CN105521485A - 脱铁乳铁蛋白组合物及其用于治疗病毒性丙型肝炎的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学，特别涉及肝脏病学和病毒学，并可以用于治疗患有病毒性丙型肝炎(包括其慢性形式)的患者，甚至直到使其完全康复。所述发明提供用于治疗病毒性丙型肝炎，呈单体乳铁蛋白脱辅基蛋白形式的药剂。本发明也涉及用于治疗病毒性丙型肝炎的药物组合物，其包含有效量的单体乳铁蛋白脱辅基蛋白和药用可接受的载体、填充剂或赋形剂。本发明也涉及用于治疗病毒性丙型肝炎的方法(包括给予所述单体乳铁蛋白脱辅基蛋白)，并且涉及将所述单体乳铁蛋白脱辅基蛋白用于制备用于治疗病毒性丙型肝炎的药剂。本发明方法可以在2-3周治疗期间内完全预防病毒血症，预防感染病毒性丙型肝炎的肝细胞被破坏从而预防附加的病毒散发至血***，并且使程序性细胞死亡病毒感染的肝细胞不存在，由此预防肝功能病、硬化和主要疾病发展的末期阶段的肿瘤学肝感染的发展。

Description

脱铁乳铁蛋白组合物及其用于治疗病毒性丙型肝炎的方法
技术领域
本发明涉及医学，特别涉及肝脏病学和病毒学，并且涉及乳铁蛋白在治疗由丙型肝炎病毒(HCV)引起的慢性感染中的用途。更特别地，本发明提供包含脱铁乳铁蛋白(apolactoferrin)和干扰素的药物组合物，以及使用这些组合物治疗由丙型肝炎病毒引起的慢性感染的方法。
背景技术
HCV属于含有RNA的病毒家族(黄病毒科(Flaviviridae))，并且导致人的感染过程，肝炎是最常见的并发症，经常发展成肝硬化和肝癌(Surveillance.Hepatitis.CDCReport№61；YounossiZ，KallmanJ，KincaidJ.TheeffectsofHCVinfectionandmanagementonhealth-relatedqualityoflife.Hepatology.2007Mar；45(3)：806-16)。HCV感染在全球已经影响了超过170百万人，并且被感染的数量持续增加。在全世界中，有约1.5百万HCV-相关的肝癌的病例。仅在美国，每年HCV感染导致的损失估计是200百万(USD)。
在总体大部分的病例中，感染HCV的人不经历任何严重健康问题或显示非常轻度症状。但是，当感染长时间发展时，肝炎的发生是常见的，其特征是疼痛和肝功能障碍。抗HCV抗体出现在已被感染的人的血中，并且在一段时间之后，也出现病毒的RNA。在大部分病例中，在血中检测不到病毒的RNA。
HCV具有抑制人免疫***的强大能力和由于“适应性”突变而逃避它的能力。目前没有商业上可获得的针对HCV感染的疫苗。
治疗HCV的方法已经和依然基于使用大剂量给予的干扰素，特别是，基因工程干扰素制剂(ShepherdJ，JonesJ，HartwellD，DavidsonP，PriceA，WaughN.Interferonalfa(pegylatedandnon-pegylated)andribavirinforthetreatmentofmildchronichepatitisC:asystematicreviewandeconomicevaluation.HealthTechnolAssess.2007Mar；11(11):1-224；YounossiZ，KallmanJ，KincaidJ.TheeffectsofHCVinfectionandmanagementonhealth-relatedqualityoflife.Hepatology.2007Mar；45(3):806-16)。但是，根据不同来源，基于基因工程干扰素的治疗方法具有相对低的功效，其范围是8至25％。这种治疗的持续时间可以达到若干年，并且复发频率包括70-80％。此外，使用基因工程干扰素具有严重副作用，其包括造血功能不全、胃肠失常、脱发、抑郁和失眠。
广泛传播的治疗HCV的现代趋势是使用综合治疗，其将含有一般抗病毒药和1或2种HCV增殖抑制剂(特异性聚合酶-解旋酶和/或RNA-聚合酶抑制剂)的鸡尾酒加入基因工程干扰素(ToniuttoP，FabrisC，BitettoD，FornasiereE，RapettiR，PirisiM.Valopicitabinedihydrochloride:aspecificpolymeraseinhibitorofhepatitisCvirus.CurrOpinInvestigDrugs.2007Feb；8(2):150-8；JohnsonCL，OwenDM，GaleMJr.FunctionalandtherapeuticanalysisofhepatitisCvirusNS3.4Aproteasecontrolofantiviralimmunedefense.JBiolChem.2007Apr；282(14):10792-803)。这种鸡尾酒增加康复比率，但是，它们不可避免地导致选择耐受这些抑制剂的HCV适应性突变体。已经在克服人免疫缺陷病毒的过程中明显显示出这些临床问题，并且明显地对于HCV也将至少实际出现这些问题。
由于基于重组干扰素和病毒酶抑制剂的治疗的缺陷，寻找有效对抗HCV的制剂已经和依然是重要任务。对于这个目的来说，发展基于与其它抗病毒药组合的干扰素的新组合的治疗方法似乎是有前景的。
乳铁蛋白是天然结合铁的蛋白，存在于泪液、唾液、外周血中，特别是在白细胞、母乳、初乳、腺上皮分泌物等中。每分子乳铁蛋白能够结合2个Fe原子。目前科学和专利文献中没有关于乳铁蛋白分子量数值的一致观点。因此，乳铁蛋白被认为具有约80000Da的分子量(参见，例如，EP0253395B2)。同时在文献中有牛乳铁蛋白分子量值，例如76000Da(FarrellH.M.，Jr.，等人，NomenclatureofProteinsofCows’Milk–SixthRevision.J.DairySci.(2004)，v.87，p.1641-1674)，86000Da(KazutomoImabori和TamioYamakawa，Eds.，“DictionaryofBiochemistry”，第2版，p.1390，TokyoKagakuDojinCo.，1990)以及甚至93000Da(WeinerR.E.和SzuchetS.Themolecularweightofbovinelactoferrin.Biochim.Biophys.Acta(1975)，v.393(1)，p.143-147)。来自人母乳的蛋白提供的分子量值是，例如76000Da(MoguilevskyN.，等人，Comparisonofhumanlactoferrinsfrommilkandneutrophilicleucocytes.Biochem.J.(1985)，v.229，p.353-359)和88000Da(KazumotoImabori和TamioYamakawa，Eds.，“DictionaryofBiochemistry”，第2版，p.1390，TokyoKagakuDojinCo.，1990)。提供的分子量值中的差异可能由使用的不同分析的方法，以及蛋白糖基化的不同程度和/或性质导致。
乳铁蛋白和其衍生物具有显著抗氧化、抗微生物(J.Pediatr.，1979，v.94，P.1)、免疫调节和抗肿瘤作用。
存在使用乳铁蛋白或其片段治疗病毒疾病，特别是，由流感病毒、人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒和其它病毒导致的病毒疾病的方法。乳铁蛋白用作干扰素在慢性丙型肝炎中的治疗效果的增强剂(专利申EP1352657，15.10.2003)。尽管该文献包括广泛的概括，其允许思考为了增强干扰素的治疗效果，并且因此为了成功实现声称的治疗慢性丙型肝炎的方法，可以使用任何形式的乳铁蛋白，包括未用金属饱和的乳铁蛋白、用不同金属饱和的乳铁蛋白和适当的脱铁乳铁蛋白，并且它可以口服或注射给予，该文献提供了试验数据，证实了仅仅口服给予仅仅使用天然乳铁蛋白的可能性。该文献证实了与给予干扰素共同大剂量口服给予乳铁蛋白(每日至少1mg/1kg重量，特别是，每日1.8g/1kg重量，持续6个月)导致阳性治疗效果。但是，不能认为得到的结果完全令人满意，因为在疗程结束之后6个月，仅仅在33.3％病例中记录到病毒完全根除和肝功能正常化，并且在剩余的66.7％的病例中，治疗根本无效或自从在疗程结束之后6个月起病毒在血中再次出现，尽管事实上，观察到肝功能正常化。
因此，在这个领域，急切需要用于治疗病毒性丙型肝炎的新药物治疗以及药物组合物和治疗方法，基于它们，可以兼有以下特点：高功效，特别是，完全根除病毒和预防所述疾病复发的能力，低的花费，保存稳定性和比使用现有治疗方法和方案更快达到治疗效果的可能性。
发明概述
发明人意外发现如下事实：给予基本上不含有结合的Fe离子的乳铁蛋白(脱辅基蛋白)治疗病毒性丙型肝炎极其有效，从而使本发明成为可能。
因此，在第一方面，本发明涉及包人乳铁蛋白和干扰素的组合物，其中所述乳铁蛋白基本上不含铁，并且其中所述组合物基本上不含非人乳铁蛋白。
在本发明的组合物的一个实施方案中，人乳铁蛋白具有小于约5％的铁饱和度。
在根据本发明的组合物的另外其它实施方案中，人乳铁蛋白具有约80kDa的表观分子量。
在组合物的一个实施方案中，人乳铁蛋白以约20mg的量存在。
在另外其它实施方案中，本发明的组合物适于治疗HCV感染。在实施方案之一中，HCV感染是慢性HCV感染。在另一个实施方案中，HCV属于1b基因型。
在另外一个实施方案中中，本发明的组合物能够从患者身体消除HCV，持续比3个月更长的时期。
在另一方面，本发明涉及治疗感染HCV的患者的方法，其包括将以下物质引入所述的患者:
a.组合物，其包含人乳铁蛋白，其中所述的乳铁蛋白基本上不含铁，并且其中所述的组合物基本上不含非人乳铁蛋白；以及
b.干扰素。
在本发明方法的一个实施方案中，人乳铁蛋白具有小于约5％的铁饱和度。
在本发明方法的另外一个实施方案中，人乳铁蛋白具有约80kDa的表观分子量。
在方法的另一个实施方案中，人乳铁蛋白在组合物中以约20mg的量存在。
在本发明方法的另外一个实施方案中，使患者接受针对慢性感染HCV的治疗。在本发明方法的另外一个实施方案中，HCV属于1b基因型。
在本发明方法的其它实施方案中，从患者身体消除HCV，持续比3个月更长的时期。
在其另一方面，本发明涉及用于治疗HCV感染的药盒(kit)，其包括:
a.在其中具有治疗有效量的人乳铁蛋白的第一容器，其中所述乳铁蛋白基本上不含铁；
b.在其中具有治疗有效量的干扰素的第二容器。
在根据本发明的药盒的实施方案之一中，第一容器基本上不含非人乳铁蛋白。
在药盒的另外一个实施方案中，人乳铁蛋白具有小于约5％的铁饱和度。
在药盒的其它实施方案中，人乳铁蛋白具有约80kDa的表观分子量。
在根据本发明的药盒的实施方案之一中，人乳铁蛋白在组合物中以约20mg的量存在。
在其它实施方案中，意欲将药盒用于治疗属于慢性感染的HCV感染。
在其它实施方案中，意欲将药盒用于治疗由具有1b基因型的病毒导致的HCV感染。
上述类别的发明目标是响应于制备低花费制剂的统一的挑战，所述制剂总体上对人身体具有抗病毒(丙型肝炎)的作用。
所述制剂在药物实践中的临床使用和其给药方法允许得到许多技术、医疗和经济效果:
1.制剂是与人身体生物学兼容的，并且它在治疗上对治疗慢性病毒性丙型肝炎高度有效，它可以与给予干扰素组合，并且可以与化学治疗组合。
2.可以基于所述制剂制备必需浓度的药物。
3.制剂易于保存和运输。
4.以所述制剂为基础的药物可以静脉内给予至人身体。
5.制剂是支付得起的，其在医疗实践中的使用经证明是经济的。
6.为了治疗慢性病毒性丙型肝炎，给予与干扰素和化学治疗组合的所述制剂，与使用治疗慢性病毒性丙型肝炎的已知方案相比，允许在短得多的时间内(快10-20倍)达到持续的抗病毒效果。
7.制剂明显增强已知用于慢性病毒性丙型肝炎的治疗方案的功效，将完全康复的时间减少至2-3周的疗程。
附图简述
图1描述了在变性的条件下通过SDSPAGE分析人乳铁蛋白不同样品的纯度的结果。泳道A是分子量标记物，泳道B是人乳铁蛋白的标准样品，泳道1-3是人乳铁蛋白的样品(商业上可获得的Laprot的制剂)，泳道4-13是人乳铁蛋白脱辅基蛋白的样品。
图2描述了通过HPLC色谱分析人乳铁蛋白(商业上可获得的制剂Laprot)的结果。
图3描述了通过HPLC色谱分析人乳铁蛋白的结果。
发明的实施方案
将参照本发明优选的实施方案详细描述本发明。尽管描述了优选的实施方案，但是应明确的是，本发明不限于它们。相反的是，可以预见的是本发明包括可代替的实施方案、修饰的实施方案和等价的实施方案，考虑到本发明通过权利要求定义的精神和范围，所述实施方案可以包括在本发明中。
定义
表达“基本上不含铁”意指具有小于约5％的铁饱和度的乳铁蛋白组合物，但是，本发明也构思了更高铁饱和度，包括但不限于5％至20％。
表达“小于约5％”意指具有不超过6％，例如，5.9％的铁含量的乳铁蛋白组合物。
短语“以约___mg/μg的量存在”意指在治疗HCV中有效的乳铁蛋白的量。该量包括，但是不限于至多15％大于或小于___mg/μg的量。
优选给予包含在药物组合物中的本发明制剂，所述组合物包含治疗有效量的作为活性成分的基本上呈具有约80000道尔顿摩尔重量的脱辅基蛋白形式的乳铁蛋白和药用可接受的载体、填充剂或赋形剂。如本文使用的，短语“约80000道尔顿”意指小于或大于80000道尔顿至多15％的重量。“药用可接受的载体、填充剂或赋形剂”意指对被给予的患者不产生任何不期望的副作用的载体、填充剂或赋形剂。这些药用可接受的载体、填充剂或赋形剂在本领域中是众所周知的(参见，例如Remington’sPharmaceuticalSciences，第18版，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishingCompany，1990；PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，TaylorandFrancis，2000；andHandbookofPharmaceuticalExcipients，第3版，A.Kibbe，Ed.，PharmaceuticalPress，2000)。
药用可接受的载体、填充剂或赋形剂的实例包括(但是不限于)缓冲剂、保持等渗的试剂、防腐剂、表面活性物质(离子型和非离子型)、填充剂、稳定剂等。
使用众所周知的技术，可以将乳铁蛋白的脱辅基蛋白包括在本发明的药物组合物中。用于将上述蛋白包括入组合物的适合技术描述于，例如在Remington’sPharmaceuticalSciences，第17版(MackPubl.Co.，Philadelphia，PA，1985)中。
可以单独给予本发明的药物组合物，或将药物组合物与一种或多种其它治疗剂组合给予。这些药剂可以与脱铁乳铁蛋白包括在相同的组合物中，或它们可以存在于单独的组合物中，例如，在药盒中。
在某些实施方案中，本发明的组合物包含治疗有效量的脱铁乳铁蛋白以及干扰素。干扰素适于在本发明中使用，可以采用的形式是当根据例如在本发明中公开的方法注射时，提供治疗效果的任何形式。在本发明的非限制性实施方案中，本发明的脱铁乳铁蛋白组合物可以与干扰素α-2联合制备，或可以与干扰素α-2组合引入。
本发明的药物组合物可以制成多种药物产品，例如溶液、乳液、用于临时溶解的冻干粉末。特别地，本发明中的脱铁乳铁蛋白药物组合物可以冻干或稳定溶解的产品形式存在。可以通过使用本领域已知的多种方法制备冻干产品。如技术人员所知的，该产品长时间为组合物提供稳定性。制备液体稳定的组合物的优势在于使用简便和在紧急情况中起效更快，这可以潜在地挽救患者生命。液体组合物也可以是冷冻的，因此，先决条件是在将它给予患者之前将其直接解冻。
在患者状况、并发疾病的存在、临床可行性的指导下，同时考虑关于医疗制剂相容性的已知信息，本领域技术人员，例如主治医师，可以开出附加的药物或非药物治疗的处方。
可以通过提供针对HCV感染(包括慢性HCV感染)的治疗效果的任何途径给予本发明脱铁乳铁蛋白组合物。例如组合物可以肠胃外给予，例如静脉内给予、动脉内给予、腹膜内给予、肌内给予或通过上述途径的任何组合给予。优选静脉内给予本发明的药物组合物。这种用于静脉内给药的组合物可以呈溶液、悬浮液、水包油类型的乳液、油包水类型的乳液、脂质体悬浮液的形式。可以将例如等渗0.9％盐水溶液(生理盐水溶液)、5％葡萄糖(右旋糖)溶液、甘露醇溶液等的众所周知的药用可接受的溶剂用作用于制备用于静脉内给药的溶液的溶剂。如果需要，所述溶液还可以包含辅助成分，例如稳定剂、表面活性物质、抗微生物剂(防腐剂)等。
制备用于肠胃外给药的无菌无热原溶液技术是本领域技术人员熟知的，并且前提是使用无菌无热原水和对得到溶液进行灭菌，例如使所述溶液过滤通过例如具有0.4微米尺寸的孔的除菌过滤器。
在本发明非限制性实例之一中，在治疗慢性HCV中，静脉内给予人脱铁乳铁蛋白。在治疗方案的第一和第二天中，以每2小时20mg的剂量静脉内注射组合物。从方案的第3天至第7天，以20mg的每日剂量注射脱铁乳铁蛋白组合物。在借助体外解毒方法的情况下，从第3天至第7天也给予高剂量的干扰素(例如干扰素α-2)。
试验和临床数据显示，当以乳铁蛋白为基础的药物的低级剂量无效并且更高剂量可以导致严重不良反应时，存在人乳铁蛋白的限制剂量(单次和疗程剂量)。已声称用于静脉内给药的药物的单次和疗程剂量，所述药物基于含有人脱铁乳铁蛋白的制剂，所述剂量有利于治疗慢性病毒性丙型肝炎。
不意欲被任何科学原理或学说限制，本发明人将当使用脱铁乳铁蛋白用于治疗病毒性丙型肝炎时观察到的明显肝保护效果与以下事实联系:被丙型肝炎病毒感染的细胞在脱铁乳铁蛋白的影响下以程序性细胞死亡而不是以坏死的方式结束它们的生命，这预防更多新部分的病毒散发进入全身性血循环。
给予乳铁蛋白脱辅基蛋白的优选方式是静脉内，这提供在未改变的条件下快速和有目的的将脱铁乳铁蛋白运输至靶器官(肝)，因此，保证活性成分在肝中最大程度的蓄积。
在本研究上下文中，术语“治疗有效量"意指在治疗疾病方面将保证期望的效果的药物的量。特别地，治疗有效量必须能够预防和消除被治疗的疾病的严重性或扩散。期望的效果可以是在患者血中降低病毒的颗粒滴定度或为从血循环完全消除病毒，为肝保护功能等。最期望的治疗效果是从患者身体完全根除导致病毒性丙型肝炎的生物体。
当考虑变量，例如患者重量和年龄、一般健康状况、主要疾病的严重性、并发疾病的存在等时，本领域技术人员可以个体化确定治疗有效量。本领域技术人员也可以常规地确定给药方案，包括用于本发明这种药物治疗的成分的剂量、给药方法和频率、疗程持续时间，并且如果需要，在考虑试验室研究数据、临床观察、症状动力学等的情况下，可以在治疗过程中纠正给药方案。
可以从人初乳、头乳或乳和其它人生物学物质提取人乳铁蛋白，以及通过基因工程或转基因方法得到人乳铁蛋白。可以通过脱盐和阳离子交换色谱法从人乳血清提取乳铁蛋白，如在1990年3月1日的USSR专利No.1709606中描述的。也存在已知的通过渗滤-超滤从人乳提取乳铁蛋白的方法(申请WO89/11226，1989年11月30日的国际公开文本)。描述了通过在具有固定的针对人乳铁蛋白的单克隆抗体的柱上的亲和色谱法，从人乳一步纯化乳铁蛋白的方法(专利JP60100019，1985年8月29日)。所有列举的方法以及其它方法可以成功地用于得到天然的乳铁蛋白(呈含有结合的铁的全蛋白形式)。
不仅在乳腺中，也在其它组织中观察到编码人乳铁蛋白的基因的表达。例如，描述了在精囊中编码乳铁蛋白的mRNA的序列(GenBankAccNo.AAN75578)。从人骨髓克隆乳铁蛋白基因，其是交替接合的变体(GenBankAccNo.AAR12276)。也公开了大量来自乳腺的人乳铁蛋白基因的核苷酸序列和它们相应的氨基酸序列，其在特定氨基酸残基上具有某些差异(参见，例如，(GenBankAccNos.AAA59511，AAB60324，AAG48753)。此外，描述了大量多态性，例如在外显子1人乳铁蛋白基因中的点-核苷酸多态性，其导致乳铁蛋白N末端区域的29位置的Lys/Arg多态性(参见VelliyagounderK等人，Infect.Immun.，2003，71(11)：6141-6147)。因此，在本发明框架之内适用的是人乳铁蛋白，其与提供的人乳铁蛋白的序列(例如，在GenBank中以登录号Acc.No.AAA59511保藏的序列)具有至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，和最优选至少99％氨基酸序列同源性。
考虑到不可能以工业规模得到天然人乳铁蛋白的事实，重组人乳铁蛋白适用于实现本发明。人乳铁蛋白基因的序列是已知的，例如，已知于申请WO92/21752(1992年12月10日)的国际公开文本，并且也参见上文提及的在GenBank中保藏的序列。已描述了表达用于这种目的的重组人乳铁蛋白和质粒结构的技术(例如专利US6,277,817，2001年8月21日)。非常有吸引力的制备重组人乳铁蛋白方法是在植物细胞培养物中(申请US2004040062)或在甲基营养性酵母巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中(申请WO01/32895的国际公开文本，2001年5月10日)的表达方法。也认为使用从转基因动物(例如奶牛)的乳得到的人乳铁蛋白在本发明框架之内。已描述了通过在山羊乳腺中表达人乳铁蛋白的高度有效的制备方法，其硬膜内注射重组复制缺陷性腺病毒(HanZ.S.，等人，High-levelexpressionofhumanlactoferrininthemilkofgoatsbyusingreplication-defectiveadenoviralvectors.ProteinExpr.Purif.(2007)，v.53(1)，p.225-231)。
所述的制剂和所有较早已知含有乳铁蛋白的药物之间的主要显著差异在于以下事实：由于包括在制剂组合物中的乳铁蛋白的高纯化程度，得到最大浓度的一种同工型(具有约80k道尔顿的表观分子量)的脱铁乳铁蛋白，最具活性的抗病毒药剂，因此，保证其可靠性和其用于治疗方法的安全性。
制剂中乳铁蛋白的所述浓度允许长时间以其天然状态保存乳铁蛋白，这是处于最大程度的生理学活性的状态。
进一步给出的实施例公开了实现本发明的最优选方法，并且给出它们仅仅为了更好解释其本质。在没有偏离超出本发明框架的情况下，任何本领域技术人员将理解在使用的物质和使用的方法方面可能存在很多修饰。
实施例1.–比较分析不同的人乳铁蛋白制剂
根据下列参数评价各样品:
1)人乳铁蛋白蛋白的含量。
2)用铁饱和乳铁蛋白的程度
3)乳铁蛋白结合铁的能力
4)在存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下，借助在聚丙烯酰胺凝胶中的变性电泳评价人乳铁蛋白纯度。
5)借助高效液相色谱法(HLPC)评价人乳铁蛋白纯度。
样品:
样品编号 制剂
1-3 冻干人乳铁蛋白的商业化的Laprot制剂
4-13 浓度为20mg/ml的人脱铁乳铁蛋白
样品中乳铁蛋白蛋白含量
从P.A.GertsenMoscowResearchOncologyInstitute得到“Laprot”制剂。Laprot制剂(样品1-3)中乳铁蛋白蛋白含量变化范围是2.7至3.3mg/10mg冻干制剂。
通过用硫酸铵盐析和根据之前描述的方法(USSR专利No.170960601.03.1990)的具有某些改进的阳离子交换色谱法，从人乳血清得到脱铁乳铁蛋白蛋白(样品4-13)。在25mm直径的柱上，采用50ml体积的阳离子交换剂实施阳离子交换色谱法。将ToyoperlCM-650S(TosoHaaspart#43253)用作阳离子交换剂。流速30ml/小时，蠕动泵Microperpex(Pharmacia)。通过UvicordSII(Pharmacia)检测器在洗脱液中检测蛋白，通过Multirak(Pharmacia)级份采集器采集级份。
根据附于所述设备的说明书，使用一系列在血清“乳铁蛋白-ELISA-Best”D-4156(ZAO“载体-Best”)中用于免疫酶测定乳铁蛋白的试剂，测定溶液中乳铁蛋白浓度。采用Excel程序，使用二度的多项式近似法计算结果。
此外，在具有1cm长光学泳道的池中，采用Ultrospec11分光光度仪，通过分光光度法测定乳铁蛋白浓度。通过下式确定制剂中乳铁蛋白浓度：浓度(mg/ml)＝A280/1.27，如EP0253395B2中所述。
样品4-13中脱铁乳铁蛋白蛋白含量变化范围是15.2至20.0mg/1ml溶液。
人乳铁蛋白的铁饱和度
通过分光光度方法，通过比率A465/A280测量人乳铁蛋白的铁饱和度。表1显示所有受试样品的铁饱和度(％)。
表1.不同样品的人乳铁蛋白的铁饱和度。
样品 铁饱和度的％
1 25
2 32
3 39
4 3.7
5 3.6
6 3.4
7 3.9
8 5.1
9 3.5
10 3.9
11 4.2
12 4.6
13 3.5
因此，对于商业制剂Laprot(样品1-3)，乳铁蛋白的铁饱和度在25至39％的宽范围内变化。这种铁饱和度的水平对应于天然人乳铁蛋白的平均饱和度水平。
相对比的是，脱铁乳铁蛋白制剂显示铁饱和度在3.4至5.1％之间变化。
人乳铁蛋白对铁的亲和力
当以硫酸铵-铁的浓溶液形式添加铁离子时，含有不同量的人乳铁蛋白的所有样品显示100％的乳铁蛋白被铁离子饱和。
通过在聚丙烯酰胺凝胶中的变性电泳(PAGE)技术，评估人乳铁蛋 白制剂纯度。
LaemmliU.K描述了在***中存在十二烷基硫酸钠(SDS)的情况下，通过PAGE，分析样品(CleavageofthestructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofthebacteriophageT4.Nature(1970)，v.227，p.680-685)。为了实施测定，将20μg的人乳铁蛋白、样品编号1-3(Laprot)和10μg的人乳铁蛋白、样品编号4-13用于泳道。
需要大量用于实施所述测定的人乳铁蛋白以评价人乳铁蛋白的可能分解产物，主要因为冻干样品显示比预期低得多的人乳铁蛋白浓度。
得到的信息显示在图1中。所有样品具有清楚被标记的主带，其对应于80,000道尔顿的表观分子量。特别是，所有No.4-13样品显示存在具有80,000道尔顿的分子量的蛋白，以及非显著量的其它蛋白，其似乎是人乳铁蛋白的分解产物。
另一方面，No.1-3样品(商业上可获得的制剂Laprot)显示一个对应于的表观分子量80,000道尔顿的主带，并且还存在对应于75,000和70,000道尔顿的2个较小带。这2个带之一也存在于用作参照样品的乳铁蛋白中。
通过高效液相色谱法方法(HLPC)评估人乳铁蛋白制剂纯度
为了测定蛋白的纯度和测定可能的混合物，使用高效液相色谱法测试来自各样品的50μg的人乳铁蛋白。
所有No.1-3样品的色谱图是相同的。得到的No.1样品的典型色谱图显示在图2中。
所有呈溶液的形式的No.4-13样品的色谱图是相同的。得到的No.13样品的典型色谱图显示在图3中。
1-13样品的高效液相色谱法结果显示，任何样品中不存在人乳铁蛋白的分解产物。
实施例2.在静脉内给予人乳铁蛋白中的临床经验
以单一治疗的形式或与干扰素、长效干扰素、利巴韦林和细胞生长抑制剂组合，与体外解毒方法组合给予人乳铁蛋白制剂。
病例研究1
患者G.A.L.，30岁男性。经诊断患有乙型肝炎+丙型肝炎的组合。根据聚合酶链反应，初始病毒血症高(>100,000IU/ml)。根据记载的数据，疾病持续5年。但是，通过病例历史数据判断，可以推断疾病的实际持续时间是约14年。
在住院病人诊所中治疗患者。尝试在使用每隔一天3百万单位的Reaferon治疗的背景下，给予脉冲剂量的500mg的脱铁乳铁蛋白。这种给药方法在病毒血症水平或在生化指标方面没有产生任何变化。在治疗开始之后7-9天中，观察到卡他性疾病的恶化。在没有干涉主要疾病的治疗过程的情况下，这些卡他性现象自然消除和消失。
之后使用2小时给药方案，每2小时20mg，持续10小时。作为连续使用这种技术两天的结果，在初步长期使用Reaferon治疗的背景下，消除了丙型肝炎病毒。同时，不再检测到乙型肝炎病毒，但是，在一周后，已经再次检测到相同水平的病毒。在使用Reaferon治疗的背景下，在下一个3月中或在下一个9、18、27和36个月这种治疗结束之后没有检测到丙型肝炎病毒，这通过对照测试得到证实。根据标准方案完成乙型肝炎治疗，并且该治疗仅仅在1年之后成功地结束。
病例研究2
患者K.V.A，21岁男性。经诊断患有由1B病毒基因型引起的丙型肝炎。根据聚合酶链反应，初始病毒血症高(>100,000IU/ml)。根据记载的数据，疾病持续3年。但是，通过病例历史数据判断，可以推断疾病的实际持续时间是其两倍长。
根据采用每周一次的周期的方案进行治疗，其中在脱铁乳铁蛋白给予期间不给予Reaferon，并且在给予脱铁乳铁蛋白之间的一周间隔期间内以3百万单位的剂量施用Reaferon两次。在治疗开始之后7-9天中，观察到卡他性疾病的恶化。在没有干涉主要疾病的治疗过程的情况下，这些卡他性现象自然消除和消失。
病毒消除发生在综合治疗(脱铁乳铁蛋白、Reaferon、HDF)的第3周。在完成治疗之后的6、16、23和30个月中，得到关于在所述患者的血中稳定不存在病毒的试验室信息。
病例研究3
患者Sh.A.A.，29岁男性。经诊断患有由基因型2a病毒引起的丙型肝炎，在预防性检查期间以3×104IU/ml的滴定度被偶然发现。根据记载的数据，疾病持续2个月，但是，丙型肝炎临床现象的历史是约2年。
改变治疗，通过7天方案结合Reaferon和体外解毒方法给予人乳铁蛋白脱辅基蛋白制剂。自从治疗开始，在血中没有检测到生化学障碍，胆红素和肝酶保持在正常限度之内。
在综合治疗的第3周结束时，观察到病毒的消除。在6、12、24和33个月之后，在对照研究中，在血中没有病毒。
病例研究4
患者S.L.G.，37岁男性。经诊断患有由基因型1b病毒引起的丙型肝炎，在预防性检查期间以428000IU/ml的滴定度被发现。疾病持续1年。无肝炎的临床迹象。无主诉。生化学测试是正常的。以7天方案，在2个阶段中，实施人脱铁乳铁蛋白与reaferon、利巴韦林、拉米夫定和体外解毒方法组合的组合给药。在第一阶段的第3周结束时，观察到HCV滴定度减少至500IU/ml。这显著增加上述正常肝酶和血中胆红素，存在免疫抑制的迹象。因此，在停止治疗一周之后，采用减少剂量的利巴韦林和拉米夫定进行相同方案的完整治疗的第二阶段。到第二阶段治疗的第一周结束为止，观察到病毒的消除。下一个13个月的对照研究没有显示在血中存在病毒。生化指标也是稳定的。
病例研究5
患者S.S.B.，47岁男性。经诊断患有由基因型2A病毒引起的丙型肝炎。病毒血症高，2.2×105IU/ml。在血液化学中酶有10倍增加，伴随胆红素适度增加至正常值的上限。根据记载的数据，疾病持续0,5年。但是，通过病例历史数据判断，可以推断疾病的实际持续时间更长得多，约3年。
改变治疗。每日以40mg的剂量给予人乳铁蛋白脱辅基蛋白制剂，持续3天，然后以20mg的剂量给予人乳铁蛋白脱辅基蛋白制剂，持续4天。然后实施一周间隔，接着进行脱铁乳铁蛋白治疗的第二疗程，其中每日给予40mg的所述制剂。基于所述制剂具有免疫抑制作用的假设，选择这种治疗方案。应注意的是，免疫细胞发展周期约为7天，决定在不使用干扰素的情况下，交替进行给予脱铁乳铁蛋白制剂的7天周期。
采用脱铁乳铁蛋白的单一治疗导致病毒的部分消除:病毒血症从高减少至中等，3×104IU/ml。在该病例中，采用人乳铁蛋白脱辅基蛋白的单一治疗仅仅部分消除丙型肝炎病毒。
我们注意到，在治疗的第2和第3周中，酶释放增加，而病毒血症的平均水平得以保留。注意到，在治疗开始之后7-9天中，观察到卡他性疾病的恶化。在没有干涉主要疾病的治疗过程的情况下，这些卡他性现象自然消除和消失。
在使用脱铁乳铁蛋白单一治疗之后，下一个阶段的患者的治疗是采用干扰素制剂的综合治疗。采用每2小时20mg的脉冲剂量的脱铁乳铁蛋白开始疗程，直到达到100mg的剂量。然后每日给予每40mg所述脱铁乳铁蛋白制剂，没有观察到任何每周一次的周期性。从脱铁乳铁蛋白给予的第5天开始，每隔一天，以3百万单位的剂量给予α2A(Reaferon)干扰素制剂。因为AlAT(SGPT)和AsAT(SGOT)的高初始水平，作出这个决定是为了实现肝保护。在给予脱铁乳铁蛋白的2小时方案之后3天之内，该患者显示AlAT(SGPT)和AsAT(SGOT)水平大于3倍的减少，而保持平均病毒血症。胆红素水平显著减少，证实2小时方案的显著肝保护作用。在Reaferon给药开始之后一周中，病毒消除发生，然后停止给予脱铁乳铁蛋白，并且以相同的量持续reaferon治疗。此外，在2周之内得到另外2种阴性PCR测试，然后停止reaferon给药。
在治疗结束之后的一个月中，发生复发。病毒血症提升至中等水平，伴随高酶释放。到治疗开始为止，病毒血症是5×106IU/ml，酶释放高，尽管它两倍小于初始水平。然后根据2小时方案，两天连续使用采用给予脱铁乳铁蛋白的综合治疗，然后每日以20mg的剂量实施所述治疗，同时以每周一次的周期观察以预防病毒对所述制剂的可能免疫。每隔一天，以5百万单位的剂量，采用甘乐能(IntronA)代替Reaferon，然后通过每日1,200mg利巴韦林补充治疗。
假定脱铁乳铁蛋白通过与病毒表位E2结合"标记"病毒，因此，使其对于免疫***来说是可识别的并阻止其渗透入肝细胞，决定开始这个阶段的采用给予甘乐能的治疗。然后，在第一次甘乐能注射之后两天，使用脱铁乳铁蛋白给予的2小时方案，每2小时20mg直到达到100mg的剂量，然后以每日20mg的剂量持续给予脱铁乳铁蛋白。
根据测定结果，在2天给予脱铁乳铁蛋白之后，检测到病毒血症水平从5,000,000减少至400,000IU/ml以及两倍减少的酶水平。低水平的抗病毒的IgM引人注意，因为其不适应方法强度。在治疗开始之后，其水平轻微增加，尽管难以确定它是否与甘乐能(Introne)或脱铁乳铁蛋白作用有关。到综合治疗的第一周结束为止，病毒血症水平减少至低，并且到治疗的第二周结束为止，没有给予脱铁乳铁蛋白，病毒血症水平下降至最小(630IU/ml，敏感性阈值为600IU/ml)。病毒血症水平的所有变化与酶(首要是AlAT(SGPT)和AsAT(SGOT))释放水平的降低相关联。到治疗的第3周结束为止，在血中没有检测到病毒，并且生化学测试在正常范围之内。使患者转为接受每周135mg的剂量的派罗辛(Pegasis)制剂的抗复发治疗。动态观察4、13和24个月。没有复发。
病例研究6
患者A.A.N.，37岁女性。经诊断患有由1B病毒基因型引起的丙型肝炎。病毒血症高，1000.000IU/ml。根据记载的数据，疾病持续2年。
改变治疗。每日以40mg的剂量给予人乳铁蛋白脱辅基蛋白制剂，持续3天，然后以20mg的剂量给药，持续4天。然后实施一周间隔，并且随后进行脱铁乳铁蛋白的第二疗程，其中每日给予40mg的所述制剂。基于所述制剂具有免疫抑制作用的假设，选择这个治疗方案。应注意的是，免疫细胞的发展周期约为7天，决定交替进行7天周期的脱铁乳铁蛋白制剂给药。
采用HL的单一治疗导致病毒的部分消除:病毒血症从高减少至低2×103IU/ml。
尽管所有值在正常范围之内，但注意到酶水平的增加。在治疗开始之后7-9天中，观察到卡他性疾病的恶化。在没有干涉主要疾病的治疗过程的情况下，这些卡他性现象自然消除和消失。
在部分成功使用脱铁乳铁蛋白单一治疗之后患者治疗的下一个阶段是采用干扰素制剂的综合治疗。采用每2小时20mg的脉冲剂量的脱铁乳铁蛋白开始疗程，直到达到100mg的剂量。然后每日以40mg的剂量给予脱铁乳铁蛋白制剂，没有观察任何每周一次的周期。在脱铁乳铁蛋白给予的同时，每隔一天以3百万单位的剂量给予α2A(Reaferon)干扰素制剂。
Reaferon的第一次给药在脱铁乳铁蛋白给药的2小时方案之前进行。采用脱铁乳铁蛋白的治疗开始之后5天，发生病毒消除。每隔一天以相同的3百万单位的剂量给予Reaferon。重要的是强调病毒消除伴随相对升高的AlAT(SGPT)和AsAT(SGOT)水平，尽管它们保持在正常范围之内。在给予2小时方案之前和之后，病毒血症保持在中等水平。在考虑1B病毒基因型的情况下，将脱铁乳铁蛋白给药延长直到8天并且以相同量持续reaferon治疗。但是，在脱铁乳铁蛋白给药停止之后一周，病毒血症增加至中等水平。脱铁乳铁蛋白给药的另一个疗程以每日20mg的剂量开始，但是在治疗的第4天对照测定显示了高病毒血症。在给予脱铁乳铁蛋白中实施2周停止。
通过采用每日1,000mg剂量的利巴韦林补充治疗过程，每隔一天，用5百万单位剂量的干扰素α-2B(甘乐能)代替Reaferon。采用被批准的2小时方案开始脱铁乳铁蛋白给药，然后以每日20mg的剂量持续给予脱铁乳铁蛋白，没有观察到每周一次的周期性。在开始治疗时，病毒血症是中等的。抗病毒免疫球蛋白M的量是显著的。在脱铁乳铁蛋白摄取的第5天开始给予甘乐能。到治疗的第6天为止，即到甘乐能给药开始为止，患者显示病毒血症增加至430千IU/ml，与血测试中的生化指标相关。保持高水平的抗病毒的IgM。在甘乐能给药开始之后，在5天之内，病毒血症水平快速降低，然后在2周之内病毒消除。在其之后停止脱铁乳铁蛋白给予，以相同范围持续甘乐能给药。在脱铁乳铁蛋白给予结束之后5、12、19和25个月实施的对照测试没有发现病毒血症。
病例研究7
患者M.T.I.，47岁女性。经诊断患有由基因型1b病毒引起的丙型肝炎。肝病理学的历史长约6年，慢性胰腺炎。在预防性检查期间，试验室发现HCV诊断。根据记载的数据，疾病持续1,5年。初始病毒血症1×107IU/ml。
在住院病人诊所中治疗患者。AlAT(SGPT)，AsAT(SGOT)的基线生化参数在正常限度之内，胆红素增加两倍，ALP增加10倍。
综合治疗采用7天方式，使用2小时方案，使用天然的乳铁蛋白(制剂Laprot)、reaferon、拉米夫定、利巴韦林和体外解毒方法。将50mg的冻干Laprot制剂用作单次剂量。到综合治疗的第3周结束为止，观察到肝酶增加几乎2-倍，并且ALP减少至正常。病毒血症减少至6.7×105IU/ml。在2周停止之后，进行采用Laprot制剂的完整治疗的第二阶段。在第二阶段中，病毒血症保持在1.2×105-2.3×105IU/ml之内。在3周2阶段结束时，发现减少的病毒血症低于500IU/ml。鉴于存在免疫抑制的迹象，实施综合治疗的2周停止。在所述2周期间仅仅使用长效干扰素派罗欣，每周使用1次。对照研究揭示病毒血症保持在600IU/ml的水平。
在按照所述方案的治疗第3阶段开始时，病毒血症增加至3IU/ml，并且直到第3阶段结束保持该水平。使患者转为接受长期使用长效干扰素的方案。在6、12和20月之后，对照研究显示病毒载量在1×103-1×104IU/ml之内。
病例研究8
患者Z.A.A.，18岁男性。经诊断患有由基因型1b病毒引起的丙型肝炎。疾病持续约5年。初始病毒血症是500000IU/ml。病人住院治疗包括以3阶段使用Laprot制剂。各阶段由7天方式和2小时方案的3周周期组成。所有3个阶段的间歇地测量两周的生化参数实际上保持在初始水平，在正常限度之内。到第一阶段结束为止，病毒血症减弱至500IU/ml。到第二阶段的开始为止，在血中没有检测到病毒。但是，在第二阶段的第一个7天的中期，他再次显示病毒血症为2.2×104IU/ml。治疗的整个第3阶段，即另一个21天伴随稳定的在1×103-1.6×103IU/ml之内的病毒血症指标。在3个阶段结束时，鉴于患者的年龄和显著免疫抑制，决定使患者转为接受长疗程的长效干扰素派罗欣。在6、13、21和29个月之后，对照研究显示病毒血症实际上保持在基线。
病例研究9.
患者N.A.V.，33岁男性。经诊断患有由基因型1b病毒引起的丙型肝炎。可信地记载了约10年的疾病持续时间。在病例历史中有重复的干扰素疗程，没有阳性效果。初始病毒血症2.1×107IU/ml。以2个阶段进行采用2小时方案，7天周期与Laprot制剂组合的疗程。到此时为止，减弱了1,5倍初始增加的生化指标。取得的抗病毒治疗效果太弱。
结论
这些临床观察对2组患者来说是典型的，其中一组采用包含在Laprot制剂中的天然人乳铁蛋白–9个观察(由于未知原因，它们之一在治疗的第一周中已经成为患者的治疗拒绝)，并且在另一组中使用通过作者在上文描述的方法得到的人脱铁乳铁蛋白-51个观察(在一个病例中存在治疗拒绝，患者具有由药物滥用的长历史导致的不稳定精神)。
在5位患者中进行脱铁乳铁蛋白单一治疗，但是因为缺少抗病毒的效果，转变成与使用干扰素、细胞生长抑制剂和体外解毒方法的新组合治疗。
不意欲被任何科学理论限制，发明人推测肠胃外给予的脱铁乳铁蛋白是亲丙型肝炎病毒的，并且与它相互作用，使它被免疫***识别并阻止其渗透入肝细胞。脱铁乳铁蛋白的长期和定期给药导致某些免疫抑制效果，在单一治疗的情况下其间接特征是病毒血症增强和在治疗开始之后约一周中所有患者发展卡他性变化。但是，在任何病例中没有发现过敏反应。
当根据2小时方案，5-6次以每2小时20mg的剂量，将脱铁乳铁蛋白与采用干扰素制剂的初步治疗一同给予时，获得了最明显效果。给予所述制剂的分成几份的方式可能是临床上有优势的，其中采用2-3小时间隔将它施用更长时期，即若干天或周(如果可能)。
工业适应性
本发明涉及在治疗由丙型肝炎病毒(HCV)导致的感染(特别是慢性感染)中使用脱铁乳铁蛋白，并且提供可以在卫生保健中使用的方法、组合物和药盒。
通过引用将本文引用的或提及的所有专利文件、公开文本、科学文献和其它文件和物质包括在本说明书中，达到如下程度：如同通过单独引用将这些文件的每一个并入本文或完整地将这些文件的每一个引入本文。
本文描述的明确的用途、治疗方法和方案、药物组合物意指实施的优选变体，仅仅以实例的方式给出，并不意欲限制本发明的范围。当研究本说明书时，本领域技术人员可以认为其它目的、方面和实施在本发明框架之内。在没有任何偏离通过所附本发明的表述确定的本发明范围和框架的情况下，本领域技术人员应理解可以结合本文描述的本发明进行不同代替和修饰。

Claims (7)

1.用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的肠胃外用组合物，其包含表观分子量为80kDa的人脱铁乳铁蛋白和干扰素，其中所述脱铁乳铁蛋白具有3.5～5.1％的铁含量。
2.权利要求1的组合物，其中所述人脱铁乳铁蛋白的含量为20mg。
3.权利要求1的组合物，其中所述丙型肝炎病毒是基因型1b丙型肝炎病毒。
4.包含表观分子量为80kDa的人脱铁乳铁蛋白和干扰素的肠胃外用组合物在制造用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染的药物中的用途，其中所述人脱铁乳铁蛋白具有3.5～5.1％的铁含量。
5.权利要求4的用途，其中所述人脱铁乳铁蛋白的含量为20mg。
6.用于肠胃外治疗丙型肝炎病毒的药盒，其包含:
含有治疗有效量的表观分子量为80kDa的人脱铁乳铁蛋白的第一容器，其中所述脱铁乳铁蛋白具有3.5～5.1％的铁含量；以及
含有治疗有效量的干扰素的第二容器。
7.权利要求6的药盒，其中所述人脱铁乳铁蛋白的含量为20mg。
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郑金贵: "《农产品品质学》", 31 December 2004 *

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