CN105531591A - 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法 - Google Patents

数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105531591A
CN105531591A CN201480049865.5A CN201480049865A CN105531591A CN 105531591 A CN105531591 A CN 105531591A CN 201480049865 A CN201480049865 A CN 201480049865A CN 105531591 A CN105531591 A CN 105531591A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluid sample
sample
fluid
hole
layer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480049865.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105531591B (zh
Inventor
卢克·P·李
尔谢·叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of California
Original Assignee
University of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of California filed Critical University of California
Priority to CN201810763481.XA priority Critical patent/CN109136062A/zh
Publication of CN105531591A publication Critical patent/CN105531591A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105531591B publication Critical patent/CN105531591B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0684—Venting, avoiding backpressure, avoid gas bubbles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0883—Serpentine channels
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0887—Laminated structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0481—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure squeezing of channels or chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明展示了一种用于分离、数字化和分析流体样品的数字分离(DS)芯片。所述DS芯片包括制备和区室化所述流体样品以进行分析的流体层。邻近孔的峭壁结构撇取所述流体样品，并且防止可干扰流体样品分析的颗粒进入所述孔。撇取后的流体样品分析在所述孔中进行，并且可收集终点数据，且将所述数据用于非常快地确定所述流体样品中所需组分的初始浓度。使用所述的设备和方法，可制备、数字化、区室化、测定流体样品，并在大约30分钟内收集所述终点数据。可易于改造所述设备和方法，以提供样品的平行处理。

Description

数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2013年8月9日的美国临时专利申请序列号61/864,346的优先权和权益，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。
关于联邦资助研究或开发的声明
不适用
计算机程序附录以引用方式并入
不适用
背景技术
1、技术领域
本发明整体涉及一步法样品制备和分析，更具体地讲涉及悬浮液分离、多重区室化以及分离溶液中组分的数字扩增和/或检测的整合，其中可使用脱气驱动流使该***自动化。
2、背景探讨
实时PCR目前是用于定量检测体液样品中的核酸(NA)的标准方法。生物体(通常是血液)中的病毒载量或病毒数量是指示抗病毒疗法的有效性和疾病累进的最重要标记之一。美国食品药品监督管理局(USFoodandDrugAdministration)批准的常规HIV病毒载量监测试验使用实时聚合酶链式反应(实时PCR)测定法。该方法通常涉及昂贵的设备(例如实时热循环仪)，2-3小时的测定时间，需要受过训练的技术人员的多个人工步骤并且需要制备样品以移除污染物。例如，在标准实时PCR测定中，样品(例如血液)需要纯化，因为由于血红蛋白和IgG的螯合性质会破坏Fe3+浓度，它们可抑制聚合酶活性。
由于血液细胞的不透明性会阻碍光学检测路径，从而可妨碍诊断测定，因此血浆分离是血液类蛋白和其他样品组分诊断的共同步骤。从裂解的红细胞释放的血红蛋白可通过螯合离子抑制其他酶反应，因此在进行几乎所有测定之前希望移除血细胞。
样品纯化可通过酚/氯仿提取或硅胶离心柱进行。标准血浆分离技术通过离心进行，这需要电源和庞大的设备。膜过滤和机械过滤方法也是流行的，然而，它们通常会阻塞或导致溶血作用。其他利用水动抬升力、Zweifach-Fung效应或惯性力的方法需要外部泵来精确控制流量。使用外部场例如声学、电渗流和磁力的主动分离已得到利用。然而，这些分离还需要外部电源，具有高度复杂的芯片设计，并且需要外部设备。
还存在沉淀方法，例如错流过滤、滤塞中的沉淀以及重力引起的分层。由于对红细胞的低剪切应力，这些沉淀***的主要优点是显著减少溶血作用。然而，在所有讨论的纯化或分离方法中，尚待实现这些技术与样品区室化的结合，以实现快速的一步法数字流体样品分析。
可使用其他NA测定法，例如转录介导扩增或分支DNA测试，但受到与实时PCR相同的限制，即需要多个样品制备步骤，大约3-6小时的测定时间和受过高强度训练的技术人员。此外，这些技术均需要中心实验室的测试，因此必须传送样品，这可导致样品降解。中心化还限制了遥远的、资源匮乏的地点的使用机会。
还开发了较新的基于ELISA(酶联免疫吸附测定)的技术。虽然它们可降低测试成本(大约5-23美元)并且是更简单的、可执行的测定法，但仍然是耗时的，需要大量的人工处理时间(6-72小时)。最新的侧流试纸条已证实可检测NA。然而，仍然需要多个人工步骤，并且这些测定法通常提供定性而非定量NA检测。
希望将快速样品制备和定量测定终点结果输出结合到同一诊断芯片中，以简化、降低成本并缩短流体样品分析所需的步骤。
发明内容
本发明展示了提供低成本、便携式技术的设备和方法，该技术将样品流体分离(纯化)和数字定量样品分析结果输出结合到一个流体设计中。根据本发明所公开的技术的一个方面，可处理全血样品，以在大约30分钟内进行NA定量(如HIV病毒载量)。
在一个步骤中，数字分离(DS)芯片可自动分离样品悬浮液，将样品溶液分配到超过200个孔中并且使样品区室化，以使数字等温NA扩增(如重组酶聚合酶扩增(RPA))在10分钟内自动进行，而无需外部电源。应当认识到，DS芯片也可用于除等温NA扩增之外的测定法，例如定量蛋白质分析、免疫测定法等。
根据本发明所公开的技术的一个方面，脱气驱动流可用于将流体样品移动和分配通过DS芯片，因此不需要外部电源或泵。该***可以是完全便携式的。另外，该***可在不存在用于NA、蛋白质、抗体等数字检测的区室化的油相的情况下工作。跟随后退弯液面的空气塞可使孔自动区室化。
根据本发明所公开的技术的另一个方面，将样品制备(悬浮液分离)和数字样品分析结果输出(样品区室化)整合为具有数字分离设计的一个步骤。
根据本发明所公开的技术的另一个方面，DS芯片中的峭壁结构可使体积大小在样品区室化期间保持一致，并且可确保NA扩增最小、来自颗粒(如红细胞)的荧光干扰最小等。例如，据显示，>95％的血细胞可通过峭壁结构移除。
根据本发明所公开的技术的另一个方面，数字分离无溶血作用或阻塞。这是基于膜过滤的方法的常见问题。这是重要的，因为例如来自裂解红细胞的血红蛋白可显著阻碍NA测定。
根据本发明所公开的技术的又一个方面，可在约10分钟内分离极大量的孔(10-1500个孔，30-100nl/孔)。50和100μl之间的流体样品可在10分钟内处理完，得到每孔20-50μl的数字化样品。可通过按比例缩放孔的数量或大小来轻松地调整分离样品的体积。此外，这可以是高通量***。由于仅采集终点读数，很多装置与实时PCR相反可以平行运行，而实时PCR则顺次运行样品，因为需要实时数据点。
根据本发明所公开的技术的又一个方面，总测定时间可少于40分钟，只需要最少的人工操作(加载样品、等温热温育和终点读数)。
根据本发明所公开的技术的又一个方面，DS芯片可作为等温NA扩增的平台，动态范围为103-106个拷贝/ml。仅通过改变孔大小来控制数字化即可定制动态范围。该平台技术可采用其他类型的NA测定法(等温、PCR等)，从而提供独特的无源惯性分离和数字NA测定的组合。
根据本发明所公开的技术的又一个方面，DS芯片的使用成本可以较低，因为分析样品仅需要非常简单的光学器件。终点数字结果输出可通过标准荧光显微镜或具有滤光器的智能手机进行。无需实时成像***。
根据本发明所公开的技术的又一个方面，辅助脱气室可整合进DS芯片，以提高样品加载速率至少于10分钟。DS芯片的另一个实施例可整合拇指泵microSIP技术，在这种技术中，脱气驱动流可能是不可行的。
根据本发明所公开的技术的又一个方面，当DS芯片储存于真空食品包装中时，可具有至少一年的寿命。在真空条件下储存稳定了冻干试剂，并避免其氧化，并且脱气驱动加载仍保持完整功能。
根据本发明所公开的技术的另一个方面，DS芯片可设计为无出口的一次性芯片，因此可将生物危害性污染风险减至最小。
该技术的另外方面将在本说明书的以下部分阐明，其中详细说明的目的是完全公开该技术的优选实施例，而非对其进行限制。
附图说明
参考以下附图将更全面地理解本文所述的技术，这些附图仅仅是为了进行示意性的说明：
图1A是数字分离(DS)芯片的两层设计实施例的示意图。
图1B是根据本公开实施例的峭壁结构的放大视图。
图2A、图2B和图2C是流经DS芯片的样品流体的透视图的示意图。
图3A、图3B和图3C是图2A、图2B和图2C中示出的示意图的顶视图。
图4是根据本公开实施例的具有拇指泵的DS芯片的示意图。
图5A至图5F是根据本公开实施例的DS芯片中数字血浆分离的延时图像。
图6A至图6D是流经通道并跨过峭壁结构的血液样品的延时图像。
图6E是流过峭壁结构的血液的示意图。
图7是坐标图，其示出了血浆分离在两分钟内开始，并且通过改变峭壁结构和孔的脱气表面积可调整分离的血浆体积和速度。
图8是示出血浆分离效率的坐标图。
图9A和图9B分别示出了有和无峭壁结构的血液样品区室化图像。
图10是采用芯片上RPA进行不同模板浓度的数字扩增的结果的坐标图。
图11A和图11B是坐标图，其示出了RPA反应需要血浆分离和稀释的方式。
图12是根据本公开的一个实施例的设置在加热包上的DS芯片的示意图。
图13是示意图，其示出了在乙酸钠加热包上加热DS芯片期间进行温度测定。
图14是坐标图，其示出了在DS芯片加热期间随时间推移的温度测定值。
图15是全血检测测定中一步法30分钟HIVNA测定的随时间推移的荧光坐标图。
图16A是0分钟时DS芯片上的荧光图像，图16B是30分钟时DS芯片上的荧光图像，而图16C是60分钟时DS芯片上的荧光图像。
图17是MRSAMecA基因DNA检测的坐标图，该DNA以106个拷贝/ml加入全血并与RPA试剂混合。
图18A、图18B和图18C是立体镜分别在t＝0分钟、t＝20分钟和t＝50分钟采集的荧光图像(FAM信道)。
图19是与DS芯片一起使用的方法实施例的功能流程图。
图20是示意图，其汇总了本发明所公开的方法的实施例中的动作。
图21A和图21B是脱气驱动流加载样品的放大示意图。
具体实施方式
本发明所公开的技术使得可以绕过昂贵的多步骤样品分析测定，并且提供用于定量样品分析的低成本、护理现场即用溶液。例如，数字分离(DS)技术可用于检测全血中的HIV病毒载量。可在约40分钟内直接从全血样品进行HIV-1RNA检测。由于只需要终点结果输出，荧光显微镜或具有简单滤光器的智能手机即可用于检测。由于实时监测不是必需的而可平行运行多个测定，因此通量也很高。该一次性***可以是完全无源的，并且不需要外部电源或泵。与例如目前的实时PCR***相比，在所需步骤、测定时间和成本方面具有显著的改善。
本发明所公开的设备和方法提供了在单个步骤中的平行流体样品制备和定量样品分析，该步骤设计为快速、低成本、便携式和易用的。为了能够进行一步法定量样品分析，可将以下两个样品制备功能整合到流体芯片上：悬浮液分离和样品数字化。
悬浮液分离(如全血中血浆和血细胞的分离)对于蛋白质检测和核酸测定均必不可少。例如，由于红细胞中血红蛋白的不透明性，可阻碍光学结果输出。血红蛋白也是熟知的NA扩增抑制剂，因为其螯合性质会破坏样品中的离子浓度并因而抑制聚合酶活性。
样品分析的样品数字化允许定量数字检测NA模板浓度、蛋白质浓度、抗体浓度、代谢物检测等。使用本发明所公开的设备和方法获得的数据与昂贵的热循环仪、酶标仪或其他复杂的读数器所能提供的数据相当。然而，本发明所公开的设备和方法的构建和进行仅花费几美元。
可与DS芯片整合的一个示例测定是数字核酸检测。数字核酸检测的工作原理是将模板浓度稀释得足够低，以使得每个孔具有几个或零个NA拷贝，然后进行扩增步骤。通过读取终点结果，可对发荧光的阳性孔进行计数，从而得到模板浓度数据，而无需实时NA扩增方法所用的Ct值。简单的荧光和终点阳性孔计数可通过具有滤光器的智能手机进行。
现在参见图1A，其展示了数字分离(DS)芯片100的实施例的示意图。在该实施例中，示出了简单的两层芯片设计，这种设计旨在通过热弹性体透气材料例如PDMS的注塑而简单地大规模制造。芯片的制造简单直接，且可用于规模可调的生产；可使用简单的两层模具(具有30-400μm的特征尺寸)进行注塑/热压印。DS芯片100优选地具有顶部覆盖层124和底部流体层102。DS芯片100的底部流体层102包括接纳样品的样品入口104。一旦将样品加载到芯片上后，样品即流经旁边排着孔108的通道106。在该例子中，使用者可简单地将样品滴到芯片上，而样品流利用脱气驱动流自动开始。脱气驱动流可在电力获取不可行的情况下使用。脱气驱动流利用透气材料例如PDMS的固有高孔隙度和气溶性通过从材料(PDMS)移除气体分子并引发气流而工作。虽然在该实施例中，流体流不需要外部电源，但应当理解的是在其他实施例中，外部电源可用于在芯片内移动流体。
在该实施例中，孔108与通道106垂直。与通道106垂直并且与孔108相邻的峭壁结构110(参见图1B)可用于在样品为悬浮液(如全血)的情况下将溶液与颗粒分离。悬浮液撇取机制基于重力引起的沉淀。通道106可以按蛇形形状构造在芯片上，并且可连接至侧面撇取峭壁结构的阵列，从而允许在约10分钟内分离大量的悬浮液阵列(＞200个)。
现在转到图1B，其示出了峭壁结构110的实施例的特写透视图。随着样品流经通道，悬浮液中的颗粒112(如血细胞)落入通道106的底部，而不能在峭壁结构110上移动。溶液部分能够在峭壁结构110上流动并进入孔108。箭头示出了脱气流体流的方向。
图2A、图2B和图2C示出了流经DS芯片的样品流体的特写侧视图的示意图200。图2A示出了样品202开始通过脱气驱动流流经填充的通道204并进入孔206。箭头标明流体流动的方向，并显示溶液移动进入孔206，而大部分颗粒208由于沉淀作用留在通道的底部。颗粒208不能在峭壁结构210上移动，从而纯化了样品。空通道212脱气气流显示为在样品流体之前。如图2B和图2C所示，一旦将溶液加载到孔中后，溶液即可被空气塞214区室化。因此，溶液可密封在孔中，无需油相。在一个步骤中，可纯化并数字化样品，为NA扩增准备就绪。
图3A、图3B和图3C是图2A、图2B和图2C中示出的示意图的顶视图300。
NA扩增可通过将样品与NA扩增试剂预混而实现，其中扩增引发试剂可在添加样品前铺设在孔的表面上。当样品加上NA扩增试剂流入孔中并接触最终试剂时，引发NA扩增。
蛋白质分析可通过在孔中运行夹心ELISA来实现。捕获抗体/适配子可预印在孔区域中，而流体样品可在加载到样品入口中之前与一抗和二抗混合。微峭壁结构可分离血细胞，同时保留蛋白质生物标记。一旦抗原蛋白质被预印的抗体/适配子捕获在孔中后，信号即可通过荧光探针或标准化学发光或变色反应(如辣根过氧化物酶氧化反应)放大，并采集终点结果输出。
也可实现流体样品中多种其他组分的分析，包括但不限于：抗体、氨基酸、肽、糖和脂肪。
回到图1A，DS芯片100也可配有单个大孔116(例如在微流体芯片中＞65μl)，以用于基于沟槽的悬浮液分离，以及低浓度样品(例如，就NA检测而言102-104个拷贝/ml)的定性结果输出。另外，可将脱气近侧管线118添加到芯片以用于真空加载。也可添加辅助脱气近侧管线120，以帮助提高流体加载的速度。DS芯片也可包括大型真空电容器室122，以保持至少一小时的真空抽吸。流体层102可被材料的空白层124覆盖，该材料可以是透气材料以增强脱气加载。
结合所附实例可更好地理解本发明所公开的技术，这些实例仅仅旨在进行举例说明，不应理解为在任何意义上限制所附权利要求书限定的本发明所公开的技术的范围。
实例1
作为基于血液的疾病NA检测的例子，以血液中HIV病毒载量定量作为示例。为展示数字NA扩增，使用重组酶聚合酶扩增(RPA)，它是一种约40℃等温NA扩增技术。使用可重复使用的即用型加热包在40℃下温育30分钟，实现了加标血液样品的HIV-1RNA芯片检测。定量数字核酸(NA)检测动态范围为103-106个拷贝/ml。
选择RPA是由于仅需相对低的温育温度。与使用将样品加热至高达95℃的PCR相比，低温育温度大大减小了生成气泡的风险。RPA也是迄今可商购获得的最快的等温扩增方法。当用于血浆样品时，该性质加上其稳健性使其成为与DS芯片整合的理想NA扩增技术。然而，应当认识到，DS芯片设计为与其他等温技术(如依赖于解旋酶的扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)以及信号介导的RNA扩增技术(SMART))以及其他NA测定法、蛋白质检测测定法、免疫测定法等兼容。使用RPA，样品制备、样品数字化(区室化)和NA扩增均得以整合，而无需油相。
在该示例中，将芯片峭壁结构用于撇取与RPA试剂混合的血液样品中血浆的顶部部分。所有样品加载均由脱气驱动流致动；因此不需要外部泵。据观察，DS芯片可储存在真空食品铝包装中(范德斯塔尔科学公司(VanDerStahlScientific)，V402)，并完全发挥功能达至少一年。还观察到，RPA试剂诱导了血细胞凝结，随着沉淀速度的加快，其增强了分离效果。然而，未观察到阻塞和裂解。主蛇形加载通道连接至侧面撇取结构的阵列，从而允许在约10分钟内撇取大量血浆阵列(＞200个)。还证实，DS芯片可与拇指泵microSIP流整合，如图4所示。在该实施例400中，不需要初始脱气，使用者仅需使用拇指按钮402即可致动流体流。
撇取通道被构造为40μm深，主加载通道被构造为300μm深。当血液样品完成加载时自动发生数字化。空气塞通过，以使每个孔区室化。使用铺设在孔内的MgOAc引发每个孔中的RPA反应。可重复使用的商业乙酸钠即用型加热包提供在约40℃长达一小时的加热，以进行等温扩增。使用显微镜(Axiozoom，蔡司公司(Zeiss))采集终点荧光图像。根据泊松统计，通过计算发荧光孔的百分比反算初始模板浓度。
所有HIVRNA检测实验均使用RPART-exo试剂盒(英国Twistdx公司(Twistdx,UK))进行。将10μl人全血(HMWBACD，生物再生公司(Bioreclaimation))与RPA混合物(10μl引物/探针混合物、40μl再水合缓冲液、2μl10％BSA、8μlRNAsin和10μl加标HIVRNA)混合。将100μl血液/RPA混合物添加至每个芯片中，并在40℃下温育。用Axiozoom宏观镜(蔡司公司(Zeiss))采集终点荧光图像(FAM信道)。HIVRNA是HIV-1B亚型(Seracare公司(Seracare)，500405)。HIV特异性引物和探针由Twistdx公司(Twistdx)合作方提供。RNAsin购自普洛麦格公司(Promega)(N2611)。
芯片的流体层使用标准软光刻技术在PDMS中制造。该平台可易于与基于其他软光刻技术的微流体技术整合。由于该构造基于标准硅(PDMS)模制，其他部件例如CD4+T细胞计数、蛋白质检测、光学元件、搅拌器、稀释器、阀门、二极管、电极可易于整合，因为制造工艺是高度相似的。
流体层被另一个空白的PDMS基板覆盖，以增强脱气加载。在芯片的顶部和底部上，将盖玻片用于提供空气扩散的屏障，这延长了脱气加载并且还提供机械稳定性。由于芯片的构造简单，可容易地用于注塑/热压印，以扩大生产规模。引发RPA反应的试剂MgOAc通过脱气干燥而铺设在芯片上。该芯片设计为具有200个孔，每个孔具有300μm的高度和650μm的直径，从而得到100nl的总体积。其设计为得到检测103-106个拷贝/ml的动态范围，对应于临床样品中HIVRNA的临床浓度。虽然超过106个拷贝/ml***会饱和，但其仍提供病毒载量极高和患者处于非常严重的疾病状态的明确指示。可检测约102个拷贝/ml的极低RNA拷贝样品的大型单个室(例如，80μl)也包括在该示例性实施例(参见图1A)中，以用于是/非定性测定。这可以是有益的特征，因为它使芯片能够捕捉尚未具有高病毒滴度的患者的早期感染。仅通过修改孔大小和数量即可进一步调整动态范围。
现在参见图5A至图5F，其按顺序示出了数字血浆分离的延时图像500。在该实例中，人全血502与RPA试剂混合，并加载到DS芯片100上(参见图1A)。血浆504在一个步骤中通过空气塞506撇入两百个孔中并区室化。可观察到作为黑色碎片的红细胞508。箭头标明流动方向。
图6A至图6D是血液样品602流经通道604，跨过峭壁结构606(参见图6E)并进入另一个小间隙峭壁结构608的特写延时图像600。箭头610表示流动方向。图6A示出了t＝0秒时血液样品602加载到通道604中。在该实施例中，如图6E的特写示意图所示，还包括了辅助微沟槽612，其有助于提高血浆614和血细胞616的分离速度。然而，峭壁结构606可起到独立地分离样品的作用。
图6B示出了t＝35秒时血液样品602已进入辅助微沟槽612。在t＝85秒时，如图6C所示，血浆614和血细胞616开始分离。在图6D中，血浆614进入孔(未示出)，而血细胞616则保留在孔的外部。撇取后的血浆可使得RPA荧光结果输出能被检出。
图7示出了血浆分离时间的坐标图。其示出了分离在两分钟内开始，并且仅通过改变侧面峭壁结构和孔的脱气表面积即可调整分离的血浆体积和速度。图8是示出血浆分离效率的坐标图。当流速低于2×103μm/s的阈值时，血浆分离效率＞98％。只要流量不超过最大阈值，血浆撇取仍保持稳定。
据证实，峭壁结构有助于保持分离体积的一致性并移除可干扰NA扩增和荧光结果输出的红细胞。图9A和图9B分别示出了有和无峭壁结构的血液样品区室化图像900。图9A示出了峭壁结构902如何帮助血浆分离，并使体积加载保持一致。图9B示出了无峭壁结构时，红细胞904聚集体迁移至孔906中，这可干扰荧光结果输出。加载的液体体积也不一致。每个孔的直径为650μm。将人全血与RPA试剂混合，然后加载到DS芯片中。
大多数孔(10-1500个孔，30-100nl/孔)在约10分钟内分离。50-100μl血液样品可在10分钟内处理完，得到20-50μl的数字化血浆区室。分离血浆的体积可易于通过调节孔的数量和大小来调整。
图10示出了采用芯片上RPA进行不同模板浓度的数字扩增的结果。达到了约103个拷贝/ml的检测限和103-106个拷贝/ml的动态范围。此处，将阳性对照MRSADNA在水中稀释，在一个步骤中加载到DS芯片上并数字化。线条示出了根据泊松统计的理论预测结果，圆点表示实验数据，n＝4。
图11A和图11B示出了RPA反应需要血浆分离和稀释的方式。新型耐血浆聚合酶(如赛默飞世尔科技(ThermoScientific)-Phusion)显示出直接从40％全血扩增；然而，只能进行终点凝胶电泳测定，因为需要移除不透明的红细胞，以使得它们不会妨碍光学荧光结果输出。等温测定法例如RPA显示出在高达20％的血浆中扩增。利用新型耐血浆测定法，可直接从血浆样品扩增，但仍需要移除红细胞，以得到清晰的光学检测结果。因此，开发了用于快速NA检测的血浆分离方法。对于该测定法，使用不同稀释度的血浆(如图11A所示)和全血(如图11B所示)进行芯片外RPA。结果表明，RPA可在高达20％(总反应体积)的血浆中发挥作用，并且检测可在10分钟内完成(100个拷贝/ml)。RPA在全血中不产生信号。结论是，与LAMP和PCR相比，RPA是更稳健的下游NA测定法，而LAMP和PCR在约1％血浆/血液时失效。此结果指导了样品制备模块的设计，使其适于血浆分离。阳性对照为纯水中的DNA模板。
对于顶部和底部PDMS层，芯片的厚度优化为2.9mm，因此即用型乙酸钠加热包可提供长达一小时的约40℃的即时加热。图12是置于加热包1204上的DS芯片1202的示意图1200。使用商业可重复使用的即用型加热包(Hotsnapz)。此乙酸钠加热包可在浸入沸水中后重复使用，且成本低于2美元。图13示出了在PDMS层之间进行温度测定的示意图。
图14是坐标图，其示出了在NA扩增的DS芯片加热期间随时间推移的温度测定值，其中n＝3。仅将DS芯片置于加热包上20-60分钟即可运行数字扩增反应，如图12所示。该方法显示出与各种等温NA扩增技术兼容，例如NASBA、SMART、SDA、BAD和AMP。应当指出的是，NA扩增可在室温下进行，但需要更长的时间来完成。
图15至图16C示出了一步法进行样品加载、血浆分离、样品数字化以及HIVRNA模板的RPA检测的能力(结果)，该一步法以106个拷贝/ml在30分钟内在40℃下使用HIV基因组RNA加标全血进行。图15是示出随时间推移的荧光的坐标图。图16A是0分钟时DS芯片上的荧光图像，图16B是30分钟时DS芯片上的荧光图像，图16C是60分钟时DS芯片上的荧光图像。这些结果显示可在不存在热循环仪的情况下在30分钟内进行定量终点NA测定。由于只需要终点荧光图像，可使用简单的滤光器和智能手机获得图像。使用智能手机来进行采用DS芯片的HIV病毒载量测定可提供低成本的基于核酸的定量远程医疗。
这些结果表明，可在一个步骤中在不到40分钟内使用DS芯片从全血进行芯片上HIVRNA检测。与目前可商购获得的定量NA测试***(如离心柱+RT-PCR)相比，该检测快得多，所需的人工操作也更少。
实例2
该测定的进行旨在展示，数字分离可将样品制备与使用RPA的数字等温扩增整合，以在30分钟内直接从人全血样品检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)DNA。
通过使用图1B中所述的峭壁结构，该实例也可使用血细胞沉淀法将血浆撇入孔中。通过分离红细胞，可减少荧光信号的光学阻碍，并减少由于血红蛋白抑制造成的聚合酶的酶干扰。由于对红细胞产生的剪切应力非常小，溶血作用也很小。由于不存在将导致血细胞逆流堆积的特征，DS芯片设计还避免了血细胞阻塞。DS使得数字NA扩增测定(如RPA)能够直接从分离的血浆或其他样品进行。在该实例中，峭壁结构和孔排成阵列，以使得可平行处理大量(200-1500个)的孔。这些样品还通过空气塞自动区室化，并且流体流通过脱气驱动流运行。将RPA反应用于每个孔，以启动数字NA扩增。
微流体芯片使用标准软光刻工艺制造。将PDMS浇铸到SU8图案化晶片上。血液和RPA试剂在加载前混合。每次加载100μl与RPA试剂(RPAexo试剂盒，Twistdx公司(Twistdx))混合的血液样品。RPA混合物的部分组分冻干在孔中。在加载样品之前将DS芯片储存在真空(-70kPa)中过夜。样品可密封在真空袋中，并可仍然保持完全功能达至少一年。在样品加载和区室化后，将芯片置于37℃培养箱中进行RPA温育。在温育后，通过荧光显微镜(蔡司公司(Zeiss)，Axiozoom)检测荧光信号。
当流入孔的流速小于100μm/s时，血浆分离效率＞99％。一步法血浆分离和样品区室化可在约10分钟内完成。约200-1500孔的血浆(30-100nl/孔)可从与RPA试剂混合的全血(100μl)分离。使用者可将血液/RPA混合物滴到芯片上，血浆分离和数字化将开始。在该实例中，脱气加载稳定达30分钟，并且在30分钟内使用一步法RPA(利用DS法)检测全血中添加的MRSADNA。DS芯片中未观察到溶血作用或阻塞。图17示出了MRSAMecA基因DNA检测的坐标图，该DNA以106个拷贝/ml加入全血并与RPA试剂混合。图18A、图18B和图18C示出了立体镜(蔡司公司(Zeiss)，Axiozoom)分别在t＝0分钟、t＝20分钟和t＝50分钟采集的荧光图像(FAM信道)。使用RPARTExo试剂盒，并且n＝5。
一步数字血浆分离方法和设备可用于在不到30分钟内检测全血中的细菌核酸。与目前昂贵的商业***相比具有显著的改善，商业化***则需要数小时的测定时间，需要受过训练的技术人员，并且涉及中心实验室的昂贵设备。便携式DS芯片技术可提供新的、低成本、护理现场即用型、基于血液的、定量NA测定法，该方法可在资源匮乏的环境(例如非洲)中使用。
图19提供了简单DS和流体样品分析方法的一般实施例的汇总流程图1900。该方法可用于检测流体样品中的组分，包括但不限于：核酸、蛋白质、抗体、氨基酸、肽、糖和脂肪。在第一方框1910中，流体样品可在流体样品加载到DS芯片上之前与测定试剂混合。
在另选的实施例中，测定试剂也可在样品加载之前铺设到芯片上。在又一个实施例中，一些测定试剂可在加载到芯片上之前与流体样品混合，一些测定试剂可铺设到芯片上。例如，在实例1中，使用RPA，并且除MgOAc之外的所有试剂在加载到芯片上之前与流体样品混合，而MgOAc则铺设到芯片上，以在接触样品/试剂混合物时引发NA扩增。
在第二方框1920中，使用者将流体样品在样品入口中滴到芯片上。在下一个方框1930中，样品悬浮液流经芯片，并且峭壁结构分离样品悬浮液，以将溶液从可干扰NA扩增、荧光读数等的颗粒中纯化。空气塞一旦处于DS芯片的孔中，即可用于区室化撇取后的流体样品。样品经过芯片的自动移动可由脱气驱动流致动。然而，如有需要，芯片可包括拇指泵，以用于人工移动样品经过DS芯片，或可使用电动泵等。
下一个方框1940可包括加热步骤(如有需要)，以加速测定反应。在下一个方框1950中，使用者可使用显微镜或甚至配有简单滤光器的智能手机读取荧光读数，以对阳性孔计数。根据该终点读数，初始样品中的组分可在最后一个方框1960中定量。
图20是示意图2000，其汇总了本发明所公开的方法的实施例。在第一面板2002中，将样品置于DS芯片上。在第二面板2004中，将DS芯片置于商业即用型加热包的顶部，以加速NA扩增反应。在第三面板2006中，将智能手机2008用于采集终点荧光结果输出。图21A和图21B示出了脱气驱动流加载样品2102的示意性放大顶部透视图2100。实线箭头表示样品的方向，虚线箭头表示跟随数字化样品2104区室化的空气塞。
本发明所公开的技术的潜在应用可包括但不限于：(1)尿液分析物检测(如，用于性传播疾病)，(2)血液样品中其他病毒物种的NA滴度定量(如，乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性出血热)，(3)血液样品中的循环DNARNA定量(如用于癌症诊断的微RNA)，(4)败血病的细菌定量(如MRSA)，(5)血液样品中的血源性寄生虫(如疟疾)检测，(6)血液样品中的一般病原体/分析物定量检测，(7)通过将不同的引物铺设到孔中一次性多重检测多种疾病，例如可同时检测HIV和疟疾的若干菌株，这可用于耐药性菌株鉴定，(8)痰液中的TB耐药性鉴定，(9)水中病原体检测，以及(10)食品和饮料质量监控。
根据本文的说明，将认识到，本公开涵盖多个实施例，它们包括但不限于：
1、一种用于分离、数字化和分析流体样品的设备，所述设备包括：(a)被构造成将流体样品分离至孔中以用于流体样品分析的流体层，所述流体层包括：(i)多个孔；(ii)接纳所述流体样品的样品入口；(iii)将所述流体样品从所述样品入口传送至一个或多个孔的至少一个通道；(iv)定位在所述通道和每个孔之间的至少一个峭壁结构，所述峭壁结构被构造成撇取所述流体样品并防止所述流体样品中的颗粒进入所述孔，其中所述孔保持撇取后的流体样品以进行分析；和(v)供流体样品流出所述通道的出口；以及(b)被构造成密封所述流体层的空白层。
2、根据任何前述实施例所述的设备，其中所述流体层和空白层中的至少一者由透气材料构成，从而允许所述流体样品在脱气驱动流下自动流动。
3、根据任何前述实施例所述的设备，其中所述流体层还包括联接到所述通道的脱气近侧管线，所述管线被构造成提高流体样品流的速度。
4、根据任何前述实施例所述的设备，其中所述流体样品使用空气塞区室化，所述空气塞跟随在所述通道中的所述流体样品之后。
5、根据任何前述实施例所述的设备，还包括拇指泵，以人工移动所述流体样品经过所述设备。
6、根据任何前述实施例所述的设备：其中所述流体层是微流体层；其中所述通道大约深300μm；其中所述峭壁结构大约深40μm；并且其中所述孔大约深300μm。
7、根据任何前述实施例所述的设备，其中所述峭壁结构还包括在所述峭壁结构内的一个或多个间隙峭壁结构，所述间隙峭壁结构被构造成有助于加速颗粒从所述流体样品中的溶液分离。
8、根据任何前述实施例所述的设备，还包括：用于检测所述流体样品的组分的荧光检测器；其中所述组分用荧光标签标记；并且其中终点荧光数据由荧光显微镜或配有滤光器的智能手机收集。
9、根据任何前述实施例所述的设备：其中撇取后的流体样品使用试剂进行分析；其中所述试剂中的一者或多者铺设在所述孔上；并且其中所述试剂中的一者或多者在将所述流体样品加载到所述样品入口中之前与所述流体样品混合。
10、根据任何前述实施例所述的设备，其中若干不同的流体样品组分在不同的孔中使用不同的试剂一次性检测。
11、根据任何前述实施例所述的设备，还包括加热器。
12、根据任何前述实施例所述的设备，其中所述流体层还包括被构造成检测少于约102个核酸拷贝/ml流体样品的室。
13、一种用于分离流体样品以进行分析的方法，所述方法包括：(a)获得流体样品；(b)将所述流体样品加载到数字分离(DS)芯片上，所述DS芯片包括：(1)被构造成将流体样品分离至孔中以用于流体样品分析的流体层，所述流体层包括：(i)多个孔；(ii)接纳所述流体样品的样品入口；(iii)将所述流体样品从所述样品入口传送至所述孔的通道；(iv)至少一个峭壁结构，其定位在所述通道和所述孔之间并被构造成撇取所述流体样品且防止所述流体样品中的颗粒进入所述孔，所述孔保持撇取后的流体样品以进行分析；和(v)供流体样品流出所述通道的出口；以及(2)被构造成密封所述流体层的空白层。
14、根据任何前述实施例所述的方法，其中所述流体层和空白层中的至少一者由透气材料构成，从而允许所述流体样品在脱气驱动流下自动流动。
15、根据任何前述实施例所述的方法，其中所述流体层还包括被构造成提高流体样品流的速度的脱气近侧管线。
16、根据任何前述实施例所述的方法，其中所述DS芯片还包括拇指泵，以人工移动流体样品经过所述设备。
17、根据任何前述实施例所述的方法：其中所述样品流体包括全血；并且其中所述峭壁结构将流入所述孔中的血浆与血细胞分离。
18、根据任何前述实施例所述的方法，还包括：通过检测所述流体样品的组分分析所述撇取后的流体样品；其中所述组分用荧光标签标记；并且其中终点荧光数据由荧光显微镜或配有滤光器的智能手机收集。
19、根据任何前述实施例所述的方法，还包括：使用试剂分析所述撇取后的流体样品；将所述试剂中的一者或多者铺设在所述孔上；以及在将所述流体样品加载到所述样品入口中之前将所述试剂中的一者或多者与所述流体样品混合。
20、根据任何前述实施例所述的方法，还包括：使用试剂分析所述撇取后的流体样品；其中所有所述试剂均铺设在所述孔上，或在加载到所述样品入口中之前与所述流体样品混合。
21、根据任何前述实施例所述的方法，其中所述撇取后的流体样品的分析包括撇取后的流体样品组分扩增和撇取后的流体样品组分检测中的一者或多者。
22、根据任何前述实施例所述的方法，其中撇取后的流体样品组分检测是定量的。
23、根据任何前述实施例所述的方法，其中若干不同的流体样品组分在不同的孔中使用不同的试剂一次性检测。
24、根据任何前述实施例所述的方法：其中所述撇取后的流体样品组分包括核酸；并且其中核酸分析包括等温扩增。
25、根据任何前述实施例所述的方法，其中所述DS芯片用化学加热包加热，以加速所述等温核酸扩增。
26、根据任何前述实施例所述的方法，其中所述DS芯片的所述流体层还包括被构造成检测少于约102个核酸拷贝/ml流体样品的室。
27、一种用于自动分离、数字化、区室化和分析流体样品的透气设备，所述设备包括：(a)被构造成将流体样品分离至孔中以用于流体样品分析的流体层，所述流体层包括：(i)多个孔；(ii)接纳所述流体样品的样品入口；(iii)将所述流体样品从所述样品入口传送至一个或多个孔的至少一个通道，其中所述流体样品的流动在脱气驱动流下自动进行；(iv)定位在所述通道和每个孔之间的至少一个峭壁结构，所述峭壁结构被构造成撇取所述流体样品并且防止所述流体样品中的颗粒进入所述孔，其中所述孔保持撇取后的流体样品以进行分析，其中所述撇取后的流体样品通过空气塞自动区室化，所述空气塞跟随在所述通道中的所述样品流体之后，其中所述区室化允许在所述孔中进行多重流体样品分析，并且其中撇取后的流体样品分析包括所述撇取后的流体样品中特定分子的检测，其中必须在检测之前扩增的分子在检测之前在所述孔中自动扩增；和(v)供流体样品流出所述通道的出口；以及(b)被构造成密封所述流体层的空白层；(c)其中所述流体层和空白层中的至少一者包含用于脱气驱动流的透气材料。
虽然本文的说明包括许多细节，但这些细节不应理解为限制本公开的范围，而只是为本发明的一些优选实施例提供举例说明。因此，将认识到，本公开的范围完全涵盖对本领域的技术人员显而易见的其他实施例。
在权利要求书中，以单数形式提及某要素除非明确规定否则并非意指“一个和仅一个”，而是指“一个或多个”。本领域的普通技术人员已知的本发明所公开的实施例的要素的所有结构、化学和功能等同形式明确地以引用方式并入本文，并且本发明的权利要求书旨在涵盖这些等同形式。此外，本公开中的要素、组分或方法步骤无意贡献给社会公众，无论这些要素、组分或方法步骤是否在权利要求书明确地叙述。本文的权利要求书所保护的要素不应理解为“装置加功能”要素，除非该要素使用短语“......的装置”明确地叙述。本文的权利要求书保护的要素不应理解为“步骤加功能”要素，除非该要素使用短语“.....的步骤”明确地叙述。

Claims (27)

1.一种用于分离、数字化和分析流体样品的设备，所述设备包括：
(a)被构造成将流体样品分离至孔中以用于流体样品分析的流体层，所述流体层包括：
(i)多个孔；
(ii)接纳所述流体样品的样品入口；
(iii)将所述流体样品从所述样品入口传送至一个或多个孔的至少一个通道；
(iv)定位在所述通道和每个孔之间的至少一个峭壁结构，所述峭壁结构被构造成撇取所述流体样品并且防止所述流体样品中的颗粒进入所述孔，其中所述孔保持撇取后的流体样品以进行分析；和
(v)供流体样品流出所述通道的出口；以及
(b)被构造成密封所述流体层的空白层。
2.根据权利要求1所述的设备，其中所述流体层和空白层中的至少一者由透气材料构成，从而允许所述流体样品在脱气驱动流下自动流动。
3.根据权利要求2所述的设备，其中所述流体层还包括联接到所述通道的脱气近侧管线，所述管线被构造成提高流体样品流的速度。
4.根据权利要求1所述的设备，其中所述流体样品使用空气塞而区室化，所述空气塞跟随在所述通道中的所述流体样品之后。
5.根据权利要求1所述的设备，还包括拇指泵，以人工移动所述流体样品经过所述设备。
6.根据权利要求1所述的设备：
其中所述流体层是微流体层；
其中所述通道大约深300μm；
其中所述峭壁结构大约深40μm；并且
其中所述孔大约深300μm。
7.根据权利要求1所述的设备，其中所述峭壁结构还包括在所述峭壁结构内的一个或多个间隙峭壁结构，所述间隙峭壁结构被构造成有助于加速颗粒从所述流体样品中的溶液分离。
8.根据权利要求1所述的设备，还包括：
用于检测所述流体样品的组分的荧光检测器；
其中所述组分用荧光标签标记；并且
其中终点荧光数据由荧光显微镜或配有滤光器的智能手机收集。
9.根据权利要求1所述的设备：
其中撇取后的流体样品使用试剂进行分析；
其中所述试剂中的一者或多者铺设在所述孔上；并且
其中所述试剂中的一者或多者在将所述流体样品加载到所述样品入口中之前与所述流体样品混合。
10.根据权利要求1所述的设备，其中若干不同的流体样品组分在不同的孔中使用不同的试剂一次性检测。
11.根据权利要求1所述的设备，还包括加热器。
12.根据权利要求1所述的设备，其中所述流体层还包括被构造成检测少于约102个核酸拷贝/ml流体样品的室。
13.一种分离流体样品以进行分析的方法，所述方法包括：
(a)获得流体样品；
(b)将所述流体样品加载到数字分离(DS)芯片上，所述DS芯片包括：
(1)被构造成将流体样品分离至孔中以用于流体样品分析的流体层，所述流体层包括：
(i)多个孔；
(ii)接纳所述流体样品的样品入口；
(iii)将所述流体样品从所述样品入口传送至所述孔的通道；
(iv)至少一个峭壁结构，所述峭壁结构定位在所述通道和所述孔之间并被构造成撇取所述流体样品且防止所述流体样品中的颗粒进入所述孔，所述孔保持撇取后的流体样品以进行分析；和
(v)供流体样品流出所述通道的出口；以及
(2)被构造成密封所述流体层的空白层。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述流体层和空白层中的至少一者由透气材料构成，从而允许所述流体样品在脱气驱动流下自动流动。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述流体层还包括被构造成提高流体样品流的速度的脱气近侧管线。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述DS芯片还包括拇指泵，以人工移动流体样品经过所述设备。
17.根据权利要求13所述的方法：
其中所述样品流体包括全血；并且
其中所述峭壁结构将流入所述孔的血浆与血细胞分离。
18.根据权利要求13所述的方法，还包括：
通过检测所述流体样品的组分来分析所述撇取后的流体样品；
其中所述组分用荧光标签标记；并且
其中终点荧光数据由荧光显微镜或配有滤光器的智能手机收集。
19.根据权利要求13所述的方法，还包括：
使用试剂分析所述撇取后的流体样品；
将所述试剂中的一者或多者铺设在所述孔上；以及
在将所述流体样品加载到所述样品入口中之前将所述试剂中的一者或多者与所述流体样品混合。
20.根据权利要求13所述的方法，还包括：
使用试剂分析所述撇取后的流体样品；
其中所有所述试剂均铺设在所述孔上，或在加载到所述样品入口中之前与所述流体样品混合。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述撇取后的流体样品的分析包括撇取后的流体样品组分扩增和撇取后的流体样品组分检测中的一者或多者。
22.根据权利要求21所述的方法，其中撇取后的流体样品组分检测是定量的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中若干不同的流体样品组分在不同的孔中使用不同的试剂一次性检测。
24.根据权利要求21所述的方法：
其中所述撇取后的流体样品组分包括核酸；并且
其中核酸分析包括等温扩增。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述DS芯片用化学加热包加热，以加速所述等温核酸扩增。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述DS芯片的所述流体层还包括被构造成检测少于约102个核酸拷贝/ml流体样品的室。
27.一种用于自动分离、数字化、区室化和分析流体样品的透气设备，所述设备包括：
(a)被构造成将流体样品分离至孔中以用于流体样品分析的流体层，所述流体层包括：
(i)多个孔；
(ii)接纳所述流体样品的样品入口；
(iii)将所述流体样品从所述样品入口传送至一个或多个孔的至少一个通道，其中所述流体样品的流动在脱气驱动流下自动进行；
(iv)定位在所述通道和每个孔之间的至少一个峭壁结构，所述峭壁结构被构造成撇取所述流体样品并且防止所述流体样品中的颗粒进入所述孔，其中所述孔保持撇取后的流体样品以进行分析，其中所述撇取后的流体样品通过空气塞而自动区室化，所述空气塞跟随在所述通道中的所述样品流体之后，其中所述区室化允许在所述孔中进行多重流体样品分析，并且其中撇取后的流体样品分析包括所述撇取后的流体样品中特定分子的检测，其中必须在检测之前扩增的分子在检测之前在所述孔中自动扩增；和
(v)供流体样品流出所述通道的出口；以及
(b)被构造成密封所述流体层的空白层；
(c)其中所述流体层和空白层中的至少一者包含用于脱气驱动流的透气材料。
CN201480049865.5A 2013-08-09 2014-08-08 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法 Active CN105531591B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810763481.XA CN109136062A (zh) 2013-08-09 2014-08-08 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361864346P 2013-08-09 2013-08-09
US61/864,346 2013-08-09
PCT/US2014/050413 WO2015021425A1 (en) 2013-08-09 2014-08-08 Digital fluid sample separation apparatus and methods for one-step quantitative sample analysis

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810763481.XA Division CN109136062A (zh) 2013-08-09 2014-08-08 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105531591A true CN105531591A (zh) 2016-04-27
CN105531591B CN105531591B (zh) 2018-08-10

Family

ID=52461968

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810763481.XA Pending CN109136062A (zh) 2013-08-09 2014-08-08 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法
CN201480049865.5A Active CN105531591B (zh) 2013-08-09 2014-08-08 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810763481.XA Pending CN109136062A (zh) 2013-08-09 2014-08-08 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10589270B2 (zh)
EP (1) EP3030908B1 (zh)
CN (2) CN109136062A (zh)
WO (1) WO2015021425A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105890927A (zh) * 2016-06-06 2016-08-24 长春小孚科技有限公司 一种尿液分析***及其尿液分析方法
CN107262170A (zh) * 2017-07-03 2017-10-20 重庆大学 一种多重数字pcr芯片及其使用方法
CN110573253A (zh) * 2017-01-13 2019-12-13 赛卢拉研究公司 流体通道的亲水涂层

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017062864A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 The Regents Of The University Of California Self-powered microfluidic chip with micro-patterned reagents
CN108474802A (zh) * 2015-12-21 2018-08-31 黄荣堂 检测装置
US11285478B2 (en) 2016-04-04 2022-03-29 Combinati Incorporated Microfluidic siphoning array for nucleic acid quantification
CA3042724A1 (en) * 2016-11-17 2018-05-24 Combinati Incorporated Methods and systems for nucleic acid analysis and quantification
CN107966332A (zh) * 2017-11-21 2018-04-27 宇星科技发展(深圳)有限公司 颗粒物检测装置及其电路
CN109806920A (zh) * 2019-01-28 2019-05-28 湘潭大学 一种用于自动定量分配、收集和检测的微流控装置及使用方法
CN110819698B (zh) * 2019-10-28 2023-04-07 中国科学院上海微***与信息技术研究所 高压液体浸入式数字pcr方法、数字pcr芯片及其制备方法
WO2021156844A1 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 National Research Council Of Canada Microfluidic device with interface pinning reaction vessels within a flow-through chamber, kit for forming, and use of same
KR20220122244A (ko) * 2021-02-26 2022-09-02 (주)바이오액츠 휴대용 등온증폭장치
KR102470360B1 (ko) * 2022-03-03 2022-11-25 정대서 혈액으로부터 혈장을 분리하는 혈장분리필터

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040129678A1 (en) * 2002-09-07 2004-07-08 Timothy Crowley Integrated apparatus and methods for treating liquids
JP2008188124A (ja) * 2007-02-01 2008-08-21 Allied Laser:Kk 血漿分離技術
CN101454664A (zh) * 2006-05-24 2009-06-10 国立大学法人京都大学 血浆分离用微流路
US20120276641A1 (en) * 2009-10-30 2012-11-01 Dublin City University Microfluidic device providing degassing driven fluid flow
CN103074203A (zh) * 2011-10-25 2013-05-01 索尼公司 用于核酸扩增反应的微芯片及其制造方法
CN103071548A (zh) * 2012-04-05 2013-05-01 浙江大学 一种无动力源无阀型单分子检测芯片及应用
US20130130232A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Self-loading microfluidic device and methods of use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6885888B2 (en) * 2000-01-20 2005-04-26 The Cleveland Clinic Foundation Electrical stimulation of the sympathetic nerve chain
WO2004048254A1 (en) 2002-11-28 2004-06-10 Postech Foundation Micropump and micro-incubator utilizing gas generation and production method thereof
US20100179069A1 (en) * 2007-07-30 2010-07-15 Gn Biosystems Incorporated Method and apparatus for conducting high-throughput micro-volume experiments
EP2365880A1 (en) 2008-12-02 2011-09-21 California Institute of Technology Self-powered microfluidic devices, methods and systems
US8496889B2 (en) * 2010-03-23 2013-07-30 California Institute Of Technology Microfluidic device for separating and sorting particles in a fluid medium
WO2017062864A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 The Regents Of The University Of California Self-powered microfluidic chip with micro-patterned reagents

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040129678A1 (en) * 2002-09-07 2004-07-08 Timothy Crowley Integrated apparatus and methods for treating liquids
CN101454664A (zh) * 2006-05-24 2009-06-10 国立大学法人京都大学 血浆分离用微流路
JP2008188124A (ja) * 2007-02-01 2008-08-21 Allied Laser:Kk 血漿分離技術
US20120276641A1 (en) * 2009-10-30 2012-11-01 Dublin City University Microfluidic device providing degassing driven fluid flow
CN103074203A (zh) * 2011-10-25 2013-05-01 索尼公司 用于核酸扩增反应的微芯片及其制造方法
US20130130232A1 (en) * 2011-11-23 2013-05-23 Wisconsin Alumni Research Foundation (Warf) Self-loading microfluidic device and methods of use
CN103071548A (zh) * 2012-04-05 2013-05-01 浙江大学 一种无动力源无阀型单分子检测芯片及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IVAN K.DIMOV.ETC: "stand-alone self-powered integrated microfluidic blood analysis system (SIMBAS)", 《LAB ON A CHIP》 *
JACK Y.HO.ETC: "rapid identification of ESKAPE bacterial strains using an autonomous microfluidic device", 《PLOS ONE》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105890927A (zh) * 2016-06-06 2016-08-24 长春小孚科技有限公司 一种尿液分析***及其尿液分析方法
WO2017210976A1 (zh) * 2016-06-06 2017-12-14 深圳小孚医疗科技有限公司 一种尿液分析***及其尿液分析方法
CN110573253A (zh) * 2017-01-13 2019-12-13 赛卢拉研究公司 流体通道的亲水涂层
CN110573253B (zh) * 2017-01-13 2021-11-02 赛卢拉研究公司 流体通道的亲水涂层
CN107262170A (zh) * 2017-07-03 2017-10-20 重庆大学 一种多重数字pcr芯片及其使用方法
CN107262170B (zh) * 2017-07-03 2019-04-09 重庆大学 一种多重数字pcr芯片及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10589270B2 (en) 2020-03-17
EP3030908B1 (en) 2019-10-23
EP3030908A1 (en) 2016-06-15
US20160228874A1 (en) 2016-08-11
WO2015021425A1 (en) 2015-02-12
EP3030908A4 (en) 2017-04-19
CN109136062A (zh) 2019-01-04
CN105531591B (zh) 2018-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105531591A (zh) 数字流体样品分离设备和用于一步定量样品分析的方法
Zhu et al. Recent advances in lab-on-a-chip technologies for viral diagnosis
Jung et al. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies
KR102502083B1 (ko) 휴대용 핵산 분석 시스템 및 고성능 미세유체 전기활성 중합체 작동기
JP6688883B2 (ja) 生物学的サンプルから生体分子を精製しおよび検査するためのデバイスのコンポーネント、デバイス、および方法
Amasia et al. Large-volume centrifugal microfluidic device for blood plasma separation
AU2009222181B2 (en) Barriers for facilitating biological reactions
CN100503838C (zh) 用于分析核酸的微流***
EP1570043B1 (en) Device and method for in-line blood testing using biochips
CN1143917A (zh) 用于测定和加工分析物的中尺度样品制备设备和***
CN101613660B (zh) 检测和分析病原体的方法和设备
CN102409079A (zh) 一种新型传染病核酸快速检测试剂盒及其检测方法
US11248255B2 (en) Amplification of nanoparticle based assay
US20210237050A1 (en) Disposable bioassay cartridge and method of performing multiple assay steps and fluid transfer within the cartridge
Su et al. Nucleic acid-based detection for foodborne virus utilizing microfluidic systems
Mitsakakis et al. Diagnostic tools for tackling febrile illness and enhancing patient management
Lin et al. Application of microfluidic technologies on COVID-19 diagnosis and drug discovery
Zenhausern et al. Microfluidic sample preparation for respiratory virus detection: A review
Yobas et al. Nucleic acid extraction, amplification, and detection on Si-based microfluidic platforms
JP2006121935A (ja) 前処理手段および廃液貯留部を有する生体物質検査用マイクロリアクタ
JP2009210392A (ja) チップ
Sun et al. Microfluidic devices for viral detection
Hattersley et al. The application of microfluidic devices for viral diagnosis in developing countries
KR102625074B1 (ko) 마이크로입자 기반 핵산 검출용 키트 및 핵산 증폭산물 검출 방법
Hoang et al. Fluidic system with movable layers for all-in-one assay of cell-free DNA in blood

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant