CN105506115A - 一种检测诊断遗传性心肌病致病基因的dna文库及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种通过靶向高通量半导体测序技术检测遗传性心肌病致病基因突变的DNA文库及其应用。具体来说，根据80个遗传性心肌病致病基因，设计引物池，对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的80个基因检测区域能够检测肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病、左室心肌致密化不全心肌病五大类常见的遗传性心肌病，对遗传性心肌病的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。

Description

一种检测诊断遗传性心肌病致病基因的DNA文库及其应用

技术领域

本发明涉及一种通过靶向高通量半导体测序技术检测诊断遗传性心肌病致病基因的DNA文库及其应用。具体说是根据遗传性心肌病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻区域的超多重PCR引物，并对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确遗传性心肌病的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。

背景技术

遗传性心肌病是一组以心肌直接受累为主要特征的疾病，主要包括：肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病和左室心肌致密化不全心肌病五大类，其病程常伴随心力衰竭和心律失常。遗传性心肌病患者最终可能面临心脏移植、猝死等重大风险，并且可能将疾病遗传给下一代，给家庭和社会带来巨大的精神压力和经济负担。遗传性心肌病是遗传病，其发病是由于基因突变所导致，但是其涉及致病基因数量多,同一种疾病致病基因不同造成的预后差别悬殊,基因型与疾病表型之间异质性高，故早期进行精确诊断，进而选择恰当治疗方案进行个性化治疗极为重要。

目前，研究发现遗传性心肌病的众多致病基因中，只要任意一种基因发生功能性突变，即可引起疾病表型，即：同一种遗传性心肌病可以由多种遗传因素所导致。并且，不同基因的突变导致的同一种遗传性心肌病，其严重程度和预后有着较大差异。例如：MYBPC3基因突变导致的仅以心肌轻度肥厚为特点的肥厚型心肌病患者预后较好，通常不会发生严重心律失常或猝死的并发症，仅需药物治疗或随访观察即可；而PRKAG2基因突变导致的肥厚型心肌病患者多伴发WPW综合征，有很高的猝死风险，应考虑行ICD植入术。除此之外，同一患者如果携带了一个以上的致病基因突变，其临床表现和预后与只携带单一致病突变的患者相比会有差异。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是遗传性心肌病精确诊断和个性化治疗的必须前提条件。

临床上现有的遗传性心肌病的常规诊断技术，主要包括影像学检查和实验室检查两大类。影像学检查包括心脏彩超、心脏CT和心脏核磁共振。这些技术可以较为准确地判断心室壁厚度，心腔大小和心肌运动情况等客观指标，粗略判断患者是否患有遗传性心肌病。但是，影像学检查不能精确、特异地区别遗传性心肌病的具体种类，分子亚型，不能对患者预后做确切判断，也不能在早期尚未表现出临床症状的情况下对患者进行诊断。实验室检查主要包括传统生化指标的检测，如：心肌肌钙蛋白、心房钠尿肽等，仅能反映心脏损伤，不能对遗传性心肌病的分类提供帮助。因此，目前仅结合临床症状、影像学及传统实验室检查有时不能把遗传性心肌病很好区分。对于特殊类型的心肌病，如：糖原蓄积病或线粒体心肌病可能需要进行心肌活检来进行确诊，患者所受痛苦较大。而使用基因诊断的方法来替代穿刺活检进行鉴别诊断则可避免这种痛苦。同时，传统的基于Sanger测序的基因检测方法存在通量低的弊端，一次反应只能检测一个扩增区域，无法满足庞大的基因检测区域和多样本检测时效性的要求。

因此，有必要寻求一种新的检测遗传性心肌病致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供一种覆盖肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病和左室心肌致密化不全心肌病五大类遗传性心肌病，包含80个遗传性心肌病致病相关基因的DNA文库。这80个基因选择基于基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)以及发明者自己的课题研究内容。这80个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序,是目前已知针对心肌病致病基因覆盖最全面的一种靶向测序检测。其中80个基因如下：

本发明根据80个遗传性心肌病致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻调控区域的适用于超多重PCR的引物池，进而对样本基因组DNA进行超多重PCR扩增，扩增产物利用高通量半导体测序技术进行测序，寻找致病突变，明确心肌病的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。为此，本发明还提供以下技术方案：

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于诊断遗传性心肌病。

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断装置中的应用，所述诊断装置用于诊断遗传性心肌病。优选的，所述诊断装置是测序芯片。

进一步，所述应用包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)利用上述的DNA文库从IonTorrent^TM高通量测序平台自动合成覆盖全部80个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；

(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；

(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；

(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；

(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；

(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；

(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；

(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrent^TM高通量测序进行测序；

(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；

(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。

优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：通过发明者多年临床观察研究，积累大数据得到的经验以及文献报道，总结出根据不同致病基因判断不同临床预后与选择不同治疗方法。例如：通过基因检测鉴别类似临床表型的的肥厚型心肌病患者，恶性预后的患者，(如：PRKAG2基因突变患者)，随时有猝死风险，应积极考虑ICD植入术等治疗；而良性预后患者，(如：MYBPC3基因突变患者)，通常猝死风险较小，进展缓慢，可考虑单纯药物治疗。

本发明还提供一种诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述包含80个遗传性心肌病的致病基因的DNA文库。

本发明还提供一种诊断装置，其中，所述装置包括上述包含80个遗传性心肌病的致病基因的DNA文库。优选的，所述装置为测序芯片。

本发明提供一种使用上述DNA文库、诊断试剂盒或诊断装置对患者进行诊断的方法，所述方法包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)利用上述的DNA文库从IonTorrent^TM高通量测序平台自动合成覆盖全部60个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；

(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；

(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；优选的，所述Barcode接头来自于高通量测序建库试剂盒；

(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；

(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增，优选的，该通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；

(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；

(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；

(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序进行测序；

(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；

(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。

优选的，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

更优选的，所述应用进一步用于指导治疗，例如：通过基因检测鉴别诊断MYBPC3基因突变患者和PRKAG2基因突变患者，从而确定患者是否考虑ICD植入术等治疗。

采用本发明的DNA文库对遗传性心肌病患者进行基因诊断有着以下重要意义和效果：

1.可避免创伤性检查：线粒体心肌病和糖原蓄积病导致的肥厚型心肌病单凭临床特征以及心脏组织病理检查也可以确诊，但需要行动脉穿刺和心内膜活检，患者痛苦较大。而现在已知TAZ基因和PRKAG2基因突变可引起线粒体心肌病和糖原蓄积病导致的肥厚型心肌病。通过基因诊断，则患者可免心肌活检的痛苦；

2.基因诊断有助于制定进一步个性化治疗方案和针对性随访计划：单个MYBPC3基因突变导致的仅以心肌轻度肥厚为特点的肥厚型心肌病患者预后较好，通常不发生严重心律失常或猝死的并发症，仅需药物治疗或随访观察即可；而PRKAG2基因突变导致的肥厚型心肌病患者多伴发WPW综合征，有很高的猝死风险，应考虑行ICD植入术；携带多致病基因复合突变的患者心肌病严重程度通常较重，应更加积极地进行治疗；本发明可以首次最快捷和全面的一次性检测全部致病基因，能对患者做出最准确的分子诊断，实现精准医疗。

3.本申请的DNA文库是申请人从众多的遗传性心肌病致病基因中选择的80个基因，这些基因尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测；目前国际上缺乏大规模的中国汉族人群心肌病基因诊断相关信息，绝大多数已知心肌病致病基因都主要来自欧美人群的报道，它们对中国人的致病性及特点目前没有详细报道。发明者进行了长期的临床观察和大规模中国汉族人群心肌病的基因诊断研究，总结和发掘了一系列中国汉族心肌病患者的致病基因，并对国际上已经报道的致病基因在中国患者中的发病频率以及致病性进行了观察和验证。本发明所选的80个基因中的绝大多数基因均为发明人在汉族人群中验证和发现的致病基因。

4.本发明的DNA文库能够检测常见的造成遗传性心肌病的遗传缺陷，包括包括：肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右室心肌病、限制型心肌病和左室心肌致密化不全心肌病五大类。本发明提供的DNA文库及基于高通量测序技术的序列检测方法能够检测80种遗传性心肌病遗传缺陷；

5.本发明中采用基于IonTorrent^TM高通量测序技术对目标区域的扩增产物进行检测，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的80个相关致病基因的全部外显子及毗邻区域，并且能根据不同芯片数据量的大小，调整检测样本数量，在保证平均测序深度500×的前提下，检测1到45人不等的样本数量，整个测序反应和数据分析判读能在两天之内完成，大大降低了扩增反应的成本和劳动强度，提高了时效性，同时，该检测区域具有覆盖度广，整体覆盖度达到98.63％；。通过对目标扩增区域的测序和数据判读，能够准确识别与疾病相关的突变，判断疾病种类和病因，为临床提供及时可靠的检测报告。本发明设计的检测方法经过Sanger测序法验证，对二代测序深度达到100×的点突变，本方法的准确度达到100％；

6.基因诊断有助于遗传咨询、产前诊断和新生儿筛查等。因部分遗传性心肌病患者面临未来心脏移植及猝死的风险，家人非常关注患者的兄弟姐妹或将来下一胎的健康。患者致病基因突变的确诊，可以为孕育健康的下一代提供明确的遗传咨询服务。遗传性心肌病多数为常染色显性遗传病，患者兄弟姐妹有50％的发病可能性。对尚无症状年幼兄弟姐妹或子女进行致病基因检测有助于早期发现疾病、早期治疗，改善预后。

综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对遗传性心肌病具有很好的辅助诊断价值。

附图说明

图1一次IonTorrent^TM高通量测序反应的数据采集概要图；

图2一次对80个基因的目标区域进行测序，不同标本得到的数据量信息；

图3经过原始数据分析后，得到的不同标本的突变碱基数量；

图4Sanger测序法对本发明检测方法得到的突变位点进行验证。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

1.该方法中所用到的试剂：

IonAmpliSeq^TMLibraryKit2.0，IonPGM^TMTemplateOT2200Kitv3，IonSequencing200Kitv2，IonXpressBarcodeAdaptors1-16Kit，Ion318^TMChipKitv2

2.标本采集和保存

(1)标本采集：标本为患者外周血。血液为常规取静脉血5ml，EDTA抗凝处理。

(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，超过一周-80℃保存。

3.检测步骤和结果分析：

(1)标本基因组DNA的提取：标本DNA的提取按照天根生化科技(北京)有限公司的血液DNA提取试剂盒操作说明进行。

(2)目标检测区域的超多重PCR扩增及建库：以本发明中涉及的80个基因全外显子为检测区域，基于IonAmpliSeq^TMDesigner自动合成超多重PCR引物，对标本DNA的目标区域进行扩增及建库，具体实施如下:

a.目标区域的扩增：

反应条件：

b.扩增产物二合一，酶切：

反应条件：

c.连接接头：

反应条件：

22℃30min

72℃10min

10℃Upto1h

d.纯化及纯化产物的二次扩增：纯化步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，最终产物溶解于52μl反应体系，该反应体系组成为：

反应条件：

e.片段选择：片段选择步骤按照IonAmpliseqLibraryPreparation操作手册进行，得到的最终建库产物用Qubit2.0Fluorometer定量后即建库完成。

(3)高通量测序：测序及前期准备步骤按照IonPGM^TMTemplateOT2200Kitv3及IonSequencing200Kitv2操作手册进行：

a.油包水PCR反应：

将上述反应体系加入IonOneTouch2中进行油包水PCR反应。

b.油包水PCR反应完成后，连接有测序模板的IonPGMTemplateOT2200IonSphereParticles经过IonOnetouchES纯化，加入测序引物及DNA聚合酶：

室温5min后，将得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrentTM高通量测序进行测序。

(4)数据分析：测序数据经过coverageanalysis和variantcaller分析，得到碱基序列和突变位点，突变位点经过IonReporter在线注释后，得到对遗传性心肌病诊断有意义的突变位点。

(5)Sange法验证：对于得到的突变位点，采用Sanger测序法进行验证。

结果说明及分析

通过本发明中涉及的高通量测序技术一次性对6个标本的目标区域进行检测(如图1)，得到的总数据量为861M(TotalBase)，能够总共得到6250299的片段读长数据(TotalReads)，每个片段的中位读长为149bp。6个标本平均能够被测到1034072(952609-1129226)个片段读长Reads(如图2)，以上测序结果为下一步的序列分析提供了充足的数据量。测序结果经过variantCaller分析，每个标本平均有119个变异(Variants)被读出(如图3)。检测区域的变异通过IonReporter在线注释后，与疾病相关的突变位点经过Sanger测序法验证(如图4)，如图4所例举的那样，图4箭头所指处显示PRKAG2基因c.905G>A(p.Arg302Gln)杂合突变,最终明确患者的遗传缺陷类型，为临床提供诊断依据。提示患者属于肥厚型心肌病中的恶性预后者，有很高的猝死风险，除了常规的肥厚型心肌病人的药物治疗外，还应积极考虑进行手术植入ICD以防止猝死的发生。同时该基因遗传模式是常染色体显性遗传，患者的同胞兄弟姐妹及其子女有50％的概率与患者一样携带了该致病突变，也面临猝死风险，应进行该致病位点的筛查，以决定后续治疗方案。

本发明的临床应用例证

利用本发明所提供的方法，对200名患有遗传性心肌病但病因不明确的患者进行了基因检测。共诊断出肥厚型心肌病75例，扩张型心肌病68例，致心律失常性右室心肌病20例，限制性心肌病8例，左室致密化不全心肌病11例。该方法对遗传性心肌病检出的总阳性率达到91％，结合临床影像学检查，心电图，实验室检查及医生最终诊断结果，本方法的假阳性率为0，即所有经本方法确认的携带致病突变患者均符合相关遗传疾病的临床特征，并能够给予明确的临床诊断。本发明涉及的检测方法是利用高通量测序技术为突变快速筛选工具，以Sanger测序法为最终确定突变的金标准，因此具有快速，准确的特征。以高通量测序平均深度100×为例，所覆盖的95.51％的目标区域都能够被测序，且筛选得到的点突变能够被Sanger测序法验证，因此对以上区域检测的准确度为100％。根据200名受测患者的临床诊疗结果分析，受测患者未出现假阴性率。基于本发明涉及的检测方法给出的诊断报告得到临床医生的认可和采纳。本发明涉及的检测方法具有准确，快速，低成本的特点，对遗传性心肌病的鉴别诊断有着重要意义和实用价值。

实施例2：

本发明中引物池里包含发明者新发现的心肌病致病基因8个，如下表：

编号	基因名	OMIM编号	关联疾病
				1	CNBP	116955	家族性扩张型心肌病
2	COX15	603646	家族性扩张型心肌病
				3	CTF1	600435	家族性扩张型心肌病
4	CTLA4	123890	家族性扩张型心肌病
				5	FHL2	602633	家族性扩张型心肌病
6	FOSL1	136515	家族性扩张型心肌病
				7	HLA-DQB1	604305	家族性扩张型心肌病
8	SEMA4D	601866	家族性扩张型心肌病

新发现的8个心肌病致病基因来自于发明者多年来的研究积累和家系调查。发明者首先在已知的心肌病致病基因中通过KEGG信号通路检索，同源基因库，寻找已知致病基因的同源基因及相同致病通路上的关键基因。然后在多年积累的中国汉族病人大样本量病例样本库中对候选的致病基因进行靶向高通量测序，并进行生物信息学分析，筛选和寻找致病突变。对筛选到致病突变的病例进行随访和进一步的家系分析，对患者的整个家族进行致病位点测序验证，计算致病突变的共分离系数。当发现候选基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中完全共分离时，即可初步判断该候选致病基因为新的致病基因。本发明发现，上述8个基因的致病突变在两个及以上无关联的家系中均出现完全共分离。

对一系列的筛选到的新致病基因及其致病突变进行功能学实验，对相关致病通路进行功能学检测，对部分重要受累基因进行大鼠基因敲除建模，观察疾病在动物模型中的再现情况，从而进一步对候选基因的致病性进行评估。本发明发现，患者的白细胞以及转染上述突变基因的H9C2心肌细胞系或NIH3T3成纤维细胞系细胞中上述8个基因的表达和功能均降低。最终，筛选出了这8个新的国际上尚未报道的致病基因，并在汉族大样本病例中对其致病性进行了初步评估。同时，建立了600名汉族正常对照人群的所有致病基因的非致病多态性位点库，弥补了国际上通用数据库中汉族人样本少，非致病多态性位点严重不全的漏洞，对未来的基因检测和数据分析提供了坚实基础。

Claims (10)

1.一种基于IonTorrent^TM高通量测序技术诊断遗传性心肌病的DNA文库，其特征在于，该文库包括80个遗传性心肌病相关的致病基因。

2.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于诊断遗传性心肌病。

3.权利要求1所述的DNA文库在制备诊断装置中的应用，其特征在于，所述诊断装置用于诊断遗传性心肌病。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。

5.如权利要求2-4任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用包括下列步骤：

(1)提供受试者样本的基因组DNA；

(2)利用权利要求1所述的DNA文库从IonTorrent^TM高通量测序平台自动合成覆盖全部80个致病基因的扩增引物文库，对目标区域进行超多重PCR扩增；

(3)对步骤(2)得到的扩增产物进行酶切；

(4)对步骤(3)得到的酶切产物加Barcode接头；

(5)对步骤(4)得到的连接产物进行纯化；

(6)对步骤(5)得到的纯化产物用通用引物进行二次扩增；

(7)对步骤(6)得到的二次扩增产物进行片段选择及浓度测定，即建成患者目标区域扩增文库；

(8)对步骤(7)所得到的文库经过油包水PCR扩增反应后，将待测序目的片段连接于ISP珠子，得到反应液；

(9)将步骤(8)得到的包含ISP珠子的反应液点入芯片，上IonTorrent^TM高通量测序进行测序；

(10)将步骤(9)得到的碱基序列信息进行生物信息学比对处理，得到与疾病相关的突变位点；

(11)对步骤(10)得到的突变位点进行Sanger测序法验证。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本来自受试者的外周血、体液、组织器官样本。

7.如权利要求2-6任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述应用进一步用于指导治疗。

8.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的DNA文库。

9.一种诊断装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1所述的DNA文库。

10.如权利要求9的诊断装置，其特征在于，所述诊断装置是测序芯片。