CN105506061A - 一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法，该试剂盒包括：由Tris-HCl、氯化镁、EDTA和疏基乙醇制成的提取液，由Tris-HCl、氯化镁、6-磷酸果糖和UDPG制成的试剂一，由蔗糖溶于蒸馏水后制成的试剂二，由氢氧化钠溶于蒸馏水后制成的试剂三，由盐酸溶于蒸馏水后制成的试剂四，由间苯二酚溶于乙醇和蒸馏水后制成的试剂五。本发明的方法通过设定对照管，能够排除样本中蔗糖的影响，使得测定结果更加准确，适用于各种样本中蔗糖磷酸合成酶活性的检测。本发明不仅大大减少了试剂种类，使得操作更加简便，而且其反应总体积仅为300μL，且在不影响准确性的基础上缩小了UDPG的浓度，大大降低了试剂成本。
Description
技术领域
本发明属于生命科学领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法。
背景技术
蔗糖不仅是重要的光合产物，也是植物体内运输的主要物质，还是碳水化合物的贮存形式之一。蔗糖磷酸合成酶（SPS）以果糖-6-磷酸为受体，形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶***看作是蔗糖合成的主要途径。
目前市面已有的检测蔗糖磷酸合成酶活性的方法是间苯二酚显色法。其原理是样本中蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应呈现的颜色变化的深浅与蔗糖磷酸合成酶活性高低成正比。该方法是市面上公认的唯一一种检测蔗糖磷酸合成酶活性的方法，但是该方法仍存在很多不足：
1、不能适用于检测蔗糖含量较高的样本，样本中含有的蔗糖会对测定该酶活性产生很大的影响，造成测定结果不准确。
2、反应总体积为2-3mL，各种试剂加入的量较大，尤其是UDPG的浓度达到10mM以上，该试剂价格昂贵，总体成本较高。
3、试剂种类过多，操作过程过于繁琐。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明旨在提供一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒及其方法，可快速准确的对蔗糖磷酸合成酶活性进行测定。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、EDTA和疏基乙醇混匀后制成，置于100mL试剂瓶中；
试剂一，液体×1瓶，-20℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、6-磷酸果糖和UDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中；
试剂二，蔗糖溶液×1瓶，4℃保存，由一定量的蔗糖溶于蒸馏水后制成，置于10mL试剂瓶中；
试剂三，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的氢氧化钠溶于蒸馏水后制成，置于2mL试剂瓶中；
试剂四，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的盐酸溶于蒸馏水后制成，置于25mL试剂瓶中；
试剂五，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的间苯二酚溶于乙醇和蒸馏水后制成，置于6mL试剂瓶中。
进一步的，所述提取液中的Tris-HCl缓冲液的体积为100mL，物质的量浓度为100mM，pH=7.0，氯化镁的质量为203mg，EDTA的质量为58mg，巯基乙醇的体积为140uL；
进一步的，所述试剂一中的Tris-HCl缓冲液的体积为5mL，物质的量浓度为50mM，pH=7.0，氯化镁的质量为10mg，6-磷酸果糖的质量为15.2mg，UDPG的质量为9mg；
进一步的，所述试剂二，即所述蔗糖溶液的体积为10mL，浓度为1mg/mL，其中蔗糖的质量为10mg，蒸馏水的体积为10mL；
进一步的，所述试剂三中的氢氧化钠的质量为0.16g，蒸馏水的体积为2mL；
进一步的，所述试剂四中的盐酸的体积为7.5mL，蒸馏水的体积为17.5mL水；
进一步的，所述试剂五中的间苯二酚的质量为6mg，乙醇的体积为5.7mL，蒸馏水的体积为0.3mL。
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
一种采用上述试剂盒且基于分光光度法的蔗糖磷酸合成酶活性测定方法，包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
可见分光光度计或酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰；
步骤2样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆；然后采用离心机8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3分光光度计或酶标仪的预热；
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零；
步骤4蔗糖磷酸合成酶活性的测定操作；
1）取4支EP管，分别设定为测定管、对照管、标准管和空白管；
2）在测定管中加入10μL样本和45μL所述试剂一，在对照管中加入10μL样本和45μL蒸馏水，在标准管中加入45μL蒸馏水和所述试剂二，在空白管中加入55μL蒸馏水；
3）分别将上述4支EP管混匀，25℃准确水浴10min；
4）水浴后分别在测定管、对照管、标准管和空白管中加入15μL所述试剂三；
5）将上述加入所述试剂三的4支EP管分别在沸水浴中煮沸10min，然后冷却；
6）在冷却后的测定管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在对照管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在标准管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在空白管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五；
7）分别将上述加入所述试剂四和所述试剂五的4支EP管混匀，沸水浴30min，冷却；
8）在上述冷却后的4支EP管中各取200μL物质至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下测定各管吸光值；
步骤5蔗糖磷酸合成酶活性的计算；
1）按照蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位；
蔗糖磷酸合成酶活性（U/mgprot）=[C标准管×V1×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）]÷（V1×Cpr）÷T=100×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr；
2）按照样本鲜重计算；
单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位；
蔗糖磷酸合成酶活性（U/g鲜重）=[C标准管×V1×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）]÷（W×V1÷V2）÷T=100×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W；
其中，C标准管=1000μg/mL，表示标准管浓度；
V1=0.01mL，表示加入反应体系中样本体积；
V2=1mL，表示加入提取液体积；
A测定管表示测定管中物质的吸光值；
A对照管表示对照管中物质的吸光值；
A标准管表示标准管中物质的吸光值；
A空白管表示标准管中物质的吸光值；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本鲜重，单位为g；
T=10min，表示反应时间。
本发明的有益效果是：
1、本发明的试剂盒及其方法通过设定对照管，能够排除样本中蔗糖的影响，使得测定结果更加准确，适用于各种样本中蔗糖磷酸合成酶活性的检测。
2、本发明的试剂盒及其方法的反应总体积仅为300μL，且在不影响准确性的基础上缩小了UDPG的浓度，大大降低了试剂成本。
3、本发明的试剂盒将氯化镁，6-磷酸果糖和UDPG溶解于Tris-HCl缓冲液，配成试剂一，大大减少了试剂种类，使得操作更加简便。
4、本发明的方法既可用分光光度计检测也可以用酶标仪检测，用户可以根据需要选用不同的仪器。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体×1瓶，4℃保存，由100mL，物质的量浓度为100mM，pH=7.0的Tris-HCl缓冲液、203mg氯化镁、58mgEDTA和140uL疏基乙醇混匀后制成，置于100mL试剂瓶中；
试剂一，液体×1瓶，-20℃保存，由5mL，物质的量浓度为50mM，pH=7.0的Tris-HCl缓冲液、10mg氯化镁、15.2mg6-磷酸果糖和9mgUDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中；
试剂二，1mg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶，4℃保存，由10mg蔗糖溶于10mL蒸馏水后制成，置于10mL试剂瓶中；
试剂三，液体×1瓶，4℃保存，由0.16g氢氧化钠溶于2mL蒸馏水后制成，置于2mL试剂瓶中；
试剂四，液体×1瓶，4℃保存，由7.5mL盐酸溶于17.5mL蒸馏水后制成，置于25mL试剂瓶中；
试剂五，液体×1瓶，4℃保存，由6mg间苯二酚溶于0.3mL乙醇和5.7mL蒸馏水后制成，置于6mL试剂瓶中。
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸，蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
一种采用上述试剂盒且基于分光光度法的蔗糖磷酸合成酶活性测定方法，包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
可见分光光度计或酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰；
步骤2样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5~10）的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；然后采用离心机8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3分光光度计或酶标仪的预热；
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零；
步骤4蔗糖磷酸合成酶活性的测定操作；
1）参见下表所示，取4支EP管，分别设定为测定管、对照管、标准管和空白管；
2）在测定管中加入10μL样本和45μL所述试剂一，在对照管中加入10μL样本和45μL蒸馏水，在标准管中加入45μL蒸馏水和所述试剂二，在空白管中加入55μL蒸馏水；
3）分别将上述4支EP管混匀，25℃准确水浴10min；
4）水浴后分别在测定管、对照管、标准管和空白管中加入15μL所述试剂三；
5）将上述加入所述试剂三的4支EP管分别在沸水浴中煮沸10min，然后冷却；
6）在冷却后的测定管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在对照管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在标准管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在空白管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五；
7）分别将上述加入所述试剂四和所述试剂五的4支EP管混匀，沸水浴30min，冷却；
8）在上述冷却后的4支EP管中各取200μL物质至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下测定各管吸光值；
步骤5蔗糖磷酸合成酶活性的计算；
1）按照蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位；
蔗糖磷酸合成酶活性（U/mgprot）=[C标准管×V1×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）]÷（V1×Cpr）÷T=100×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr；
2、按照样本鲜重计算；
单位定义：每g组织每分钟催化产生1μg蔗糖定义为一个酶活力单位；
蔗糖磷酸合成酶活性（U/g鲜重）=[C标准管×V1×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）]÷（W×V1÷V2）÷T=100×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W；
其中，C标准管=1000μg/mL，表示标准管浓度；
V1=0.01mL，表示加入反应体系中样本体积；
V2=1mL，表示加入提取液体积；
A测定管表示测定管中物质的吸光值；
A对照管表示对照管中物质的吸光值；
A标准管表示标准管中物质的吸光值；
A空白管表示标准管中物质的吸光值；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本鲜重，单位为g；
T=10min，表示反应时间。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：
提取液，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、EDTA和疏基乙醇混匀后制成，置于100mL试剂瓶中；
试剂一，液体×1瓶，-20℃保存，由一定量的Tris-HCl缓冲液、氯化镁、6-磷酸果糖和UDPG混匀后制成，置于5mL试剂瓶中；
试剂二，蔗糖溶液×1瓶，4℃保存，由一定量的蔗糖溶于蒸馏水后制成，置于10mL试剂瓶中；
试剂三，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的氢氧化钠溶于蒸馏水后制成，置于2mL试剂瓶中；
试剂四，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的盐酸溶于蒸馏水后制成，置于25mL试剂瓶中；
试剂五，液体×1瓶，4℃保存，由一定量的间苯二酚溶于乙醇和蒸馏水后制成，置于6mL试剂瓶中。
2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸合成酶活性测定试剂盒，其特征在于：
所述提取液中的Tris-HCl缓冲液的体积为100mL，物质的量浓度为100mM，pH=7.0，氯化镁的质量为203mg，EDTA的质量为58mg，巯基乙醇的体积为140uL；
所述试剂一中的Tris-HCl缓冲液的体积为5mL，物质的量浓度为50mM，pH=7.0，氯化镁的质量为10mg，6-磷酸果糖的质量为15.2mg，UDPG的质量为9mg；
所述试剂二，即所述蔗糖溶液的体积为10mL，浓度为1mg/mL，其中蔗糖的质量为10mg，蒸馏水的体积为10mL；
所述试剂三中的氢氧化钠的质量为0.16g，蒸馏水的体积为2mL；
所述试剂四中的盐酸的体积为7.5mL，蒸馏水的体积为17.5mL水；
所述试剂五中的间苯二酚的质量为6mg，乙醇的体积为5.7mL，蒸馏水的体积为0.3mL。
3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的蔗糖磷酸合成酶活性测定方法，其特征在于，基于分光光度法，包括以下步骤：
步骤1仪器和用品的准备；
可见分光光度计或酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰；
步骤2样品测定的准备：
按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆；然后采用离心机8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3分光光度计或酶标仪的预热；
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至480nm，蒸馏水调零；
步骤4蔗糖磷酸合成酶活性的测定操作；
取4支EP管，分别设定为测定管、对照管、标准管和空白管；
2）在测定管中加入10μL样本和45μL所述试剂一，在对照管中加入10μL样本和45μL蒸馏水，在标准管中加入45μL蒸馏水和所述试剂二，在空白管中加入55μL蒸馏水；
3）分别将上述4支EP管混匀，25℃准确水浴10min；
4）水浴后分别在测定管、对照管、标准管和空白管中加入15μL所述试剂三；
5）将上述加入所述试剂三的4支EP管分别在沸水浴中煮沸10min，然后冷却；
6）在冷却后的测定管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在对照管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在标准管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五，在空白管中加入210μL所述试剂四和60μL所述试剂五；
分别将上述加入所述试剂四和所述试剂五的4支EP管混匀，沸水浴30min，冷却；
8）在上述冷却后的4支EP管中各取200μL物质至微量石英比色皿或96孔板中，480nm下测定各管吸光值；
步骤5蔗糖磷酸合成酶活性的计算；
1）按照蛋白浓度计算：
蔗糖磷酸合成酶活性（U/mgprot）=[C标准管×V1×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）]÷（V1×Cpr）÷T=100×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr；
2）按照样本鲜重计算；
蔗糖磷酸合成酶活性（U/g鲜重）=[C标准管×V1×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）]÷（W×V1÷V2）÷T=100×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W；
其中，C标准管=1000μg/mL，表示标准管浓度；
V1=0.01mL，表示加入反应体系中样本体积；
V2=1mL，表示加入提取液体积；
A测定管表示测定管中物质的吸光值；
A对照管表示对照管中物质的吸光值；
A标准管表示标准管中物质的吸光值；
A空白管表示标准管中物质的吸光值；
Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；
W表示样本鲜重，单位为g；
T=10min，表示反应时间。
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