CN105531373A - 盐碱条件下甘油向1,3-丙二醇的转化 - Google Patents

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CN105531373A CN201480049297.9A CN201480049297A CN105531373A CN 105531373 A CN105531373 A CN 105531373A CN 201480049297 A CN201480049297 A CN 201480049297A CN 105531373 A CN105531373 A CN 105531373A
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Abstract

一种用于生成1,3-丙二醇的方法。所述方法包括采用盐厌氧菌的嗜盐碱(haloalkaliphilic)物种在大于约10的pH和大于约5％w/v的盐浓度下将甘油源转化成1,3-丙二醇。此外，补充有维生素B12，可增加1,3-丙二醇比甘油的产率。

Description

盐碱条件下甘油向1,3-丙二醇的转化
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年9月6日提交的、题为“盐碱条件下甘油向1,3-丙二醇的转化”(ConversionofGlycerolto1,3-PropanediolUnderHaloalkalineConditions)的美国临时专利申请系列号61/874,752的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文。
序列表
本申请包含计算机可读形式(CRF)的序列表，其以名为"序列表"的ASCII文本格式(2014年8月28日生成，大小为20KB)提交。CRF的内容通过引用纳入本文。
背景
技术领域
本发明将提供一种供于生物柴油公司从废产物(甘油)形成有价值的产物(1,3-丙二醇)的方法。
相关技术的描述
化学废料能够回收成有用的化合物。随着近期生物柴油生成的激增，甘油已经从相对特殊的日用品成为了严重过度生成的废产物。许多大型化学与农业公司已试图寻找甘油的高效转化方式。一种主要工艺是通过微生物代谢将甘油转化成1,3-丙二醇。已经成功地鉴定了能够进行该反应的微生物菌株；然而，其在商业上可能不太可行，因为粗甘油产物需要被处理。考虑到经济上的可行性，该工艺必须能够采用有限的处理就能将粗甘油产品转化成1,3-丙二醇。例如，1,3-丙二醇，作为许多常见产物的构件块(buildingblock)常用于化学工业，所述常见产物例如粘合剂、香料和香水、个人护理产品，以及涂料诸如漆。目前，1,3-丙二醇从粗油组分、丙烯或环氧乙烷，或源自玉米的葡萄糖合成。然而，用于回收化学废料的常见的化学加工涉及使处理流对于用于生物转化的细菌来说更具耐受性。通过添加大量的酸或碱，或采用大量的能量来移除盐和杂质，工业上提供适于非极端微生物生存的条件。甘油是生物柴油生成的另一种常见废产物，其可被转化成有用的化合物。随着近期生物柴油生成的激增，甘油已经从相对特殊的日用品成为了严重过度生成的废产物。许多大型化学与农业公司已试图寻找甘油的高效转化方式。主要处理目标之一是通过微生物代谢将甘油转化成1,3-丙二醇(图1)。已经成功地鉴定了能够进行该反应的微生物菌株；然而，其在商业上可能不太可行，因为粗甘油产物需要被处理。就甘油会增加施于细菌上的压强而言，甘油的作用方式与盐非常类似。考虑到经济上的可行性，该工艺必须能够采用有限的处理就能将粗甘油产品转化成1,3-丙二醇。因此，仍需要将化学废料转化成有用的化合物和产物的改善的方法。
发明内容
本发明通过提供一种生成1,3-丙二醇的方法而解决了上述问题。所述方法包括使盐厌氧菌(Halanaerobium)与甘油源发酵，由此产生1,3-丙二醇。发酵可在高pH和高盐浓度下进行，并且无需从甘油原料移除杂质。可通过向发酵培养物补充维生素B12来提高发酵转化率。
附图的简要说明
图1说明将甘油转化成1,3-丙二醇的过程；
图2是盐厌氧菌嗜盐碱(haloalkaliphilic)物种的扫描电子显微镜(SEM)照片；
图3是甘油消耗的散点图；
图4是甘油消耗的散点图；
图5是1,3-丙二醇生成的散点图；
图6是1,3-丙二醇生成的散点图；
图7显示的散点图显示峰高度和峰面积之间的甘油浓度比较；
图8显示的散点图显示峰高度和峰面积之间的1,3-丙二醇浓度比较；和
图9的图显示增加维生素B12的浓度对1,3-丙二醇生成(转化)的影响。
优选实施方式详述
本发明提供一种用于发酵生成1,3-丙二醇的方法，该方法无需进行当前所需步骤：预处理、脱盐或中和以降低原料或发酵培养基的盐度或pH，或移除通常存在于粗原料中的废料副产物。本发明方法能够经调整以适应更大规模、商业或工业应用以从化学废料的微生物发酵中生成作为有用前体物质的1,3-丙二醇，所述化学废料具体是包含甘油或甘油源的化学废原料，所述方法以低成本且环境友好的方式进行。
本发明方法采用能够在未处理的化学废料的存在下旺盛生长的极端微生物。具体而言，优选微生物是产氢盐厌氧菌(Halanaerobiumhydrogeniformans)(ATCC专利保藏编号PTA-10410，保藏于2009年10月13日)，其在高pH(约pH11，其类似于洗涤清洁剂)和高盐浓度(7％盐，是海洋水平的两倍)的条件下生长。在用于产生生物燃料(如乙醇和氢)的经处理的生物质，以及在生物柴油生成过程中生成的粗甘油中存在这些条件。
化学废原料的发酵采用能够在高碱和超盐条件生成1,3-丙二醇的嗜盐碱微生物完成。产氢盐厌氧菌能够在pH11和7％盐的极端条件下，将甘油，生物柴油生成的常见废产物，转化成为1,3-丙二醇。在优选实施方式中，采用该方法能获得约55％的转化率。有利的是，该微生物还能在包含多达1M甘油的培养基中生长，并且能够在包含粗废料甘油的溶液中旺盛生长。
不同于盐厌氧菌(Halanaerobium)属的其它成员，该微生物是高度嗜碱性的，并且在约10.5至约11的pH下有最优生长。用于本发明方法的合适的微生物优选地具有包含SEQIDNO:1(或由SEQIDNO:1组成)的16S核糖体DNA(rDNA)序列，或与SEQIDNO:1具有至少98％序列同源性，且更优选地，与SEQIDNO:1具有至少99％序列同源性的16SrDNA序列。合适的微生物将优选地具有编码甘油脱水酶或有甘油脱水酶活性的酶的至少一个基因，并且优选地具有编码甘油脱水酶或有甘油脱水酶活性的酶的内源性基因。在一个或多个实施方式中，所述微生物包含内源性DNA序列，所述内源性DNA序列含有(或由其组成)SEQIDNO:2或与SEQIDNO:2具有至少98％序列同源性、更优选与SEQIDNO:2具有至少99％序列同源性的序列。在一个或多个实施方式中，所述微生物包含编码内源性蛋白质的基因，所述内源性蛋白质含有(或由其组成)SEQIDNO:3，或与SEQIDNO:3具有至少98％序列同源性、更优选地与SEQIDNO:3具有至少99％序列同源性的序列，。
合适的微生物将优选具有编码含铁醇脱氢酶或有醇脱氢酶活性的酶的至少一个基因，并且优选地，编码含铁醇脱氢酶或具有醇脱氢酶活性的酶的内源性基因。在一个或多个实施方式中，所述微生物包含内源性DNA序列，所述内源性DNA序列含有(或由其组成)SEQIDNO:4或与SEQIDNO:4具有至少98％序列同源性、更优选与SEQIDNO:4具有至少99％序列同源性的序列。在一个或多个实施方式中，所述微生物包含编码内源性蛋白质的基因，所述内源性蛋白质含有(或由其组成)SEQIDNO:5，或与SEQIDNO:5具有至少98％序列同源性、更优选地与SEQIDNO:5具有至少99％序列同源性的序列。在一个或多个实施方式中，所述微生物包含内源性DNA序列，所述内源性DNA序列含有(或由其组成)SEQIDNO:6，或与SEQIDNO:6具有至少98％序列同源性、更优选与SEQIDNO:6具有至少99％序列同源性的序列。在一个或多个实施方式中，所述微生物包含编码内源性蛋白质的基因，所述内源性蛋白质含有(或由其组成)SEQIDNO:7，或与SEQIDNO:7具有至少98％序列同源性、更优选地与SEQIDNO:3具有至少99％序列同源性的序列。合适的微生物包括保留了产氢盐厌氧菌的嗜盐碱性质的微生物的突变体和衍生物(子代)。突变体(例如上述序列中缺失、***和/或替代一个碱基)包括在所述微生物的传代或培养中自发发生的那些，以及故意突变的那些。在一个或多个实施方式中，也可采用嗜盐碱微生物，其已经工程改造以包含一个或多个上述基因或编码上述一种或多种酶的基因。
包含甘油或甘油源的化学废原料与微生物在适于1,3-丙二醇生成的条件下于培养基中发酵。优选的培养基包含，基本由如下物质组成，或甚至由如下物质组成(每升)：70gNaCl、40gNa2CO3、6.3gK2HPO4、1g酵母提取物、0.75gNa2S和0.6g半胱氨酸，伴随10ml的基础培养基储液和10ml的痕量矿物溶液。基础培养基储液优选包含50mgNH4NO3、8.5mgMgCl2·6H2O、7.5mgSiO2、4.5mgMnSO4·H2O、4.2mgCaCl2·2H2O、4mg亚甲蓝和1.8mgFeSO4·7H2O。痕量矿物溶液优选包含(每升)：3gMgSO4·7H20、1.63gNa3-NTA、1gNaCl、0.64gMnCl2·4H2O、0.13gZnCl2、0.1gFeSO4·7H2O、0.1gCaCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、0.03gNiSO4·6H2O、0.025gNa2MoO4·2H2O、0.025gNa2WO4·2H2O、0.01gAlK(SO4)2·12H2O、0.01gH3BO3和7mgCuCl2·2H2O。
包含甘油或甘油源的化学废原料优选地以约1g/L至约184g/L，且优选约10g/L至约92g/L的甘油浓度提供。所述微生物能够以高达184g/L的甘油浓度发酵原料。所述微生物发酵所述原料以产生1,3-丙二醇，伴有其它副产物。
如上所示，优选进行所述方法但不进行化学废原料的中和(即，不降低pH至约7)。即，原料(和所得的发酵中的培养物，包括培养基)的pH优选大于或等于约10，优选是约10至约11，且更优选约10.5至约11。所述原料和发酵中的培养物(包括培养基)的盐度(％NaCl含量)还优选大于或等于约5％w/v，更优选大于或等于约7％w/v，甚至更优选约7％至约7.5％w/v。本文中所述的组分在组合物中的“体积重量”百分比(本文称为“％w/v”)基于所述组分(例如，盐)在终溶液中的总质量(以克/升)计算，其中1000g/L作为100％w/v。优选在整个发酵过程中维持培养基中的这些pH和盐度条件。即，发酵中的培养物的pH优选地维持在处于或高于约pH10，且更优选约10.5至约11，而盐度维持在大于或等于约5％w/v，优选地大于或等于7％w/v，且更优选约7％至约7.5％w/v。
优选地，所述原料不经纯化或预处理。在一个或多个实施方式中，所述原料还包含甲醇、粗甘油、氢氧化钠、水，及其混合物。甲醇通常伴随甘油存在于生物柴油废料流中。有利地，所述微生物耐受粗生物柴油废料。因此，在一个或多个实施方式中，在发酵之前，不从原料移除此类杂质或化学品。预期所述微生物在未处理的生物柴油废料从甘油形成1,3-丙二醇，这将为生产者省去必须移除通常会抑制耐受性较差的发酵细菌的甲醇和其它可能的污染物的劳动。
在一个或多个实施方式中，所述发酵培养物优选地补充有维生素B12。优选地，维生素B12以约25μg/L至约100μg/L，更优选约25μg/L至约75μg/L，并且更优选约25μg/L至约50μg/L的水平存在于发酵培养物中。有利地，产氢盐厌氧菌的内源性甘油脱水酶不必依赖于B12，并且能够在没有B12补充的情况下将甘油发酵成1,3-丙二醇。然而，已显示B12能够提高产率多达0.47(mol/mol)。
在一个或多个实施方式中，发酵优选地在基本厌氧条件下进行。本文中所述的“基本厌氧条件”指的是其中没有可用的游离氧(例如，少于约0.1ppm游离氧，优选地约0至约0.1ppm游离氧)的条件，包括天然或人工耗氧的环境。更优选地，对于人工环境(即，试管、发酵反应器)，用选自下组：N2、CO2，及其混合物的合适气体在培养基的顶部空间提供气相。特别优选的气相是约80％N2/20％CO2的组合。在一个优选的方法中，所述基本厌氧条件可通过用所选气体的喷射培养基来维持。
还优选在发酵过程中搅拌培养基，优选地以约100rpm至约250rpm，且更优选约100rpm至约200rpm的速度进行搅拌。搅拌可通过振荡、旋转、涡轮，或其任何组合进行。发酵还优选在避光(即，在发酵过程中，培养物不暴露至任何光源)条件下进行。发酵优选在如下温度进行：约6℃至约40℃，且优选约25℃至约30℃，且进行约12小时至约72小时的时长，优选约12小时至约24小时的时长。
所述发酵过程优选地导致从甘油到1,3-丙二醇的如下摩尔/摩尔百分比产率：采用仅甘油培养基为至少约32％，且优选约32％至约60％，并且理论产率为高于90％。采用维生素B12补充的培养基，从甘油到1,3-丙二醇的产率优选地高于约60％，并且优选地是约60％至约80％，并且理论产率高于90％。所述产率如下计算：
(产生的1,3-丙二醇(mol))/(初始甘油(mol))＝产率
或
(产生的1,3-丙二醇(mol))/(添加B12的初始甘油(mol))＝产率
在一个或多个实施方式中，所述方法在含约7％盐和约0.2％甘油并添加有B12的培养基中于pH11下的1,3-丙二醇产率为约60％。
发酵可在发酵设备(发酵反应器)中进行。合适的发酵反应器是本领域已知的。一般而言，合适的设备将具有供于生物柴油废料原料、人工气氛气体的进口，和发酵室，以及供于移出1,3-丙二醇和副产物的出口。所述设备将包含所述微生物和营养培养基。所述设备还可配备有搅拌棒、涡轮或其它搅拌装置。所述原料可按需持续地供应至发酵设备以维持化学废菌糠的发酵速率。所述发酵设备可以是独立的设备，或者其可与下游反应器联合，以接受并进一步加工来自发酵设备的任何副产物。
所述方法还包括接受发酵反应产生的1,3-丙二醇。所得的1,3-丙二醇可从发酵培养物分离，例如通过蒸馏、提取或其它分离方法。
而在另一个实施方式中，来自发酵反应器的废物流经回收并重新引入该***。这在本发明方法中是可行的，因为所述废物流的盐浓度和pH对于采用极端微生物的微生物培养而言将仍然是可改动的。必要时，可调节pH或盐浓度(上调)。有利地，这不仅显著降低方法中所需的水的量，还显著降低用于培养的基质的成本，由此降低生成1,3-丙二醇所需的总成本。
本发明的益处和创新之处在于，所述微生物能够在碱性条件下将甘油转化成1,3-丙二醇，无需将粗甘油中和至7.0的pH值。此外，所述微生物是耐盐的，并且能够耐受盐性条件。通常而言，粗甘油废料的盐度是约5％。采用所述微生物，无需稀释废料中残余的盐。所述微生物的应用将协助使甘油转化成1,3-丙二醇的方法更简化并更有效。竞争性的优势是，不必处理该生物柴油废料流以移除盐或调节其pH。
通过阅读本文所述的发明和下面的工作实施例，本发明的各种实施方式的其它优势对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。除非另以其它方式说明，应理解本文所述的各种实施方式相互间不必是相互排斥的。例如，一个实施方式中描述或说明的特征也可被纳入其它实施方式，但并不是必须被纳入的。因此，本发明涵盖本文所述的特定实施方式的多种组合和/或整合。
本发明说明书也使用数值范围来定量某些与本发明不同实施方式相关的参数。应理解，当给出数值范围时，这些范围可以理解为作为仅仅叙述了该范围下限值的权利要求限定和仅仅叙述了该范围上限值的权利要求限定的文字支持。例如，所揭示的约10至约100的数值范围可以对叙述为“大于约10”(无上限)的权利要求和叙述为“小于约100”(无下限)的权利要求提供支持。
实施例
以下实施例描述了根据本发明的方法。然而应理解，这些实施例通过举例的方式提供，其所含的任何内容都不应视作对本发明整体范围的限制。
实施例1
产氢盐厌氧菌(Halanaerobiumhydrogeniformans)
产氢盐厌氧菌(原先称为盐厌氧菌株系“sapolanicus”)分离自华盛顿州皂湖的嗜碱(pH约10，15-至140-g/升NaCl)厌氧沉积物，该处具有高达10g/升的极高硫化物浓度。其为绝对厌氧、革兰氏阴性、不动、不结孢子的细长杆状细菌(图2)。其能够利用C5-C6范围的糖，在pH11、7％(wt/vol)NaCl和33℃下具有最优生长，生成乙酸盐、甲酸盐，和氢作为主要代谢终端产物。测定产氢盐厌氧菌的基因组序列来促进对其代谢和生物能源潜力的评估，特别是改善碱性或盐碱性预处理方案供于该细菌的强健氢生成。通过与亿明达(Illumina)(Bennett，S.2004.索来科萨(Solexa)有限公司基因测试学5:433–438)和454(Margulies,M.等.2005.“微制造高密度皮升反应器中的基因组测序”(Genomesequencinginmicrofabricatedhighdensitypicolitrereactors).Nature437:376–380.)技术联合来测定该产氢盐厌氧菌的基因组序列。联合基因组研究院(JointGenomeInstitute)构建并测序了亿明达GAii鸟枪文库，其产生27,639,916个读数，总计2,100Mb，从77,351个读数生成454个钛标准文库，以及产生160,293个读数总计82.3Mb的454数据的具有10.607±2.651kb的平均***大小的双端454文库。有必要采用486个额外的反应和6个散开(shatter)文库来缩近缺口并产生最终的序列质量。用于测定基因组序列的方法已于先前描述(Elkins，J.G.等，2010.“纤维素分解性极端嗜热嗜热厌氧菌OB47T的完全基因组序列”.J.Bacteriol.doi:10.1128/JB.00950-10)，并且这是是“最终的”基因组(Chain，P.S.G.等.2009.“测序新纪元中的基因组工程标准”.Science326:236–237)。总基因组大小是2,613,116bp，基于52.2Mb的454草拟数据的最终组装提供平均21.5X的基因组覆盖率，而463Mb的亿明达草拟数据提供平均178X的基因组覆盖率。基因组是33.1％G+C且包含2,295个编码候选蛋白质的基因模型。所述基因组包含四种分离的rRNA操纵子，其各自含有5S、16S(SEQIDNO:1)和23SrRNA基因，其中16SrRNA基因之间具有99.9-100％的相同性。最接近的显著16SrRNA基因匹配(GenBank登录号GQ215697)是其它盐厌氧菌物种。然而，所有竞争性的物种因其为嗜中性而均具有生理学差异。该全基因组鸟枪工程已登记于DDBJ/EMBL/GenBank，登录号CP002304。
实施例2
从甘油产生1,3-丙二醇
培养基包括(每升)：70gNaCl、40gNa2CO3、6.3gK2HPO4、1g酵母提取物、0.75gNa2S(作为还原剂)、0.6g半胱氨酸(作为还原剂)，以及10ml的基础培养基储液和10ml的痕量矿物溶液。基础培养基储液包含(每升)：50mgNH4NO3、8.5mgMgCl2·6H2O、7.5mgSiO2、4.5mgMnSO4·H2O、4.2mgCaCl2·2H2O、4mg亚甲蓝(作为氧指标)，和1.8mgFeSO4·7H2O。痕量矿物溶液包含(每升)：3gMgSO4·7H20、1.63gNa3-NTA、1gNaCl、0.64gMnCl2·4H2O、0.13gZnCl2、0.1gFeSO4·7H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.1gCoCl2·6H2O、0.03gNiSO4·6H2O、0.025gNa2MoO4·2H2O、0.025gNa2WO4·2H2O、0.01gAlK(SO4)2·12H2O、0.01gH3BO3和7mgCuCl2·2H2O。
培养物瓶用50mL的培养基配备，然后补充2.5mL的600mM甘油储液(至终浓度为约25mM甘油)。培养瓶还补充2.5mL的128μg/mL维生素B12溶液(至终浓度为约53.33μg/L)。更换顶部空间气体以包含100％N2。所述样品在30℃于振荡孵育箱中以150rpm孵育七天。来自用甘油更改的培养物的结果示于下表1。三个重复用甘油和细菌补充。一个用甘油补充的培养物不接种细菌。三个额外的重复补充有甘油和维生素B12。一个用甘油和维生素B12补充的培养物不接种细菌。这些结果清楚显示细菌消耗了甘油补充物。还补充有维生素B12的那些培养物能比没有用该维生素补充的那些消耗更大量的甘油。
表1.
表2显示补充有甘油的培养物的结果。三个重复补充有甘油和细菌。用甘油补充的一个培养物不接种细菌。三个额外的重复补充有甘油和维生素B12。用甘油和维生素B12补充的一个培养物不接种细菌。这些结果清楚显示所述细菌能够产生1,3-丙二醇。还补充有维生素B12的那些培养物能产生比没有用该维生素补充的那些更大量的1,3-丙二醇。
表2.
讨论
标准曲线示于图3-6。分析第0天和第7天甘油和甘油+B12处理组之间的差异。检测甘油消耗和1,3-丙二醇生成。还检测乙酸盐生成来确定相较于甘油脱水酶通路的甘油激酶通路的活性。在没有蛋白质分析的情况下，生长的准确测量是不可行的，但乙酸盐的生成能够至少指示发生的发酵，并且估计有多少甘油量被用于丙酮酸盐代谢而非1,3-丙二醇生成。
图7中的散点图显示培养物以大致相同的甘油浓度起始，然而在7天后，补充有B12的培养物(右侧，5-8000)利用了甘油总量中的更多量。
图8中的散点图显示，在极端条件下观察到来自细菌的1,3-丙二醇生成，并且当B12被补充至该生物体时产量增加。对于乙酸盐以粗略测试伴随正常代谢活性的“生长”，补充有B12的培养物中的峰面积和峰高约为仅甘油培养物的一半，这有助于解释生长下降。进行快速成对T检验以确定甘油和甘油+B12培养物中的浓度差异是显著的。两个p值均<0.001指示统计学显著地生成1,3-丙二醇。
第0天的瓶中甘油终浓度是约25.3mM，并且我们产出了约12mM1,3-丙二醇，获得约0.47的mol/mol比，然而B12补充<64μg/mL，这归因于接种物的稀释和碳源的添加。
实施例3
B12的需求
厌氧培养物在160mL血清瓶中制备。通过在N2覆盖下煮沸脱气来制备培养基。培养基冷却时，向培养基添加反应物储液混合物，其包含0.75gNa2S和0.6g半胱氨酸/升。一旦培养基冷却，将培养瓶转移至Coy厌氧手套袋，其中将50mL的培养基分散于填充并高压蒸汽处理的(121℃，20分钟)的160mL血清瓶。高压灭菌后，顶部空间气体用80％N2/20％CO2混合物交换。然后，用来自先前储存的培养物的10％接种物接种所述瓶。添加30mM甘油。缺氧下补充维生素B12，无菌过滤的储液在以0μg/L、25μg/L、50μg/L、75μg/L和100μg/L的接种即刻前添加。
每24小时取样。5mL注射器用N2/CO2混合物脱气，然后从各取样阶段移出1mL培养物样品。将样品置于1.5mLEppendorf管，并以13,000xg离心5分钟。将上清液轻轻倒入另一个1.5mLEppendorf管，并冷冻用于HPLC分析。
对于HPLC分析，无菌过滤的样品(0.45μMPTFE滤器)被注射至保持在50℃下的300x7.8mmAminexHPX-87H柱(伯乐，加利福尼亚州海格拉斯)。流动相是以0.6ml/分钟的流速保持在大约2.2MPa下的2.5mMH2SO4。采用UV231(210nm)和折射率检测器进行检测。
获得的结果：
研究了产氢盐厌氧菌的生产能力和维生素B12补充的影响。制定梯度以检测来自含有30mM甘油的培养基的1,3-丙二醇的最大生成。当培养基补充有25、50、75或100μg/L维生素B12时，大约生成16.5mM1,3-丙二醇，而当不提供维生素B12时，生成大约8.5mM1,3-丙二醇(图9)。表3指示当补充有维生素B12时产氢盐厌氧菌培养物中的甘油向1,3-丙二醇转化的摩尔/摩尔百分比。
表3：补充有维生素B12的产氢盐厌氧菌培养物中的甘油向1,3-丙二醇转化的摩尔/摩尔百分比。
B12补充，μg/L ％mol 1,3-丙二醇/mol甘油
0 31.5
25 59.1
50 60.3
75 60.1
100 60.2
实施例4
产氢盐厌氧菌对甘油的耐受
检测产氢盐厌氧菌对多种甘油浓度的耐受。厌氧培养物在160mL血清瓶中制备。通过在N2覆盖下煮沸脱气来制备培养基。培养基冷却时，向培养基添加反应物储液混合物，其包含0.75gNa2S和0.6g半胱氨酸/升。一旦培养基冷却，将培养瓶转移至Coy厌氧手套袋，其中将50mL的培养基分散于填充并高压蒸汽处理的(121℃，20分钟)的160mL血清瓶。高压灭菌后，顶部空间气体用80％N2/20％CO2混合物交换。然后，用来自先前储存的培养物的10％接种物接种所述瓶。向血清瓶添加无菌甘油以获得7.5、15、30、60、120、240、480、960和1920mM。通过600nM下的浊度读数来检测生长。确定产氢盐厌氧菌能够在7.5、15、30、60、120、240、480、960和1920mM甘油中生长。当甘油不存在于培养基中时，没有显示任何生长。数据指示产氢盐厌氧菌除了耐受7％(w/v)和pH11以外还能够耐受至少1M甘油。
表4
实施例5
产氢盐厌氧菌对1,3-丙二醇的耐受
检测了产氢盐厌氧菌对递增浓度的1,3-丙二醇的耐受。厌氧培养物在160mL血清瓶中制备。通过在N2覆盖下煮沸脱气来制备培养基。培养基冷却时，向培养基添加反应物储液混合物，其包含0.75gNa2S和0.6g半胱氨酸/升。一旦培养基冷却，将培养瓶转移至Coy厌氧手套袋，其中将50mL的培养基分散于填充并高压蒸汽处理的(121℃，20分钟)的160mL血清瓶。高压灭菌后，顶部空间气体用80％N2/20％CO2混合物交换。然后，用来自先前储存的培养物的10％接种物接种所述瓶，并补充30mM甘油。向血清瓶添加无菌的1,3-丙二醇以达10、30、60、120、380和750mM。通过600nM下的浊度读数来检测生长。确定产氢盐厌氧菌能够在存在0、10、30、60、120和380mM的1,3-丙二醇浓度的情况下生长。数据指示，产氢盐厌氧菌除了耐受7％(w/v)和pH11以外还能够耐受至少0.38M1,3-丙二醇。
表5
实施例6
产氢盐厌氧菌对粗甘油的耐受
检测产氢盐厌氧菌对粗甘油的耐受。厌氧培养物在160mL血清瓶中制备。通过在N2覆盖下煮沸脱气来制备培养基。培养基冷却时，向培养基添加反应物储液混合物，其包含0.75gNa2S和0.6g半胱氨酸/升。一旦培养基冷却，将培养瓶转移至Coy厌氧手套袋，其中将50mL的培养基分散于填充并高压蒸汽处理的(121℃，20分钟)的160mL血清瓶。高压灭菌后，顶部空间气体用80％N2/20％CO2混合物交换。然后，用来自先前储存的培养物的10％接种物接种所述瓶。以0.1％和0.5％浓度添加获自小型生物柴油生产商的粗甘油。不对该粗甘油进行纯化步骤。通过600nM处的浊度读数来检测一周后的生长。确定产氢盐厌氧菌能够在暴露至粗的、未纯化的甘油时生长。产氢盐厌氧菌能够在至少0.5％粗甘油中生长。在0.1％粗制物中的缓慢生长很有可能归因于低甘油浓度。在0.5％粗甘油中的生长甚至更慢。
讨论
上述工作鉴定了在pH11和7％(w/v)NaCl中，产氢盐厌氧菌中能够生成1,3-丙二醇。所述微生物能够在1M甘油(伴随7％NaCl和pH11)和380mM1,3-丙二醇中生长。在不存在B12时，转化率为31％。有B12补充(>25μg/LB12)时，转化率是大约60％转化。所述微生物还能够在未经处理的至少0.5％粗甘油中生长。

Claims (20)

1.一种生成1,3-丙二醇的方法，所述方法包括：使产氢盐厌氧菌(Halanaerobiumhydrogeniformans)与甘油源发酵，由此生成1,3-丙二醇。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括回收所述1,3-丙二醇。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘油源是来自生物柴油生产中包含甘油的化学废料。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化学废料包含粗甘油。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，进行所述发酵，但不在所述发酵之前中和所述化学废料的pH。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，进行所述发酵，但不在所述发酵之前稀释所述化学废料的盐度。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化学废料还包含甲醇，其中，进行所述发酵，但不在所述发酵之前从所述化学废料移除所述甲醇。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵包括在培养基中以所述甘油源培养所述产氢盐厌氧菌，以产生发酵培养物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基包含维生素B12。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养物的盐含量大于约5％w/v。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵在大于或等于约10的pH进行。
12.如权利要求1所述的方法，所述发酵在基本厌氧条件下进行。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产氢盐厌氧菌是以ATCC编号No.PTA-10410保藏的生物体。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产氢盐厌氧菌包含编码甘油脱水酶或具有甘油脱水酶活性的酶的内源性基因。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述基因包含DNA序列，所述DNA序列含有SEQIDNO:2或与SEQIDNO:2具有至少98％的序列同源性的序列。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述甘油脱水酶包含SEQIDNO:3或与SEQIDNO:3具有至少98％的序列同源性的序列。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产氢盐厌氧菌包含编码含铁醇脱氢酶或具有醇脱氢酶活性的酶的内源性基因。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述基因包含DNA序列，所述DNA序列含有SEQIDNO:4或6，或与SEQIDNO:4或6具有至少98％的序列同源性的序列。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述含铁醇脱氢酶包含SEQIDNO:5或7，或与SEQIDNO:5或7具有至少98％的序列同源性的序列。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵在发酵反应器中进行，所述反应器包含供于所述甘油源的进口，包含培养基中的所述产氢盐厌氧菌的发酵室，和供于移出所述1,3-丙二醇的出口。
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