CN105524855A - 一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明菌株分类命名为凝结芽孢杆菌(<i>Bacillus？coagulans</i>)？JSSW-LA-07-1，巳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC？No.？10182；还公开了该菌菌粉制剂的制备方法，以凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1为出发菌株，该菌株活化后经发酵培养得到的发酵液高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2-10进行混合，在30-50℃下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，即得该菌菌粉制剂，菌粉制剂中菌浓度不低于5.0×108个（CFU）/克，该菌粉制剂用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1.0-5.0mg？?kg-1的该菌粉制剂；用作水产养殖水质改良剂，按50-200g/亩?米的用量全池泼洒该菌粉制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
近年来，我国水产养殖业蓬勃发展，极大地丰富了人们的物质生活。但随着高密度集约化养殖规模日益扩大，养殖水体生态环境日益恶化，极大地增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，造成各类鱼病多发，甚至水产动物大面积的死亡。针对鱼病的防治，传统的方法是使用抗生素，短期可能起到较好的效果，但长期使用容易导致病原菌的耐药性越来越强，水生动物肠道内菌群失衡，长期富集在体内通过食物链影响人类健康等弊端。用微生态制剂进行水产养殖动物病害的防治是近年发展起来的一种新方法，能够有效避免服用抗生素所造成的耐药性和二次感染等，其凭借独特的调节肠道菌群的功能而备受世人瞩目。
乳酸菌类益生菌是目前我国农业部、美国食品及药物管理局（FDA）等国内外政府批准使用的数量最多、效果较好的一类安全微生物菌种。它具有以下特点：耐酸，在pH为3.0―4.5时仍可生长，适应于胃肠的酸性环境；乳酸菌是动物肠道的正常菌群，在肠***定植，在体内通过生物拮抗，拮抗革兰氏阴性致病菌，维持肠道中正常的生态平衡；可降低肠道pH值，阻止和抑制有害物质，增强抗感染能力；活菌体内的代谢产物中含有较高的超氧化物歧化酶（SOD），能增加动物的体液免疫和细胞免疫，增强机体的免疫调节活性，促进生长。但普通乳酸菌在生长过程中，不形成芽孢，抗逆性差，易失活，难保藏，所以在饲料工业中的应用受到一定限制。本发明所应用的凝结芽孢杆菌正好弥补这一缺憾。凝结芽孢杆菌(Bacillus
coagulans)，是一类能够产芽孢的乳酸菌，除了具有乳酸菌的特点外，还具有抗逆性强、耐高温、易保存、存活率高等优点。
本发明涉及凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1对多种水产常见病菌的广谱拮抗作用，同时该菌株还兼具养殖环境控制功能和促进水生动物的生长的特点，是一种新型的多功能微生物。目前尚无凝结芽孢杆菌此方面的专利报道。
在水产养殖中应用该菌株制备的微生态制剂能够高效调控水质、防治疾病、促进水生动物生长，满足水产养殖对疾病防控、水体生态环境治理和健康养殖的高度需求。在淡水生态健康养殖推广应用中，与传统的以药物使用为主的水质调控和病害防治技术相比，微生态制剂具有主动预防，无毒、无残留，无污染的优点，对形成良好的养殖生态环境，减少养殖污水的排放，消除水产品中药物的残留，保护环境具有重要意义。同时作为水产饲料添加剂能够有效促进水产养殖动物健康生长，带动水产养殖经济效益的提高，促进水产养殖户增产增收。
发明内容
本发明的目的是提供一种对水产养殖常见病原菌具有拮抗作用、能够净化养殖水体、促进水生动物生长的凝结芽孢杆菌菌株。
为达到以上目的，本发明的技术方案是：提供一株具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌菌株，分离自鱼类肠道，该菌株的分类命名为：凝结芽孢杆菌(Bacillus
coagulans) JSSW-LA-07-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.10182。 本发明的凝结芽孢杆菌菌株JSSW-LA-07-1，革兰氏阳性菌，镜检呈杆状，细胞直径＜1μm，芽孢膨大。在MRS平板上菌落直径为2.0-3.0mm，形态不规则，表面褶皱、不透明、无色素。在LB培养基上可得大量圆形、表面褶皱、不透明、白色的菌落。
本发明的制备工序如下：
（1）菌种活化：
无菌开启凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1的冻干保藏菌种，划线接种于麸皮营养琼脂试管斜面，于30-37 ℃培养24-48
h，然后划线转接于麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，30-37 ℃培养24-48 h。镜检，当90 %以上菌体形成芽孢时，即为成熟。反复活化2-3次，种子菌悬液以体积比1%-10%接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为体积比10%-20%，转速为100-180 rpm，30-37℃恒温振荡培养20-24h；
斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨 10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂 15-20，蒸馏水1L，pH 7.0-7.2。
发酵培养基组成以g/L计：麸皮 5-20，酵母膏 5-10，豆粕粉 5-10，K2HPO4 3，NaCl 5，MnSO4·H2O
0.3, 蒸馏水1L，pH
7.0。
（2）抑菌性测定：
将无菌滤纸片在浓度约为107 CFU/mL凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1新鲜培养液中浸泡1.0 h。取浓度约5×106
CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、溶藻弧菌的液体培养液0.1 mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡过菌液的滤纸片贴于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于25-30℃培养箱中24、48 h，测量抑菌圈大小。
（3）凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的制备及应用：
菌种JSSW-LA-07-1活化后经发酵培养得到的发酵液高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2-10进行混合，在30-50℃下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂，浓度不低于5.0×108个（CFU） /克。
用所述方法制备的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的应用，用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1.0-5.0mg
•kg-1的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂；用作水产养殖水质改良剂，按50-200g/亩•米的用量全池泼洒凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂。
本发明的有益效果：
凝结芽孢杆菌 JSSW-LA-07-1能够有效抑制嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌的生长，其中对温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果优于其他种类致病菌。因此，在水产养殖中使用凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物病害，保护水生动物健康生长。
凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂作为渔业养殖饲料添加剂能够显著提高水生动物的增重率、特定增长率，显著降低饵料系数。
凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂作为水产养殖用水质改良剂能够有效降低水体中的污染物含量，改善养殖水质。
生物材料样品保藏：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
JSSW-LA-07-1，巳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年12月15日，保藏号为：CGMCC No.10182。
附图说明
图1 JSSW-LA-07-1的***发育树。
具体实施方式
实施例1：菌种的筛选和分离
在无锡鹅湖养殖池塘采集异育银鲫样品，将鱼体解剖取肠道，加入生理盐水，研磨制成匀浆液，每个样品吸取1.0 mL，80℃加热10 min，取移液枪吸取0.1 mL于YPD固体培养基上，涂布，37℃培养。根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为JSSW-LA-07-1。
实施例2：菌种鉴定
（1）形态特征
菌株 JSSW-LA-07-1，革兰氏染色为阳性，镜检呈杆状，细胞直径＜1μm，能形成芽孢。在MRS平板上菌落直径为2.0-3.0mm，形态不规则，表面褶皱、不透明、无色素。在LB培养基上可得大量圆形、表面褶皱、不透明、白色的菌落。
（2）生化特性
菌株JSSW-LA-07-1，革兰氏染色为阳性，接触酶、β-半乳糖苷酶、VP试验、甲基红试验为阳性，能在50℃环境下生长。氧化酶、脲酶、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验为阴性，不能水解淀粉、明胶、酪素，不产生吲哚和H2S，不能在柠檬酸上生长。
生长实验结果显示该菌株能利用D-纤维二塘、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-海藻糖、糊精、D-蜜二糖、N-乙酰-D-葡萄胺、甘油，产L-乳酸、丙酮酸甲酯。反硝化试验为阳性，说明该菌株能够降解水体中的含氮化合物。
化学敏感实验结果显示，该菌株对林可霉素、二甲胺四环素、夫西地酸、盐酸胍、氯化锂、十四烷硫酸钠、D-丝氨酸、万古霉素、醋竹桃霉素、利福霉素SV、丁酸钠、溴酸钠、4% NaCl、8% NaCl敏感，对1%乳酸钠、萘啶酸、亚碲酸钾、1% NaCl、氨曲南不敏感，能够在pH5.0、pH6.0环境下生长。
（3）16S rRNA序列分析和***发育树的构建
利用细菌16S rRNA通用引物：
正向引物27F：5'-AGAGTTTGAT
CCTGG CTCAG-3'，
反向引物1492r：5'-GGTTACCTTG
TTACGACTT-3' 扩增目的基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以分离株 JSSW-LA-07-1的基因组DNA为模板，PCR反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性45 s、55℃ 45 s、72℃ 1 min，30个循环；72℃修复延伸10 min。取5 μL产物在含goldview染色剂的1% 琼脂糖凝胶上电泳，150V、100mA、20min。电泳结束后将凝胶放入凝胶成像***，观察结果。PCR扩增产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。菌株JSSW-LA-07-1的16S rRNA基因序列为SEQ ID NO: 1。
将菌株JSSW-LA-07-1的16S rRNA基因序列与从GenBank中已知的核酸序列进行Blast分析，挑选同源性较高的序列在Cluster
X软件完成序列比对，比对结束后使用MEGA 4.1软件构建***发育树。
菌株JSSW-LA-07-1基因序列测序结果16S rRNA 基因长度为1466 bp，将菌株所扩增的16S rRNA基因序列在NCBI通过Blast进行同源性检索，结果检索出为芽孢杆菌属的16S rRNA基因序列，采用邻接法构建菌株分子发育树，分离菌株在***发育树上与凝结芽孢杆菌（Bacillus
coagulans）(登录号：KM096994.1)属同一支，同源性达99%以上（见图1）。结合形态学和生理生化特征将所分离菌株鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus
coagulans）。
实施例3：抑菌性测定
将无菌滤纸片在浓度为1.0×107
CFU/mL凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1新鲜培养液中浸泡1.0 h。取浓度为5.0×106 CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、溶藻弧菌的液体培养液0.1 mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡过菌液的滤纸片贴于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于28 ℃培养箱中24、48 h，测量抑菌圈大小。测定结果如表1所示：
表1凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1抑菌性测定结果(抑菌圈直径：mm)
注：“-”表示无抑菌圈，纸片直径为7.00
mm。
由表1可知，凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌均具有一定的拮抗作用，其中对温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果最显著。
实施例4：凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的制备
菌株JSSW-LA-07-1活化后经发酵培养得到的发酵液，经10000rpm高速离心发酵液收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2～10进行混合，在30～50℃下低温干燥20～24h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂浓度不低于5.0×108个（CFU）/克。
实施例5：凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的养殖应用
试验用异育银鲫幼鱼采用循环流水控温***进行养殖。试验选择健康、规格、重量基本一致的异育银鲫，初始体重为（17.7±0.07）g的异育银鲫随机分为3组，每组3个平行，每个平行30尾鱼。对照组饲喂基础日粮为鲫鱼商品料，由通威公司提供（表2）。试验日粮为基础日粮分别添加1.0～5.0mg •kg-1凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂（实施例4中制备）。
饲养管理：试验前，先用基础饲料驯养2周后进行正式试验。试验期间，每天投喂2次（8:00-8:30，15:30-16:00），直至表观饱食为止，日投饵量为鱼体重的3 %-4 %，并且根据生长和摄食的情况作适当调整。每日定时测定水温、pH、氨氮、溶氧，养殖期间水温为26.5℃左右，pH7.6~7.8，溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0.01 mg/L。待投喂试验日粮45d时称重等。
表2 异育银鲫基础日粮
表3 饲喂凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂对异育银鲫幼鱼生长性能的影响（n=3）
注：同一行数据中有不同字母表示差异显著 ( P<0.05)。
45d养殖结果表明：与对照组相比，在基础日粮中添加凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂能够显著提高鱼体的增重率、特定生长率（P<0.05）,并能够显著降低饵料系数（P<0.05），存活率、肝体比、肥满度无显著差异（P>0.05），结果表明摄食凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂能显著提高异育银鲫的生长。
实施例6：凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂净化水质方面的应用
随机选取养殖青鱼池塘6个，3个为试验组，3个为对照组。试验组为按
50g/亩•米的用量全池泼洒凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂，使进入水体中的凝结芽孢杆菌起始菌浓约为102-103CFU/mL，连续泼洒一周。对照组为不泼洒凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂。试验周期为1周，试验前、后分别采样，检测各项水质指标。
表4 凝结芽孢杆菌对养殖青鱼池塘水质的影响
注：同一行数据中有不同字母表示差异显著 ( P<0.05)。
从表4中可以看出，试验组各项水质指标较试验前均显著降低（P<0.05），且明显低于对照组(P<0.05)。因此，可以说明凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂能够有效降低水体中的污染物含量，改善养殖水质，能够作为水质净化剂应用于水产养殖。
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 菌株JSSW-LA-07-1的16S rRNA基因序列
<400>1
tatacatgca gtcgtgcgga
ccttttaaaa gcttgctttt aaaaggttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggcaac
ctgcctgtaa gatcgggata acgccgggaa accggggcta 120
ataccggata gttttttcct
ccgcatggag gaaaaaggaa agacggcttc ggctgtcact 180
tacagatggg cccgcggcgc
attagctagt tggtggggta atggctcacc aaggcaacga 240
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gtgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc 300
tacgggaggc agcagtaggg
aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360
cgtgagtgaa gaaggccttc
gggtcgtaaa actctgttgc cggggaagaa caagtgccgt 420
tcgaacaggg cggcgccttg
acggtacccg gccagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480
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tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg 540
caggcggctt cttaagtctg
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aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
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gtggcgaagg cggctctctg gtctgtaact gacgctgagg 720
cgcgaaagcg tggggagcaa
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
agtgctaagt gttagagggt
ttccgccctt tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840
gcctggggag tacggccgca
aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
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tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960
ctgacctccc tggagacagg
gccttcccct tcgggggaca gagtgacagg tggtgcatgg 1020
ttgtcgtcag ctcgtgtcgt
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ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga 1140
aggtggggat gacgtcaaat
catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1200
tggatggtac aaagggctgc
gagaccgcga ggttaagcca atcccagaaa accattccca 1260
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cccgcctgca tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc 1320
agcatgccgc ggtgaatacg
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag 1380
tttgtaacac ccgaagtcgg
tgaggtaacc tttacggagc cagccgccga aggtgggaca 1440
gatgattggg gtgaagtcgt
aacaag 1466
Claims (3)
1.一株具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus
coagulans) JSSW-LA-07-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC
No. 10182。
2.一种凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的制备方法，其特征在于以凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1为出发菌株，菌株JSSW-LA-07-1活化后经发酵培养得到的发酵液高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2-10进行混合，在30-50℃下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，获得的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂，浓度不低于5.0×108 CFU/克。
3.用权利要求2所述方法制备的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的应用，其特征在于：用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1.0-5.0mg •kg-1的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂；用作水产养殖水质改良剂，按50-200g/亩•米的用量全池泼洒凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂。
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