
背景技术
β-丙氨酸，又称3-氨基丙酸，主要用于合成泛酸及泛酸钙，而其合成的β-丙氨酸金属配合物衍生出新型的抗炎药物，还可作为药物制剂制备中的沉淀剂，水的净化絮凝剂，电镀缓蚀剂，铅中毒解毒剂等。
β-丙氨酸的生产方法主要有化学法和生物法。化学法有丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亚胺降解法、β-氨基丙腈法。以上方法都存在副反应复杂，产生大量工业废水的缺点。生物法有有机腈降解酶催化β-氨基丙腈以及L-天冬氨酸α-脱羧酶能够催化脱去L-Asp为底物的α羧基，生成β-丙氨酸。而L-天冬氨酸α脱羧酶在酶催化反应过程中随着L-天冬氨酸浓度的增加活性会出现下降，β-丙氨酸的时空收率较低，选择性一般在93％以下。
随着对β-丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟，β-丙氨酸在医药、化工、食品、环境等领域的作用日渐突出，积极寻求绿色环保型的生产方法是具有十分明显的经济效益和社会效益的。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供一种提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法，所述方法包括如下步骤：
1)将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液破碎，将所述破碎后的发酵菌液用纯水稀释；
2)加入天冬氨酸氨水溶液；调节该反应体系pH值为6.0-8.0。
上述方法中，优选所述天冬氨酸氨水溶液的pH值为6.0-8.0，优选为7.0。
采用上述方法提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性后，β-丙氨酸的时空收率显著上升，选择性明显提高。
本发明还提供一种β-丙氨酸的制备方法，包括按上述提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法制得反应体系；还包括持续向所述反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0；将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
具体地，上述β-丙氨酸的制备方法，包括如下步骤：
1)将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液破碎，将所述破碎后的发酵菌液用纯水稀释；
2)加入pH值为6.0-8.0的天冬氨酸氨水溶液；优选所述天冬氨酸氨水溶液的pH值为7.0；调节该反应体系pH值为6.0-8.0；
3)持续向所述反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0；
4)将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
上述提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法及β-丙氨酸的制备方法中，
进一步地，采用高频超声方法破碎所述发酵菌液。
进一步地，将所述破碎后的发酵菌液使用纯水稀释0-2倍。
进一步地，步骤1)还包括向破碎后的发酵菌液中加入适量的维生素C磷酸酯；进一步地，所述加入维生素C磷酸酯的重量与所述发酵菌液(指稀释前)体积的比例为0.01-0.10g/L。
进一步地，步骤2)所述天冬氨酸氨水溶液用量为总反应体积的0.5％-2％。
所述天冬氨酸氨水溶液的制备方法包括：称取适量的天冬氨酸晶体于烧杯中，25℃水浴条件下滴加氨水进行搅拌溶解，持续滴加至所需pH值时为止(如至pH值为6.0-8.0时为止)。
进一步地，步骤3)所述反应温度为20-65℃；更进一步地，所述反应温度为30-50℃。
更具体地，上述β-丙氨酸的制备方法，包括如下步骤：
1)将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液经高频超声破碎，将所述破碎后的发酵菌液用纯水稀释0-2倍；加入维生素C磷酸酯；所述加入维生素C磷酸酯的重量与稀释前所述发酵菌液体积的比例为0.01-0.10g/L；
2)加入pH值为7.0的天冬氨酸氨水溶液；调节该反应体系pH值为6.0-8.0；
3)持续向反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0，反应温度为30-50℃；
4)将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
本发明所述L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液可采用现有技术方法制备，本发明不做特别限制，例如文献《L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究》(浙江工业大学硕士学位论文.2007)记载的方法进行制备。
本发明可采用本领域常用的pH值调节剂来调节反应体系的pH值。
本发明方法β-丙氨酸的转化率达95％以上，β-丙氨酸的纯度达98％以上。
本发明的有益效果在于：本发明提供的提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法，酶液稳定，时空收率提高30％-50％，选择性提高到98％以上。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。以下实施例及对比例所述L-天冬氨酸α-脱羧酶以文献《L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究》(浙江工业大学硕士学位论文.2007)记载的方法制备。
实施例1
将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液经高频超声破碎，取破碎后的发酵菌液5L，使用纯水稀释1倍。搅拌升温至40℃，再加入100ml的pH值为7.0的天冬氨酸氨水溶液混合后进行催化反应，在40℃下持续向反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0反应24h。分别在12h和24h取样，使用高效液相色谱检测天冬氨酸残留与β-丙氨酸含量，检测结果如下表，结果表明24h天冬氨酸总投料量106.4g，β-丙氨酸的选择性为91.1％。
反应时间/h 天冬氨酸投料量/g 天冬氨酸含量/g/L β-丙氨酸含量/g/L
12 83.3 0.36 51.9
24 106.4 0.91 65.0
将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
经HPLC检测计算，本方法β-丙氨酸的转化率达89.3％，β-丙氨酸的纯度达93.6％。
实施例2
将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液经高频超声破碎，取破碎后的发酵菌液5L，不使用纯水稀释。搅拌升温至40℃，再加入25ml的pH值为7.0的天冬氨酸氨水溶液混合后进行催化反应，在40℃下持续向反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0反应24h。分别在12h和24h取样，使用高效液相色谱检测天冬氨酸残留与β-丙氨酸含量，检测结果如下表，结果表明24h天冬氨酸总投料量103.1g，β-丙氨酸的选择性为89.1％。
反应时间/h 天冬氨酸投料量/g 天冬氨酸含量/g/L β-丙氨酸含量/g/L
12 80.8 0.28 50.1
24 103.1 1.24 61.6
将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
经HPLC检测计算，本方法β-丙氨酸的转化率达87.1％，β-丙氨酸的纯度达92.3％。
实施例3
按照实施例2的方法，区别点仅在于高频超声破碎后的发酵菌液使用纯水稀释1倍后加入维生素C磷酸酯0.5g，同样条件下反应24h。分别在12h和24h取样，使用高效液相色谱检测天冬氨酸残留与β-丙氨酸含量，检测结果如下表，结果表明同实施例1未加酶稳定剂维生素C磷酸酯相比，在24h内β-丙氨酸的时空收率提高41％，β-丙氨酸的选择性提高到为97.8％。
反应时间/h 天冬氨酸投料量/g 天冬氨酸含量/g/L β-丙氨酸含量/g/L
12 94.8 0.13 61.2
24 132.6 0.88 86.89
将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
经HPLC检测计算，本方法β-丙氨酸的转化率达96.4％，β-丙氨酸的纯度达98.4％。
实施例4
按照实施例1的方法，区别点仅在于将酶催化反应温度调整为50℃。分别在12h和24h取样，使用高效液相色谱检测天冬氨酸残留与β-丙氨酸含量，检测结果如下表，结果表明在24h天冬氨酸总投料量101.5g，β-丙氨酸的选择性为92％。
反应时间/h 天冬氨酸投料量/g 天冬氨酸含量/g/L β-丙氨酸含量/g/L
12 84.6 0.09 52.5
24 108.5 1.08 66.9
将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
经HPLC检测计算，本方法β-丙氨酸的转化率达88.7％，β-丙氨酸的纯度达91.9％。
实施例5
按照实施例4的方法，区别点仅在于高频超声破碎后的发酵菌液使用纯水稀释1倍后加入维生素C磷酸酯0.25g，同样条件下反应24h。分别在12h和24h取样，使用高效液相色谱检测天冬氨酸残留与β-丙氨酸含量，检测结果如下表，结果表明同实施例1未加酶稳定剂维生素C磷酸酯相比，在24h内β-丙氨酸的时空收率提高41.2％，β-丙氨酸的选择性提高到为98.0％。
反应时间/h 天冬氨酸投料量/g 天冬氨酸含量/g/L β-丙氨酸含量/g/L
12 98.6 0.15 64.1
24 144.7 0.44 94.8
将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
经HPLC检测计算，本方法β-丙氨酸的转化率达97.5％，β-丙氨酸的纯度达98.7％。
对比例1
按照实施例1的方法，区别点仅在于不加入pH为7.0的天冬氨酸氨水溶液，分别在12h和24h取样，使用高效液相色谱检测天冬氨酸残留与β-丙氨酸含量，检测结果如下表，结果表明在24h天冬氨酸总投料量78.9g，β-丙氨酸的选择性为90.2％。
反应时间/h 天冬氨酸投料量/g 天冬氨酸含量/g/L β-丙氨酸含量/g/L
12 58.6 0.10 38.9
24 78.9 1.12 47.6
将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
经HPLC检测计算，本方法β-丙氨酸的转化率达88.2％，β-丙氨酸的纯度达92.6％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种提高L-天冬氨酸α-脱羧酶生物活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液破碎，将所述破碎后的发酵菌液用纯水稀释1倍；向破碎后的发酵菌液中加入维生素C磷酸酯；所加入维生素C磷酸酯的重量与稀释前所述发酵菌液体积的比例为0.05-0.10g/L；
2）加入天冬氨酸氨水溶液，调节该反应体系pH值为6.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所加入维生素C磷酸酯的重量与所述发酵菌液体积的比例为0.05g/L或0.10g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用高频超声方法破碎所述发酵菌液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）所述天冬氨酸氨水溶液的pH值为6.0-8.0。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述天冬氨酸氨水溶液的pH值为7.0。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2）所述天冬氨酸氨水溶液用量为总反应体积的0.5%-2%。
7.一种β-丙氨酸的制备方法，其特征在于，包括按权利要求1-6任一项所述方法制得反应体系；还包括持续向所述反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0；将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，向所述反应体系加入天冬氨酸固体后调节所述反应体系温度为20-65℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系温度调节为30-50℃。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵菌液经高频超声破碎，将所述破碎后的发酵菌液用纯水稀释1倍；加入维生素C磷酸酯；所述加入维生素C磷酸酯的重量与稀释前所述发酵菌液体积的比例为0.05-0.10g/L；
2）加入pH值为7.0的天冬氨酸氨水溶液；调节该反应体系pH值为6.0-8.0；
3）持续向反应体系加入天冬氨酸固体，调节反应体系pH值为6.0-8.0，反应温度为30-50℃；
4）将所得反应物进行过滤、脱色、结晶处理，即得β-丙氨酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107354142A (zh) * 2017-09-14 2017-11-17 精晶药业股份有限公司 一种L‑天门冬氨酸‑α‑脱羧酶酶液处理方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101210230A (zh) * 2006-12-28 2008-07-02 浙江工业大学 一种产β-丙氨酸的基因工程菌及其制备与应用
KR20080085377A (ko) * 2007-03-19 2008-09-24 주식회사 엠에이치투 바이오케미칼 Ｌ-오르니친염의 제조방법
CN103898033A (zh) * 2012-12-25 2014-07-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建、表达及应用
CN104531796A (zh) * 2014-12-11 2015-04-22 安徽华恒生物科技股份有限公司 β-丙氨酸的合成方法
WO2016127469A1 (zh) * 2015-02-09 2016-08-18 中国科学院微生物研究所 用于生产β-丙氨酸的工程菌及生产β-丙氨酸的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101210230A (zh) * 2006-12-28 2008-07-02 浙江工业大学 一种产β-丙氨酸的基因工程菌及其制备与应用
KR20080085377A (ko) * 2007-03-19 2008-09-24 주식회사 엠에이치투 바이오케미칼 Ｌ-오르니친염의 제조방법
CN103898033A (zh) * 2012-12-25 2014-07-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产β-丙氨酸的基因工程菌的构建、表达及应用
CN104531796A (zh) * 2014-12-11 2015-04-22 安徽华恒生物科技股份有限公司 β-丙氨酸的合成方法
WO2016127469A1 (zh) * 2015-02-09 2016-08-18 中国科学院微生物研究所 用于生产β-丙氨酸的工程菌及生产β-丙氨酸的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β-丙氨酸的研究;高丽娟;《万方数据知识服务平台》;20071226;1-95 *

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