CN105506017A - 发酵法工业化生产l-羟脯氨酸的发酵工艺 - Google Patents

发酵法工业化生产l-羟脯氨酸的发酵工艺 Download PDF

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Abstract

发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：(1)菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；(2)成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸。本发明的发酵工艺应用于微生物发酵生产L-羟脯氨酸，提高了发酵水平，降低了生产成本，避免了三废污染。

Description

发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺
技术领域
本发明涉及微生物发酵工艺，具体涉及发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺。
背景技术
羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸羟基化后的产物，其分子式为C5H9NO3。羟脯氨酸呈白色片状结晶或结晶性粉末，微甜，熔点为274℃，易溶于水，微溶于乙醇。自然界中反式-4-羟基脯氨酸较为常见，反式-4-羟脯氨酸最早发现于动物胶原蛋白中。反式-4-羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物饲料、营养和美容业等方面。
目前，国内外报道的生产羟脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶促转化法四种，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工业生产方法。但是，蛋白水解提取法需经过强酸强碱处理，纯化步骤长，而且羟脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不仅浪费大量原料，而且废弃物污染严重，随着目前环境压力的增加和资源原料价格的上升，传统的蛋白水解提取法正逐渐被市场淘汰。微生物发酵法正以其绿色环保的工艺、原料和成本低廉的优势迅速发展起来。
目前，微生物发酵法生产L-羟脯氨酸的研究还处于实验室阶段，尚未形成成熟的工业化生产工艺，而先进的工业化生产工艺，尤其是发酵工艺对于L-羟脯氨酸的发酵水平、生产成本和三废排放有着至关重要的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺。
本发明所采取的技术方案：
发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，包括以下步骤：(1)菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；(2)成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸。
其中成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.20MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.0～9.0，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头***接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05～0.1MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.2～1.2VVM、pH6.5、搅拌转速200～600rpm、溶氧20％以上、培养时间8～24小时、OD600达到10～20、最终葡萄糖含量小于10g/L。
其中发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15～0.17MPa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95～105℃，直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.5～1.2VVM，pH6.5，搅拌转速60～300rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30～90g/L、糖浓度≦2.0％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐；
其中液体培养基的水溶液配方(g/L)为：葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾7.5、氯化钾1.9、FeSO4·7H2O0.28、MgSO4·7H2O0.32、微量元素(ppm)：MnSO4·H2O0.5、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.2、CuSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.6、VB120、消泡剂100、AMP50。
其中发酵培养基配方(g/L)为：葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾1.9、MgSO4·7H2O0.32、FeSO4·7H2O0.75、微量元素(ppm)：MnSO4·H2O1.0、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.4、CuSO4·7H2O1.0、ZnSO4·7H2O1.2、消泡剂200、AMP50。
其中发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备方法为：取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种1瓶，加入无菌生理盐水50ml，刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。
本发明的发酵工艺应用于微生物发酵生产L-羟脯氨酸，提高了发酵水平，降低了生产成本，避免了三废污染。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实例1
发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，首先菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；
其中液体种子培养基水溶液配方(g/L)为：葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾7.5、氯化钾1.9、FeSO4·7H2O0.28、MgSO4·7H2O0.32、微量元素(ppm):MnSO4·H2O0.5、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.2、CuSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.6、VB120、消泡剂100、AMP50。
其中发酵培养基配方(g/L)如下：葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾1.9、MgSO4·7H2O0.32、FeSO4·7H2O0.75、微量元素(ppm):MnSO4·H2O1.0、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.4、CuSO4·7H2O1.0、ZnSO4·7H2O1.2、消泡剂200、AMP50。
其中成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.2，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头***接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压至0.05MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.2～1.0VVM、pH6.5、搅拌转速200rpm、溶氧20％以上、培养时间12小时、OD600达到12、最终葡萄糖含量2g/L。
其中发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15MPa压力、温度127℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95℃，直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养:培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.5～1.0VVM，pH6.5，搅拌转速180rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在43g/L、糖浓度0.5％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐。
其中发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备：取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种1瓶，加入无菌生理盐水50ml,刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。
实例2
发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；
其中液体种子培养基水溶液配方(g/L)为：葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾7.5、氯化钾1.9、FeSO4·7H2O0.28、MgSO4·7H2O0.32、微量元素(ppm):MnSO4·H2O0.5、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.2、CuSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.6、VB120、消泡剂100、AMP50。
其中发酵培养基配方(g/L)如下：葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾1.9、MgSO4·7H2O0.32、FeSO4·7H2O0.75、微量元素(ppm):MnSO4·H2O1.0、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.4、CuSO4·7H2O1.0、ZnSO4·7H2O1.2、消泡剂200、AMP50。
其中成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.18MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.8，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头***接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.06MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.6～1.0VVM、pH6.5、搅拌转速300rpm、溶氧20％以上、培养时间14小时、OD600达到16、最终葡萄糖含量4g/L。
其中发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.16MPa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到100℃,直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养:培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.6～1.0VVM，pH6.5，搅拌转速200rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在48g/L、糖浓度0.2％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐。
其中发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备：取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种1瓶，加入无菌生理盐水50ml,刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。
实例3
发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，首先是菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，然后移入发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸；
其中液体种子培养基水溶液配方(g/L)为：葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾7.5、氯化钾1.9、FeSO4·7H2O0.28、MgSO4·7H2O0.32、微量元素(ppm):MnSO4·H2O0.5、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.2、CuSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.6、VB120、消泡剂100、AMP50。
其中发酵培养基配方(g/L)如下：葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾1.9、MgSO4·7H2O0.32、FeSO4·7H2O0.75、微量元素(ppm):MnSO4·H2O1.0、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.4、CuSO4·7H2O1.0、ZnSO4·7H2O1.2、消泡剂200、AMP50。
其中成熟种子的培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.18MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH8.2，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头***接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.08MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量1VVM、pH6.5、搅拌转速400rpm、溶氧20％以上、培养时间18小时、OD600达到18、最终葡萄糖含量1g/L。
其中发酵培养包括以下步骤：①空罐灭菌：0.17MPa压力、温度129℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到105℃，直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养:培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.8～1.2VVM，pH6.5，搅拌转速280rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在52g/L、糖浓度0.1％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐。
其中发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备：取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种1瓶，加入无菌生理盐水50ml,刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。

Claims (6)

1.发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子；(2)成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸。
2.根据权利要求1所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的步骤(1)菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子包括以下步骤：①空罐灭菌：0.15-0.20MPa，保压30分钟；②实罐灭菌：液体种子培养基投入罐，4T种子罐配2.4T种子培养基，调pH至7.0，关闭罐盖，夹套加热至90℃，直接蒸汽加热到121℃，0.1MPa压力保温10分钟；③冷却：灭菌完毕冷却降温至36℃待接种；④接种：采用压差法将菌液接入罐内，接种温度36℃，pH7.0～9.0，压力0.1MPa，打开接种口防护盖，用浸泡过95％乙醇的棉花圈套住接种口，点燃棉花圈，接种瓶移至点燃棉花圈接种口旁，旋开接种瓶针头保护塞，迅速将接种瓶针头***接种口，缓缓打开罐上排气阀，调压0.05～0.1MPa，接种量1瓶，接种结束后，用浸过75％乙醇的棉花球放置在接种口上，拨出接种针头，旋上接种口防护盖，开始培养；⑤培养：培养温度36℃、罐压0.03MPa、风量0.2～1.2VVM、pH6.5、搅拌转速200～600rpm、溶氧20％以上、培养时间8～24小时、OD600达到10～20、最终葡萄糖含量小于10g/L。
3.根据权利要求1或2所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的步骤(2)成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸包括以下步骤，①空罐灭菌：0.15～0.17MPa压力、温度128℃灭菌30分钟；②实罐灭菌：发酵培养基投入罐中，30T罐加22T培养基，关闭罐盖，夹套预热到95～105℃，直接蒸汽加热到121℃，压力0.1MPa，保温10分钟，冷却降温至35℃，调pH到6.5，备接种；③接种：采用压差法将种子液压入罐内培养；④培养：培养温度35℃，罐压0.03MPa，风量0.5～1.2VVM，pH6.5，搅拌转速60～300rpm，发酵结束时羟脯氨酸生成浓度在30～90g/L、糖浓度≦2.0％；⑤发酵结束后，发酵液加热至80℃，立即降温至40℃，用压缩空气压至发酵液贮罐。
4.根据权利要求1或2所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的步骤(1)菌种在液体培养基中培养得到成熟的种子，其液体培养基的水溶液配方(g/L)为：葡萄糖40、酵母粉7.5、硫酸铵2.0、磷酸二氢钾7.5、氯化钾1.9、FeSO4·7H2O0.28、MgSO4·7H2O0.32、微量元素(ppm)：MnSO4·H2O0.5、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.2、CuSO4·7H2O0.5、ZnSO4·7H2O0.6、VB120、消泡剂100、AMP50。
5.根据权利要求3所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的步骤(2)成熟的种子移入发酵罐的发酵培养基中发酵代谢产生L-羟脯氨酸，其发酵培养基配方(g/L)为：葡萄糖20、酵母粉5.0、硫酸铵10、磷酸二氢钾5.0、氯化钾1.9、MgSO4·7H2O0.32、FeSO4·7H2O0.75、微量元素(ppm)：MnSO4·H2O1.0、CoCl2·6H2O1.4、NiSO4·6H2O1.4、CuSO4·7H2O1.0、ZnSO4·7H2O1.2、消泡剂200、AMP50。
6.根据权利要求3所述的发酵法工业化生产L-羟脯氨酸的发酵工艺，其特征在于，所述的(2)发酵培养过程中步骤③接种的菌液的制备方法为：取长得丰满无杂菌已培养好的茄子瓶菌种1瓶，加入无菌生理盐水50ml，刮下菌苔，倒入带有玻璃珠的无菌瓶内，塞好带有针头的橡皮塞，用纱布保护接种针头，在无菌室内将菌苔打碎备用。
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