CN105543163A - 一种用于全悬浮培养mdck细胞的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：亚锡酸钠；重组人表皮细胞生长因子；氢化可的松；重组全链胰岛素；***素E1；人转铁蛋白；甲状腺素(T3)；维生素E；胆固醇；乙醇胺；β-巯基乙醇；吐温-80；HyPep1510；重组人血白蛋白ACF；甘露醇糖。本发明的培养基在不加入血清的情况下，能够很好地全悬浮培养MDCK细胞，连续培养20代，MDCK细胞的平均增殖浓度为2.308×106/mL，平均细胞活力为97.4%，平均倍增时间为34.48h,为我国开发哺乳动物细胞基质的流感疫苗提供技术支撑。

Description

一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基。
背景技术
流感(禽流感)是危害人类健康和养禽业发展的重要传染病，疫苗接种是目前预防流感(禽流感)的最主要手段之一，传统流感疫苗用鸡胚培养生产，该方法存在制备过程中微生物污染几率高、产品内毒含量高、注射副反应大、废物有环境污染处理成本高、流感大流行暴发时鸡胚供应困难和生产周期长等工艺缺点，因此开发安全、高效的动物细胞基质流感疫苗势在必行。
MDCK细胞(Madin-Darbycaninekidneycells，MDCK)由Madin和Darby于1958年从美国CockerSpaniel母曲架犬的肾脏组织分离培养。是目前公认的适于甲、乙型流感病毒疫苗生产的理想细胞系之一，已有荷兰苏威制药公司、瑞士诺华公司和美国阿斯利康旗下的MedImmune公司批准利用MDCK细胞生产流感疫苗。我国也有多家企业正在利用MDCK细胞进行流感疫苗的研发，但目前还没有自主研发的MDCK细胞生产的流感疫苗上市，原因除我国企业起步较晚外，MDCK细胞培养个性化培养基也是制约我国细胞基质流感疫苗研发进程的重要因素。
我国许多细胞基质的疫苗正在进行或完成了从传统的转瓶工艺向生物反应器高密度培养工艺升级转型，生物反应器培养细胞有两种方式，一种是利用细胞本身要贴附在培养物表面生长的特性进行微载体培养，这种方式要实现大规模培养时工艺路线复杂不容易掌握，导致的结果是现有条件下培养规模小，在生产中要使用数量很多的小型生物反应器才能生产任务，由于反应器之间的差异最终导致整个产品有较大的批间差，而且培养工艺中要使用动物血清提供细胞在微载体上贴附的贴壁因子，增加了生物安全的风险和下游纯化工艺。第二种将细胞驯化成可全悬浮培养的细胞后进行生物反应器全悬浮培养，目前用BHK21细胞在***疫苗中已全部完成工艺升级，国内生物反应器无血清培养的单罐培养体积可达3000L，是微载体培养单罐体积的60倍之多。全悬浮培养工艺容易线性放大，而且还可采用无血清培养基，提高了下游产品的生物安全性，简化了纯化工作，是目前新疫苗研发的方向。
无血清培养基使用成分明确的血清替代物，不仅简化了下游工艺，也避免了生物污染风险，但是目前血清成分仍不清楚，况且MDCK细胞本身对培养条件要求高，开发该细胞无血清培养基一直是该领域研究的重点和难点。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，为我国流感疫苗生物反应器培养工艺提供支撑。
本发明的第一个目的是提供一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：亚锡酸钠；重组人表皮细胞生长因子(EGF)；氢化可的松；重组全链胰岛素；***素(E1)；人转铁蛋白；甲状腺素(T3)；维生素E；胆固醇；乙醇胺；β-巯基乙醇；吐温-80；HyPep1510；重组人血白蛋白ACF；甘露醇糖。
作为优选，所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：
微量元素：
亚锡酸钠0.000001-0.00001g/L
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.00005-0.0005g/L
氢化可的松0.000012-0.00006g/L
重组全链胰岛素0.001-0.01g/L
***素(E1)0.00001-0.00005g/L
人转铁蛋白0.002-0.008g/L
甲状腺素(T3)1-5×10-10g/L
脂类复合物：
维生素E0.00001-0.0001g/L
胆固醇0.00001-0.0001g/L
乙醇胺0.0005-0.001g/L
β-巯基乙醇0.0005-0.001g/L
吐温-800.005-0.01g/L
植物水解物：
HyPep15101-10g/L
重组人血白蛋白：
ACF0.5-5g/L
其它：
甘露醇糖0.5-5g/L。
作为进一步优选，所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：
微量元素：
亚锡酸钠0.000005g/L
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0001g/L
氢化可的松0.000036g/L
重组全链胰岛素0.005g/L
***素E10.000025g/L
人转铁蛋白0.0047g/L
甲状腺素(T3)4.0×10-10g/L
脂类复合物：
维生素E0.00005g/L
胆固醇0.00005g/L
乙醇胺0.000925g/L
β-巯基乙醇0.000975g/L
吐温-800.00625g/L
植物水解物：
HyPep15105g/L
重组人血白蛋白：
ACF0.5-1g/L
其它：
甘露醇糖1g/L。
作为优选，所述重组人血白蛋白ACF的浓度为0.5g/L或1g/L。
本发明的第二个目的是提供上述培养基的制备方法，其特征在于：是将脂溶性原料乳化冻干后与其它原料混合，磨细即得。
使用时，用注射用水溶解,每升加2200mgNaHCO3，定容，用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2，过滤除菌即得。
本发明的第三个目的是提供上述培养基的制备方法，其特征在于：将脂溶性原料乳化后(不需要冻干)与其它原料依次溶解于注射用水，然后每升加入2200mgNaHCO3，定容，最后用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2，过滤除菌即得。
本发明的第四个目的是提供上述培养基在无血清全悬浮培养MDCK细胞中的应用。
本发明的第五个目的是提供应用上述培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法，在权利要求1-4任一所述的培养基中直接接种MDCK细胞，不添加血清，在37℃，120rpm的转速下摇床培养。
为了得到全悬浮培养MDCK细胞无血清培养基，本申请人进行了大量实验，在基本确定了培养基中含有的各项组分后，又对最佳配比进行了大量实验，以下为部分实验过程及实验结果。
本申请人以商品化的DMEM/F12培养基配方为基础，通过调整氯化钠浓度调节渗透压和添加植物水解蛋白、重组人血白蛋白、生长因子和脂类，设计和优化MDCK悬浮细胞生长的无血清培养基配方。
①预试验一：在DMEM/F12培养基直接加下列添加物(单位：g/L)：
微量元素：
亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0001
氢化可的松0.000036
重组全链胰岛素0.005
***素E10.000025
人转铁蛋白0.0047
甲状腺素(T3)4.0×10-10
脂类复合物：
维生素E0.0002
胆固醇0.0002
乙醇胺0.0037
β-巯基乙醇0.0039
吐温-800.025(密度为1.09g/ml，称量时按1g/ml计)
植物水解物：
HyPep151010
重组人血白蛋白：
ACF1
其它：
甘露醇糖1
调pH为7.10±0.2，测定渗透压，过滤除菌后，以3.0×105/ml的细胞密度接种MDCK悬浮细胞，悬浮培养测试细胞生长效果，培养温度：37℃，转速：120rpm。
结果：预试验一配制的培养基渗透压的摩尔浓度为368mmol/kg，渗透压摩尔浓度超出MDCK细胞承受的范围，以此培养基培养MDCK悬浮细胞时，细胞体积显著减小，生长缓慢，不能够正常生长。结果见表1。
表1预试验一配制的培养基悬浮培养MDCK培养基的结果
②预试验二：以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方加，另外再添加同预试验一相同的微量元素、生长因子、脂类复合物、植物水解物、重组人血白蛋白和甘露醇糖，调pH为7.10±0.2，测定渗透压，过滤除菌后，以3.0×105/ml细胞密度接种MDCK悬浮细胞，进行悬浮培养测试细胞生长效果，培养温度：37℃，转速：120rpm。
结果：预试验二配制的培养基渗透压摩尔浓度为312mmol/kg，培养MDCK悬浮细胞，单细胞的状态比较好，圆且亮，但有严重的细胞结团，尚不能正常培养MDCK悬浮细胞。结果见表2。
表2预试验二配制的培养基悬浮培养MDCK培养基的结果
通过以上两次预试验都没有达到预期效果，故选择对生长因子、脂类复合物、植物水解物和重组人血白蛋白等主要添加物进行单因素最佳培养浓度筛选。
③植物水解蛋白最佳培养浓度筛选
以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方添加，另外加亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005g/L和甘露醇糖1g/L为基础配方，分别添加10g/L、7.5g/L、5g/L、2.5g/L植物水解蛋白Hypep1510进行培养测试，以DMEM/F12培养基基础配方作为空白对照。
结果：HyPep1510对MDCK悬浮细胞生长的作用结果参见图1，从图1可以看出HyPep1510对MDCK悬浮细胞的生长有明显的促进作用。当添加浓度为10g/L时细胞出现严重的接团现象，培养至后期尤为严重，且培养至72h细胞活力明显下降，由96.5％下降至65％；当添加浓度为7.5g/L时细胞出现较为严重的结团，但较10g/L好；当添加浓度为5g/L时细胞出现轻微接团现象；当添加浓度为2.5g/L时几乎无细胞接团，且细胞明亮，大小均一，状态较好。7.5g/L、5g/L、2.5g/L细胞活率均在90％以上。综合细胞生长效果及生产投入成本，单独添加时HyPep1510的最佳浓度确定为2.5g/L。
④重组人血白蛋白最佳培养浓度筛选
以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方添加，另外加亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.0000055g/L和甘露醇糖15g/L为基础配方，分别添加1g/L、0.75g/L、0.5g/L、0.25g/L重组人血白蛋白ACF进行培养测试，以DMEM/F12培养基基础配方作为空白对照。
结果：重组人血白蛋白对MDCK悬浮细胞生长的作用结果参见图2，从图2可以看出，1g/L、0.75g/L、0.5g/L、0.25g/L4个梯度细胞形态都较好，细胞大小均一且未出现细胞接团现象，可见重组人血白蛋白ACF对维持MDCK悬浮细胞正常形态有重要的作用，同时可以推断出ACF不是造成细胞结团的重要因素。由图2可以看出，当添加浓度为0.25g/L时，培养至72h细胞密度为63×104/mL，比1g/L、0.75g/L、0.5g/L细胞密度低很多。因此，单独添加时重组人血白蛋白ACF的最佳浓度为0.5g/L。
⑤生长因子混合物最佳培养浓度筛选
以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方添加，另外加亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005g/L和甘露醇糖1g/L为基础配方，生长因子混合物按下列浓度组合为100％计算(单位：g/L)，以100％、75％、50％和25％进行培养测试，以DMEM/F12培养基基础配方作为空白对照。
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0001
氢化可的松0.000036
重组全链胰岛素0.005
***素E10.000025
人转铁蛋白0.0047
甲状腺素(T3)4.0×10-10
结果：生长因子混合物对MDCK悬浮细胞生长的作用结果参见图3，从图3可以看出生长因子混合物对MDCK悬浮细胞的生长没有明显的促进作用，但是对细胞维持生长有重要的作用。当添加浓度分别为100％、75％、50％、25％时，100％、75％呈现抑制细胞生长，细胞无显著增长；50％细胞生长较好，本组中4个浓度均未出现细胞接团现象。
⑥脂类复合物最佳培养浓度筛选
以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方添加，另外加亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005g/L和甘露醇糖1g/L为基础配方，脂类复合物按下列浓度组合为100％计算(单位：g/L)，以100％、75％、50％和25％进行培养测试，以DMEM/F12培养基基础配方作为空白对照。
维生素E0.0002
胆固醇0.0002
乙醇胺0.0037
巯基乙醇0.0039
吐温-800.025
结果：脂类复合物对MDCK悬浮细胞生长的作用结果参见图4，从图4可以看出，25％组是本组中细胞生长最佳的。培养过程中100％组死细胞较多，培养基中出现很多黑渣滓，50％、25％组细胞形态好。因此脂类复合物的添加浓度不能过高，过高会导致细胞死亡，在目前的配方设计添加量时，添加25％的混合物添加物可以达到细胞培养的最佳效果，并且脂类复合物也不会引起细胞结团。
⑦单因素最佳培养浓度配方测试
根据③-⑥的试验结果，以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方添加，另外加入亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005g/L和甘露醇糖1g/L为基础配方，再加入步骤③-⑥筛选的各组分最佳浓度，即加入植物水解蛋白Hypep15102.5g/L、重组人血白蛋白0.5g/L、生长因子混合物GF50％(重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.00005g/L、氢化可的松0.000018g/L、重组全链胰岛素0.0025g/L、***素E10.0000125g/L、人转铁蛋白0.00235和甲状腺素T32.0×10-10g/L)和脂类复合物Lip25％(维生素E0.00005g/L、胆固醇0.00005g/L、乙醇胺0.000925、β-巯基乙醇0.000975g/L和吐温-800.00625g/L)，配制成培养基进行测试，以基础配方作为空白对照。
结果：按照单因素最佳培养浓度配方Hypep1510-2.5g/L、ACF-0.5g/L、GF-50％、Lip-25％为最佳添加量制备培养基时，细胞计数结果参见表3，细胞生长并不理想。
表3按照单因素最佳培养浓度配方制备的培养基的培养效果
⑧配方优化
在前期单因素试验的基础上，以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方，另外加亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005g/L和甘露醇糖1g/L为基础配方，对植物水解蛋白HyPep1510、重组人血白蛋白ACF、生长因子(GF)和脂类复合物(Lip)进行了优化，采用L16(45)正交试验，试验方案见表4。同时仍以DMEM/F12培养基基础配方为对照，进行细胞培养确定最佳组合。MDCK悬浮细胞接种密度为1.5×105个/mL进行测试。
表4正交试验L16(45)因素水平
正交实验结果参见表5。
表5正交实验结果
⑨正交试验结果的组合配方
根据表5的正交试验结果，以倍增时间A3B1C1D4和最大增殖浓度A3B3C1D4两个组合进行细胞培养筛选，MDCK悬浮细胞接种密度为50×104个/mL进行测试。
结果：以最佳倍增时间A3B1C1D4和最大增殖浓度A3B3C1D4两个组合进行细胞培养筛选结果见表6和图5，由表6和图5可以看出A3B3C1D4的组合细胞培养效果比A3B1C1D4的组合好，应用A3B3C1D4组合制备得到的培养基，MDCK细胞的最大增殖浓度为2.45×106/mL，倍增时间为34.25h。
表6最佳培养基配方的筛选
⑩最终配方
以最大增殖浓度(A3B3C1D4)为指标的最佳组合，即以DMEM/F12配方数据为参考，除NaCl加5g/L，其它所有物质按DMEM/F12培养基的标准配方添加，另外加入亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005g/L和甘露醇糖1g/L为基础配方，再加入步骤⑨筛选得到的最佳浓度组合，即加入植物水解蛋白Hypep15105g/L、重组人血白蛋白0.5g/L、生长因子混合物GF100％(重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0001g/L、氢化可的松0.000036g/L、重组全链胰岛素0.005g/L、***素E10.000025g/L、人转铁蛋白0.0047和甲状腺素T34.0×10-10g/L)和脂类复合物Lip25％(维生素E0.00005g/L、胆固醇0.00005g/L、乙醇胺0.000925g/L、β-巯基乙醇0.000975g/L和吐温-800.00625ml)，配制成培养基进行测试，连续培养20代。
结果：MDCK悬浮细胞连续传代培养20代最大增殖浓度、细胞活力和倍增时间结果参见图6-图8。由图6-图8可见：每代细胞生长都较好，细胞大小均一，形态一致。20代平均增殖密度为2.308×106/mL，平均细胞活力为97.4％，平均倍增时间为34.48h。
经实验，本发明的培养基在不加入血清的情况下，能够很好地全悬浮培养MDCK细胞，为我国流感疫苗生物反应器培养工艺提供了技术支撑。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为植物水解蛋白在培养基中最佳培养浓度的筛选；
图2为重组人血白蛋白在培养基中最佳培养浓度的筛选；
图3为生长因子混合物在培养基中最佳培养浓度的筛选；
图4为脂类复合物在培养基中最佳培养浓度的筛选；
图5为最佳培养基配方的筛选；
图6为应用本发明的培养基连续传代MDCK悬浮细胞的最大增殖浓度曲线图；
图7为应用本发明的培养基连续传代MDCK悬浮细胞的细胞活力图；
图8为应用本发明的培养基连续传代MDCK悬浮细胞的倍增时间图；
图9为应用本发明的培养基连续传代MDCK悬浮细胞，培养20代时的细胞图；
图10为应用本发明的培养基培养MDCK悬浮细胞，培养72h时的细胞图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
材料来源
1细胞：MDCK悬浮细胞，甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。
2原材料
培养基和血清：DMEM/F12(Gibco公司,货号：12500)，新生牛血清(兰州民海生物工程有限公司批号：20141028)；
氨基酸：L-丙氨酸，L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-水合物，L-天冬氨酸，L-半胱氨酸-水合物，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸盐酸盐水合物，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-缬氨酸，L-胱氨酸-盐酸盐水合物(以上均采购自Solarbio公司)；
维生素：氯化胆碱，次黄嘌呤钠，烟酰胺，泛酸，盐酸腐胺，盐酸吡哆醇，盐酸硫胺，胸苷，维生素B12，抗坏血酸磷酸酯，D-生物素，叶酸，核黄素(均为Sigma公司生产)；
碳水化合物：D-葡萄糖，甘露糖(国药集团)；
脂类复合物：胆固醇，乙醇胺，亚油酸，硫辛酸，巯基乙醇，吐温-80(均为Sigma公司生产)；
生长因子/激素：重组人表皮生长因子EGF，氢化可的松，重组全链胰岛素，***素E1，人转铁蛋白，甲状腺素(T3)(均为Sigma公司生产)；
植物水解蛋白：HyPep1510(Sheffield公司生产)；
重组人血白蛋白ACF(Sheffield公司生产)；
其它：谷胱甘肽(Sigma公司生产)；
化学试剂为国产分析纯。
3设备：CO2培养箱(美国Thermo3111)，普通显微镜(日本Olympus，CX21)，倒置相差显微镜(日本OLYMPUSCKX41+DP72)，细胞计数仪(美国，INNOVATIS，CASYTT)，摇床(上海智诚分析仪器制造公司，ZHWY-2102C)和电子天平(上海，梅特勒托利多上海总公司，AR2140)等。
实施例1
本发明的用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基是在含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基的基础上加入以下组分(单位为g/L)配制得到的：
微量元素：
亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000005
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0001
氢化可的松0.000036
重组全链胰岛素0.005
***素E10.000025
人转铁蛋白0.0047
甲状腺素(T3)4.0×10-10
脂类复合物：
维生素E0.00005
胆固醇0.00005
乙醇胺0.000925
β-巯基乙醇0.000975
吐温-800.00625(密度为1.09g/ml，称量时按1g/ml计)
植物水解物：
HyPep15105
重组人血白蛋白：
ACF1
其它：
甘露醇糖1。
乳化方法:取2.5ml吐温-80至50ml无水乙醇中，充分搅拌至完全溶解，将配方量的维生素E、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和β-巯基乙醇依次加入，待每种物质完全溶解后再加入另一种物质，得到脂溶性维生素混合物。另取一烧杯中加入60ml注射用水，先打开磁力搅拌器，缓慢加入10gPF68干粉，保证加入的完全溶解后再加入少量继续搅拌至10g完全溶解。溶解过程中搅拌速度不要太快，尽量避免产生太多泡沫。PF68干粉全部加完后，定容至100ml，混合均匀。将配制好的脂溶性维生素混合物与PF68超声波乳化，冻干后按所配干粉的比例加入。
将上述组分制备粉剂培养基：将所有材料(脂溶性材料乳化后冻干)混合后磨细即得。使用时按常规方法用注射用水溶解，加NaHCO32200mg/L，定容至1L，用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2过滤除菌后即可使用。
将上述组分制备液体培养基：将上述所有材料依次溶解，脂溶性材料乳化后不需要冻干可直接使用，最后加入NaHCO32200mg/L，定容至1L，用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2过滤除菌后即可使用。
应用本实施例的培养基悬浮培养MDCK细胞，不需要加入血清，细胞接种密度为：3.0×105/ml，培养温度：37℃，转速：120rpm。结果参见图9，培养到20代的细胞图。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：
培养基配方中，重组人血白蛋白ACF的浓度为0.5g/L。
其余部分均与实施例1相同。
应用本实施例的培养基悬浮培养MDCK细胞，不需要加入血清，细胞接种密度为：3.0×105/ml，培养温度：37℃，转速：120rpm。结果参见图10，培养72h的细胞图。
实施例3
本发明的用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基是在含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基的基础上加入以下组分(单位为g/L)配制得到的：
微量元素：
亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000001
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.00005
氢化可的松0.000012
重组全链胰岛素0.001
***素E10.00001
人转铁蛋白0.002
甲状腺素(T3)1.0×10-10
脂类复合物：
维生素E0.0001
胆固醇0.0001
乙醇胺0.001
β-巯基乙醇0.001
吐温-800.01(密度为1.09g/ml，称量时按1g/ml计)
植物水解物：
HyPep15101
重组人血白蛋白：
ACF0.5
其它：
甘露醇糖5。
本实施例中培养基的制备方法与实施例1相同。
实施例4
本发明的用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基是在含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基的基础上加入以下组分(单位为g/L)配制得到的：
微量元素：
亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.00001
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0005
氢化可的松0.00006
重组全链胰岛素0.01
***素E10.00005
人转铁蛋白0.008
甲状腺素(T3)5.0×10-10
脂类复合物：
维生素E0.00001
胆固醇0.00001
乙醇胺0.0005
β-巯基乙醇0.0005
吐温-800.005(密度为1.09g/ml，称量时按1g/ml计)
植物水解物：
HyPep151010
重组人血白蛋白：
ACF5
其它：
甘露醇糖0.5。
本实施例中培养基的制备方法与实施例1相同。
实施例5
本发明的用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基是在含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基的基础上加入以下组分(单位为g/L)配制得到的：
微量元素：
亚锡酸钠(Na2SeO3-5H2O)0.000003
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.0002
氢化可的松0.00003
重组全链胰岛素0.006
***素E10.00002
人转铁蛋白0.006
甲状腺素(T3)3.0×10-10
脂类复合物：
维生素E0.00007
胆固醇0.00006
乙醇胺0.0008
β-巯基乙醇0.0009
吐温-800.007(密度为1.09g/ml，称量时按1g/ml计)
植物水解物：
HyPep15103
重组人血白蛋白：
ACF2
其它：
甘露醇糖3。
本实施例中培养基的制备方法与实施例1相同。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于全悬浮培养MDCK细胞的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：亚锡酸钠；重组人表皮细胞生长因子(EGF)；氢化可的松；重组全链胰岛素；***素(E1)；人转铁蛋白；甲状腺素(T3)；维生素E；胆固醇；乙醇胺；β-巯基乙醇；吐温-80；HyPep1510；重组人血白蛋白ACF；甘露醇糖。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：
微量元素：
亚锡酸钠0.000001-0.00001g/L
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子(EGF)0.00005-0.0005g/L
氢化可的松0.000012-0.00006g/L
重组全链胰岛素0.001-0.01g/L
***素(E1)0.00001-0.00005g/L
人转铁蛋白0.002-0.008g/L
甲状腺素(T3)1-5×10-10g/L
脂类复合物：
维生素E0.00001-0.0001g/L
胆固醇0.00001-0.0001g/L
乙醇胺0.0005-0.001g/L
β-巯基乙醇0.0005-0.001g/L
吐温-800.005-0.01g/L
植物水解物：
HyPep15101-10g/L
重组人血白蛋白：
ACF0.5-5g/L
其它：
甘露醇糖0.5-5g/L。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述培养基由含NaCl为5g/L的DMEM/F12培养基和以下组分组成：
微量元素：
亚锡酸钠0.000005g/L
生长因子：
重组人表皮细胞生长因子（EGF）0.0001g/L
氢化可的松0.000036g/L
重组全链胰岛素0.005g/L
***素E10.000025g/L
人转铁蛋白0.0047g/L
甲状腺素(T3)4.0×10-10g/L
脂类复合物：
维生素E0.00005g/L
胆固醇0.00005g/L
乙醇胺0.000925g/L
β-巯基乙醇0.000975g/L
吐温-800.00625g/L
植物水解物：
HyPep15105g/L
重组人血白蛋白：
ACF0.5-1g/L
其它：
甘露醇糖1g/L。
4.根据权利要求2或3所述的培养基，其特征在于：所述重组人血白蛋白ACF的浓度为0.5g/L或1g/L。
5.权利要求1-4任一所述的培养基的制备方法，其特征在于：是将脂溶性原料乳化冻干后与其它原料混合，磨细即得。
6.权利要求1-4任一所述的培养基的制备方法，其特征在于：将脂溶性原料乳化后（不需要冻干）与其它原料依次溶解于注射用水，然后每升加入2200mgNaHCO3，定容，最后用1N氢氧化钠或1N盐酸调pH值至7.1-7.2，过滤除菌即得。
7.权利要求1-4任一所述的培养基在无血清全悬浮培养MDCK细胞中的应用。
8.应用权利要求1-4任一所述的培养基全悬浮培养MDCK细胞的方法，其特征在于：在权利要求1-4任一所述的培养基中直接接种MDCK细胞，不添加血清，在37℃，120rpm的转速下摇床培养。
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