CN102590378B - 一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法 - Google Patents

一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102590378B
CN102590378B CN 201210024222 CN201210024222A CN102590378B CN 102590378 B CN102590378 B CN 102590378B CN 201210024222 CN201210024222 CN 201210024222 CN 201210024222 A CN201210024222 A CN 201210024222A CN 102590378 B CN102590378 B CN 102590378B
Authority
CN
China
Prior art keywords
swainsonine
spherosin
sample
endogenetic fungus
endophytic fungi
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN 201210024222
Other languages
English (en)
Other versions
CN102590378A (zh
Inventor
王建华
杨国栋
王妍
李金成
耿果霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest A&F University
Original Assignee
Northwest A&F University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest A&F University filed Critical Northwest A&F University
Priority to CN 201210024222 priority Critical patent/CN102590378B/zh
Publication of CN102590378A publication Critical patent/CN102590378A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102590378B publication Critical patent/CN102590378B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明为一种测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，该方法是将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为0.2~2：0.2~2的乙腈：乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。该方法有效地分离内生真菌Undifilum oxytropis中的苦马豆素，直接应用于苦马豆素的定量分析。该方法分离效果好、专属性强、准确性高，分析方法可靠。

Description

一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法
技术领域
本发明属分析化学技术领域，涉及内生真菌中苦马豆素的分离测定，具体是一种测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法。
背景技术
苦马豆素（SW）是吲哚里西啶生物碱，化学名为1,2,8-三羟基-8-氢-吲哚里西啶。SW是疯草（豆科棘豆属和黄芪属有毒植物的总称）中的主要毒性成分。疯草在世界范围内分布广泛，动物大量采食后可引起中毒，甚至死亡。
苦马豆素不仅是一种植物源性毒素，而且它还具有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。因为SW是一种极强的α-甘露糖苷酶抑制剂，不仅能抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达，还可抑制肿瘤细胞的生长和转移、诱导细胞凋亡，刺激机体的免疫***，增强杀灭肿瘤细胞的能力。因此SW也被作为抗肿瘤药物的必选后备药。
研究发现植物病原真菌豆类丝核菌、昆虫病原真菌金龟子绿僵菌可以产生SW。2000年，Harris等的首次证实SW的来源与疯草中的内生真菌密切相关；2003年，Braun等从美国3种疯草（Astragalus mollissimus, Oxytropis lambertii, O. sericea）的根、茎、叶、花、种子中都分离到Embellisia属的内生真菌，并且这些内生真菌能够产生SW，发现内生真菌分离率高的疯草，其苦马豆素含量也高。2008年，余永涛等从中国冰川棘豆、茎直黄芪、毛瓣棘豆等疯草中也分离出了可产苦马豆素的内生真菌Undifilum oxytropis。
目前对苦马豆素的检测主要采用薄层色谱法和气相色谱法。薄层色谱法是针对SW的定性检测，由于其灵敏度低，不适于定量检测；气相色谱法是目前定量测定苦马豆素的有效方法。但是在用气相色谱检测苦马豆素前，需要用衍生化试剂对样品进行前处理。衍生化反应复杂、费时。而且衍生化反应对反应条件要求非常苛刻。
由于苦马豆素自身缺少发光基团，应用高效液相色谱-紫外检测法很难对苦马豆素进行检测，从而限制了传统的高效液相色谱在检测苦马豆素方面的应用。蒸发光散射检测器作为一种通用型检测器，可以实现对低挥发性的、没有发光基团的化学物质进行检测。本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）法可以不经柱前衍生化，直接对样品中的苦马豆素进行精确测定。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种快速、准确的测定疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法。
实现上述发明目的的技术方案是：一种检测疯草内生真菌中苦马豆素的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；
2）用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为0.2~2︰0.2~2的乙腈：乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；
3) 以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。
本发明所述的菌丝样品预处理技术是：首先采用甲醇提取菌丝样品，提取液挥干后用乙酸溶解，经阳离子树脂交换柱动态循环交换1 h；用去离子水冲洗树脂中的杂质；再用稀氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干；最后甲醇溶解，离心后取上清液，挥干待用。
本发明所述的高效液相色谱仪蒸发光散射检测器ELSD的检测条件：增益值为150，载气流速25 psi，漂移管温度：55℃，雾化器36℃，进样量20μL。
本发明采用色谱柱Waters XBridge®HILIC（规格150mm×4.6mm，3.5μm）。
本发明流动相优选比例为乙腈：乙酸铵缓冲液的体积比1︰1。
本发明流动相中还添加占流动相总体积0.02%的氨水。
本发明所选用的乙酸铵缓冲液浓度为5 mmol/L。
经HPLC-ELSD分析，苦马豆素在色谱上的保留时间为5.3分钟。
按照本发明所说的苦马豆素高效液相色谱分析方法，是将需测定SW含量的疯草内生真菌Undifilum oxytropis-FEL4-F5预处理样品浓度稀释30倍后进样检测。
采用本发明测定疯草内生真菌中苦马豆素的含量，其苦马豆素的检测范围为15.625～250 μg/mL。该方法灵敏度高，专属性强，重现性好，分析方法可靠。
附图说明
图1 是苦马豆素标样的HPLC- ELSD色谱图。
图2 是疯草内生真菌Undifilum oxytropis-FEL4-F5中测得的苦马豆素HPLC- ELSD色谱图。
具体实施方式
下面的具体实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：苦马豆素标准曲线的绘制
1) SW标准溶液的配制：精确称取SW标准品，用流动相溶解，梯度稀释。
2) 实验仪器及色谱条件：Waters 1525型高效液相色谱仪，二元泵；Water 2424蒸发光散射检测器，参数设置增益值为150，载气流速25 psi，漂移管温度55℃，雾化器36℃，进样量20 μL；Waters XBridge®HILIC色谱柱（规格150mm×4.6mm，3.5μm）；色谱分离***的控制和记录由Breeze 2.0工作站完成。流动相由乙腈和乙酸铵缓冲液组成，体积比为1︰1，乙酸铵的浓度为5 mmol/L，添加总体积0.02%的氨水。流动相的流速为0.5 ml/min。苦马豆素标样结果见图1。
3) 以不同浓度SW的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到SW的标准曲线。采用本方法测定的SW浓度，在15.625～250 μg/mL浓度范围内表现出很好的线性关系。得到线性回归方程为Y＝1.0641X + 2.5679，线性回归系数 R2＝0.9981。
实施例2 内生真菌Undifilum oxytropis-FEL4-F5样品的检测
1) 样品的预处理：取Undifilum oxytropis-FEL4-F5干燥菌丝0.5g，在提取器中加入50 mL甲醇，60 ℃提取24 h。将甲醇提取液浓缩挥干，残渣用10 mL 2 %的乙酸溶液溶解，将该溶液加入到含5 cm高AG 50W阳离子树脂的交换柱中，使其动态循环交换1 h，使苦马豆素与阳离子树脂充分结合；然后用100 mL去离子水冲洗树脂中的杂质；再用100 mL 1 mol/L的氨水溶液洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干，用2 mL甲醇溶解，离心后取上清液并将其挥干待用。进样前用流动相15mL稀释(30倍,W/V)，结果见图2。
2) 实验仪器及色谱条件：同实施例1。
实施例3 不同疯草分离的内生真菌SW含量的检测
内生真菌样品的处理同实施例2，实验仪器及色谱条件同实施例1。经HPLC- ELSD检测得到内生真菌Undifilum oxytropis中SW含量如下表：
疯草种类 产地 内生真菌 SW含量（μg/g）
O.ochrocepala 宁夏 海原县 FEL4-F5 4963.14±35.55
A.strictus 西藏 日喀则 FEL5-G3 3077.64±27.33
O.glabra 甘肃 民勤 FEL1b-B4 2043.20±22.66
O.kansuensis 甘肃 天祝 FEL3-E9 2334.41±48.25

Claims (1)

1.一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）将内生真菌菌丝样品经预处理，制备成供试溶液；
所述菌丝样品预处理是首先采用甲醇提取菌丝样品，提取液挥干后用乙酸溶解，经阳离子树脂交换柱动态循环交换1 h；用去离子水冲洗树脂中的杂质；再用稀氨水洗脱树脂柱，收集氨水洗脱液，浓缩挥干；最后甲醇溶解，离心后取上清液，挥干待用；
2）用高效液相色谱仪蒸发光散射检测器检测，以体积比为0.2~2︰0.2~2的乙腈：乙酸铵缓冲液的混合液为流动相，经HILIC柱，将待检样品中的苦马豆素与其他物质分离；
所述的高效液相色谱仪蒸发光散射检测器的参数设置为增益值：150；载气流速：25 psi；漂移管温度：55℃；雾化器温度：36℃；
所述的乙酸铵缓冲液浓度为5 mmol/L；
所述的流动相中还添加占流动相总体积0.02%的氨水；
所述的流动相的流速为0.5 ml/min；
3) 以不同浓度苦马豆素的对数与对应的响应峰面积的对数作图，得到苦马豆素的标准曲线。
2．根据权利要求1所述的检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，其特征在于，所述的HILIC柱为Waters XBridge®HILIC，规格为150mm×4.6mm，3.5μm。
3．根据权利要求1所述的检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法，其特征在于，流动相为体积比1︰1的乙腈：乙酸铵缓冲液的混合液。
CN 201210024222 2012-02-05 2012-02-05 一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法 Expired - Fee Related CN102590378B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201210024222 CN102590378B (zh) 2012-02-05 2012-02-05 一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201210024222 CN102590378B (zh) 2012-02-05 2012-02-05 一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102590378A CN102590378A (zh) 2012-07-18
CN102590378B true CN102590378B (zh) 2013-09-11

Family

ID=46479310

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201210024222 Expired - Fee Related CN102590378B (zh) 2012-02-05 2012-02-05 一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102590378B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031849A (zh) * 2014-07-07 2014-09-10 西北农林科技大学 甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104977374B (zh) * 2015-07-15 2017-06-16 成霈 一种检测疯草提取物和胶囊中苦马豆素含量的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999021858A1 (en) * 1997-10-24 1999-05-06 Glycodesign Inc. Synthesis of swainsonine salts
CN101270118A (zh) * 2007-03-22 2008-09-24 贺武利 连续柱层析法提纯苦马豆素的工艺

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4514280B2 (ja) * 2000-04-05 2010-07-28 株式会社前川製作所 共生菌、共生菌のスクリーニング方法、共生菌が人工的に導入された植物、植物から得られる種子、種子から生長した植物、交雑植物、植物体への共生菌の導入方法
CN1786706B (zh) * 2004-12-10 2010-12-01 天津天士力制药股份有限公司 环维黄杨星d原料药及其制剂中环维黄杨星d含量的色谱的测定方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999021858A1 (en) * 1997-10-24 1999-05-06 Glycodesign Inc. Synthesis of swainsonine salts
CN101270118A (zh) * 2007-03-22 2008-09-24 贺武利 连续柱层析法提纯苦马豆素的工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HPLC分离甘肃棘豆中苦马豆素;童德文 等;《西北农业学报》;20010228;第10卷(第2期);6-8 *
童德文 等.HPLC分离甘肃棘豆中苦马豆素.《西北农业学报》.2001,第10卷(第2期),6-8.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104031849A (zh) * 2014-07-07 2014-09-10 西北农林科技大学 甘肃棘豆产苦马豆素内生真菌Undifilum oxytropis的定向分离及鉴定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102590378A (zh) 2012-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kwon et al. Determination of astragalin and astragaloside content in Radix Astragali using high-performance liquid chromatography coupled with pulsed amperometric detection
CN104502518B (zh) 一种治疗小儿厌食症的中药制剂的检测方法
CN110108830B (zh) 一种同时对蓝靛果中9种花青素进行定性和定量检测的方法
CN104306745A (zh) 一种天麻醒脑胶囊的质量控制方法
CN106124639A (zh) 杜仲药材的多成分含量测定方法
CN105136951A (zh) 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法
CN101526509A (zh) 调味品中防腐剂含量的快速测定方法
CN103954700A (zh) 一种测定原花青素含量及鉴别的方法
CN102928520B (zh) 黄芪提取物中糖类成分的含量测定方法
CN104034835B (zh) 发酵酒中多种生物毒素的检测方法
CN104374854B (zh) 一种hplc波长切换技术同时测定诺尼果汁中多种酚酸含量的方法
CN109085285B (zh) 一种肠炎宁颗粒的质量控制方法
CN102590378B (zh) 一种检测疯草内生真菌中苦马豆素含量的方法
CN106324167B (zh) 一种uplc测定黄芪提取物中黄酮类成分的方法
CN106645477A (zh) 一种检测氟苯尼考胺残留的方法及应用
CN102928521B (zh) 复方丹参提取物中糖类成分的含量测定方法
Yang et al. Determination of swainsonine in the endophytic Undifilum fungi by high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detector
CN103163271B (zh) 烟叶中蛇床子素残留量的测定方法
CN104833744A (zh) 一种食品中4-甲基咪唑的检测方法
CN102539572A (zh) 离子液体-加速溶剂萃取高效液相色谱化学发光检测芦丁和槲皮素
CN105572237A (zh) 一种快速定量蜂蜜品质的高效液相色谱方法
CN105675734A (zh) 一种复方丹参浸膏中低聚糖成分的含量测定方法
CN104034824A (zh) 一种快速提取测定土壤低分子量有机酸的ase-hplc方法
CN101658550A (zh) 夏枯草口服液含量测定方法
CN106093264A (zh) 一种草莓叶黄素循环组分的测定方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130911

Termination date: 20140205