CN105505755A - 空间转录组建库测序方法及所用装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um的组织冷冻切片。本发明还同时提供了利用上述装置进行的空间转录组测序技术方法。本发明不仅能有效实现少量细胞中获取足够的RNA样品，避免测序结果的“均一”或者“整体”表征，还可以根据细胞异质性分辨组织中不同表型的细胞转录本信息的差异性，挖掘低丰度的转录本信息，从而为生物医药农学领域提供更精确和特定性高的转录本信息。

Description

空间转录组建库测序方法及所用装置

技术领域

本发明涉及生物学、医学、农学等领域，尤其是一种利用芯片探针获取组织细胞空间位置信息的空间转录组建库测序技术。该技术可以根据细胞的位置，类别以及状态信息对细胞进行准确的、可重复的标记和分类，可以在保留细胞组织中的位置分布的从自然组织微环境下的活细胞中分离出RNA，通过高通量测序和生物信息分析等流程，一次性定量获得不同空间位置组织细胞的完整的表达谱。

背景技术

转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组测序即对特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA进行测序。通过新一代高通量测序，转录组测序能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。细胞是生命活动的基本功能单位，而在生物体内没有任何两个细胞是完全相同的。传统的转录组研究，绝大多数情况下都是针对混合的大量细胞进行的，无法观察到单个细胞之间细微的差别，掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中特异性和细胞差异性。而针对单个细胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术发展的终极挑战。目前我们正在步入一个单细胞转录组学时代，该研究方向会对生物学和医学产生深刻的影响。然而单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术(amplificationtechnology)也是一大考验。而且目前采用的单细胞测序技术中，绝大多数方法都需要特定的前处理过程，制备“测序文库”。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、操作失误率高、重复性差、背景噪声以及定量不准确等问题均造成单细胞测序难以广泛应用和推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于组织和芯片空间位置信息的、操作简便、成本相对较低、特异性强、分辨率高、便于检测特定组织特定细胞基因转录表达信息的空间转录组建库测序技术。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置：包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；

所述盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于(略大于即可)硅基寡核苷酸芯片的面积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um(例如为45～55μm，即，厚度为50μm左右)的组织冷冻切片，所述组织冷冻切片的面积小于盖玻片的面积；且组织冷冻切片的面积≤(即，略小于或等于)硅基寡核苷酸芯片上所有探针覆盖的面积。

作为本发明的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置的改进：所述硅基寡核苷酸芯片的锚定探针为5'-GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC。

本发明还同时提供利用上述任意一种装置进行的空间转录组测序技术方法，包括以下步骤：

1)、首先加入第一段引物(20nmol)，第一段引物的序列为5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，退火温度为75度/70度；

然后再加入第二段引物(约2ug的总量)，0.1μMPolyd(T)Primer5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN，退火温度从70降到15度；

再加入T4连接酶(2ul)，用于连接第一段和第二段引物，维持温度15度，反应(快速反应)20min，反应完成后吸走多余液体；

2)、将组织切片放置于盖玻片表面(加有位置标记的盖玻片表面)，组织切片的厚度为10～50um(原则以小于或约等于细胞厚度为准)，大小不超过1.5×1.5cm；将样品朝上的盖玻片放置于显微镜下观察组织细胞的位置，并拍照用于后续定位；

完成拍照后，在芯片表面加入裂解液(10ul)，从而使裂解液铺满探针芯片探针表面；将盖玻片覆盖在芯片上，组织样品向下直接与芯片探针接触；

盖玻片大小与芯片探针部分的大小对应，用于对应定位组织的部位；

对芯片进行如下孵育，75℃---3min---65℃-0.1℃/s-(37～45)℃---取出；

注意，75℃---3min打开TotalRNA的二级结构，准备和引物结合；0.1℃/s退火使引物与模版结合更加准确；根据结合区域长度设定一般为40℃，长度改变需调整，当oligoT数目在13-18个之间变化时，最终温度范围在37-40℃变化，OligoT增多时提高温度(例如至45℃)；

取走盖玻片以及覆盖在芯片表面的组织样品，并吸走所有液体，使用RNasefree水轻柔洗涤一次；

3)、在上述步骤2)完成后，在芯片上完成第一链反转录，然后消化RNA；

即，消化1ulRNaseA(10mg/ml)(分解游离的RNA)；

具体如下：降解剩余的RNA，然后95℃孵化10min，吸取所有液体，转移到离心管。芯片使用RNasefree水洗涤2次，并烘干可以重复使用。在PCR管里进行的反应：加入0.5ul酶RNaseH(60U/μl)(分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链)，37℃反应5min；

备注：先RNaseA消化游离的单链RNA，同时95℃高温使杂交RNA解链，并且热打断RNA；然后RNaseH将退火结合回反转录第一链的小片段RNA降解；

4)、在上述3)步骤结束后的消化体系里，进行第二链引物的结合；

即，加入1μMSecondPrimer和1μMSecondREVPrimer从98℃---1min---80℃-0.2℃/s-25℃---30min，采用梯度孵化的方式结合反应；

5)、将上述步骤4)孵化后的反应液里，接着进行第二链条延伸反应；

即，分别加入9.5μlddH₂O，4μl10×NEBuffer，2μl10mMdNTP和2μlKlenow(3’-5’exo-)，在预先设置成25℃PCR仪中延伸(PCR仪背景温度设为<25℃，温度太高会使第五步结合的引物脱落)；

6)、将上述步骤5)反应完后，对产物进行磁珠纯化(先配制80％无水乙醇，总体积＝0.4*(n+1)ml，n＝样品数)；

具体步骤可如下：

1.加水补齐至80μl，加入80μlBECKBeads(1x)；

2.充分混匀后(吸打至少10次)，静置5min；

3.稍离心，至于磁珠板上；

4.静置5min或看到液体澄清，缓慢吸取155μl上清，丢弃；

5.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

6.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

7.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

8.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

9.换10μl枪吸去剩余酒精，干燥；

(注意：步骤4-9，管子都要放在磁力架上)

10.在磁珠出现裂纹后，将上述8管磁珠用26μlddH2O混合在一起，充分吸打混匀后(吸打至少10次)；

(备注：磁珠干燥太久会影响DNA得率)；

11.静置2min，稍离心，置于磁力架上2min，吸取全部上清至新的管中；

12.新管再置于磁力架上5min，缓慢吸取23μl上清用于后续实验；

13.剩余上清吸2μl，Qubit测值，记录。

7)、进行PCR扩增；

具体如下：

反应体系：

使用以下PCR扩增程序：

98℃30s

98℃10s

65℃30s12-23Cycle

72℃30s(PCR产量与起始mRNA相关)

72℃5min

4℃保存；

8)、对PCR产物再进行磁珠纯化(先配制80％无水乙醇，总体积＝0.4*(n+1)ml，n＝样品数)；

具体辅助操作步骤如下：

1.加水补齐至80μl，加入80μlBECKBeads(1x)；

2.充分混匀后(吸打至少10次)，静置5min；

3.稍离心，至于磁珠板上；

4.静置5min或看到液体澄清，缓慢吸取155μl上清，丢弃；

5.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

6.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

7.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

8.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

9.换10μl枪吸去剩余酒精，干燥；

(步骤4-9，管子都要放在磁力架上)；

10.在磁珠出现裂纹后，将第8管磁珠用13μlddH2O混合在一起，充分吸打混匀后(吸打至少10次)；

(磁珠干燥太久会影响DNA得率)；

11.静置2min，稍离心，置于磁力架上2min，吸取全部上清至新的管中；

12.新管再置于磁力架上5min，缓慢吸取10μl上清用于后续实验；

13.剩余上清吸2μl，Qubit测值，记录；

备注注释：实验产物与Polyd(T)和SecondPrimer相互结合片段大小差异不大，磁珠不能分开；建议割胶回收，避免产生无用数据；如果自连片段产物相较于目的产物较多，可以通过增加起始TotalRNA量来减少引物相互结合；

9)、将上述步骤8)完成的文库进行荧光定量并上机测序；

测序仪适用于Illumina的所有测序仪，由于双端的接头barcode位于oligoT的一侧，所以必须采用双端测序，一侧用于获得高质量的序列用于计算基因的表达量，一侧用于获取barcode信息；如果读长超过50bp，barcode一侧的序列还可以用于确定3’转录终止的位置；

10)、将上述步骤9)得到的数据进行分析。

由于测序数据是所有barcode信息的混合样品，首先需要对原始数据进行处理和切分。

辅助注释：根据之前设计的barcode序列和位置信息，将12000个barcode序列分成12000个单独的序列文件。

对另一侧的读序文件，需要切除前15个碱基的序列，因为使用的是随机引物结合，测序数据在这些碱基上可能存在较大的序列错误。

准备参考比对序列，获取分析物种的每个基因cdna序列以及下游1kb的序列构建一个文件。

将清理完接头和低质量序列并分好barcode的单侧序列与上述构建的参考序列比对，比对软件可以采用Tophat、Hisat、bowtie2等常见的高通量序列比对软件，或使用blast等比对序列均可。序列仅保留最佳匹配。

因为测序序列与RNA方向是相同的，过滤所有比对方向反向的序列，并计算每个基因上比对上的reads数目，最后除以每个barcode总的测序数目乘以1百万就是每个基因的表达量。

本发明提供了一种基于芯片和组织空间位置信息的空间转录组建库测序技术，是能够在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针基础上，根据芯片和样本组织相对固定且明确的空间位置，快速获取某一特定时间段，特定组织特定细胞的在某一特定状态下的基因的表达信息。其优势在于，能够保持基因所在细胞在组织中的空间结构信息，从而重建出一个剖面的所有部位细胞的大部分基因表达谱，结合多层切片可以构建出三维的单细胞尺度的表达谱信息。另外，该技术由于对RNA含量要求不高，通过控制点样精度和切割过程可避免的掺入相邻细胞的原生质组分，借助高倍显微镜和较薄的切片组织区分和标记细胞来源以及位置而无需染色，而且对细胞俘获前的表型观察有助于更好地了解单个细胞在遗传表达方面的行为，可广泛应用于生物医学研究、医学肿瘤检测、临床和药物开发以及动植物发育生物学研究。

本发明具有以下有益效果：

1)、本发明是基于组织和芯片空间位置信息的细胞转录组测序技术，利用生物微点样技术在醛基化处理的载玻片进行高精确点样或通过原位合成探针(光刻或化学合成)，制成微阵列芯片(基片上单位面积内的靶点或样片点数可个性化定制)。载玻片醛基化处理结合生物微点样技术或原位合成探针技术均已成熟，且所需材料均为生物化学领域中的常见材料，因此本发明在高密度探针的情况下可以实现对组织内的所有细胞原位所有表达基因的表达量分析，具有高通量、高精度、同时实现对空间和基因表达的定位等特点。

2)、提取建库过程简单快速。本发明的技术提取和建库过程使用磁珠法免去了传统RNA提取过程，只需将组织冷冻切片后直接置于制备好的微阵列芯片上，避免了传统提取RNA过程过造成的RNA降解或者污染，节约了操作时间，适合多领域广泛应用。也避免了单细胞提取过程以及随后扩增过程的污染和复杂操作，完整而精确的获取细胞的表达信息。

3)、本发明的技术通过观察和标记组织和芯片探针barcode(条码)的相对空间位置，来确定特定组织或细胞某一特定阶段的转录组活动，相较于对传统的RNA测序精确度和特异性均大幅提高。

4)、本发明的技术定制和修饰过的芯片接头(引物)不仅能够保证快速全面识别细胞释放的mRNA并反转录，而且在引物5｀端加入5-8个碱基的条码和二代高通量测序的P7接头，为后续结合高通量测序和数据分析提供保证。

5)、反转录合成第一链cDNA后，只需加入RNA酶降解RNA，随后加入随机引物进行第二链cDNA合成，然后高温解链，吸取液体纯化后经PCR扩增便可上机测序，整个反应过程仅在芯片上完成，提高了工作效率。

6)、通过细胞芯片上探针和组织细胞相对的位置信息，还可以摆脱其他类似方法中随机俘获的局限性，实现对极其少量细胞的完全俘获和反应前的表型观察，以更好地理解和验证单个细胞的异质性。

综上所述，本发明不仅能有效实现少量细胞中获取足够的RNA样品，避免测序结果的“均一”或者“整体”表征，可以根据细胞异质性分辨组织中不同表型的细胞转录本信息的差异性，挖掘低丰度的转录本信息，从而为生物医药农学领域提供更精确和特定性高的转录本信息。

本发明的发明点(技术改进点)主要为(不仅仅如下)：

1.同时结合了平面芯片可以保留原始RNA来源位置的特点和RNA-seq测序的大规模高通量优势，首次实现对一个组织剖面所有细胞超高通量的RNA建库和测序。

2.利用序列标签，可以在单一平面内一次性实现超过1万2千个文库的构建，并可通过序列标签对样本进行后续区分和重新定位回原始细胞位置。

3.由于DNA芯片的原位合成方向为5’到3’，使得硅基寡核苷酸芯片探针无法直接用于RNA的反转录延伸。为此，本发明设计的芯片探针部分主要用于特异性序列标签的定位，通过后续加入的反向引物和随机引物与芯片上的序列标签进行互补结合，并通过连接酶连接后再与RNA的polyA序列互补结合进行反转录，反转录结束后通过加热解链使得后加入和反转录合成的片段从芯片上洗脱。通过这种方式使得原芯片的序列标签探针可以重复使用，使得成本大幅下降。

本发明的新技术方法与传统标准方法相比，所需的RNA量少，用量可低至不到5ng(10亿分之五克)，仅为常规测序方法的100分之一到200分之一。本发明建立的方法和技术通过硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针和样本组织细胞相对的位置信息，可以更准确检测任意物种特定组织的特定细胞的特定发育状态下大部分基因的转录活动，还可以摆脱其他类似方法中随机俘获的局限性，通过多个细胞较低深度的转录组测序，可以获取比同等成本下单个细胞高深度测序更重要的细胞异质性信息。这项技术通过优化，将能快速、高效地识别医院和其他医疗场所中的病例切片样本的转录组信息，具有很大的应用潜力，而且这种技术的一个显著特点在于从样本制备到获得测序结果，所需的时间还不到一天，可广泛应用于生物医学研究、医学肿瘤检测、传染病监控、临床和药物开发以及动植物发育生物学研究。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是本发明空间转录组测序技术路线图。

图2是本发明空间转录组测序关键技术原理示意图。

备注说明：

1.VN：

V是非T碱基；VN可以确保延伸的第一链TailedPolyd(T)14Primer结合在PolyA的5'头上，而不是结合在PolyA尾巴中。

2.NNN：

根据这三个碱基可以判断mRNA条数是否与PCR过扩增有关。

3.NNNNNN：

使随机结合在第一条反转录链上。与第一条反转录链的比例决定了最后文库长度的范围；

随机引物也会与TailedPolyd(T)14Primer结合，如果结合比例太大，PCR时大量引物会消耗在这，导致文库总量偏低。

具体实施方式

一，芯片设计及定制

使用OligoArray原位合成方式，也可以使用Affimatrix等其他公司的原位合成方法。Oligoarray芯片选择12k密度合成芯片，选择7个碱基的特征序列作为barcode标记，barcode选择时去除所有包含连续4个相同碱基的序列。相邻位点的barcode理论上至少相差4个碱基，合成后芯片上探针的总量约为200ng。

芯片合成的探针序列为：芯片锚定探针为5'-GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC。

其中序列：AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC是Illumina公司的测序通用接头序列P7的反向互补序列。

GGNNNNNNNC中的7个N代表用于区分位点信息的12000个barcode序列；由于采用原位合成的方式，其3’端是连接在芯片基片上。

为了实现与目标组织细胞mRNA的polyA末端进行互补，同时还需要在锚定探针序列上带有位置信息的barcode序列，设计了2段引物序列，分别是：第一段引物序列，5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，与上述硅基芯片寡核苷酸探针的“CAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC”部分反向互补；第二段引物序列，5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN，其中GNNNNNNNCC与上述硅基寡核苷酸芯片探针的barcode序列“GGNNNNNNNC”部分反向互补；剩余部分包括13-18个T，用于和目标组织细胞mRNA的polyA序列进行互补，末端的VN用于匹配polyA序列的末端。

所述技术采用2段引物是因为直接使用一条引物序列在退火互补结合的时候过长的引物无法精确的通过退火温度来区分相差仅有1-2个碱基的barcode序列，会导致大量的错配结合。使用2段引物的方式，第一段引物与所有的芯片探针都相同，可以使用相同的退火温度进行结合。之后的第二段引物由于和芯片探针剩余部分的结合长度仅10个碱基，其中不同barcode之间的梯度退火温度差异可以从60-15℃，可以通过逐步梯度退火实现精确的互补结合。最后使用T4连接酶将两段引物连接，为实现连接在合成第二段引物时需要在5’端进行磷酸化修饰。

因此，本发明中所使用的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；

盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于(略大于即可)硅基寡核苷酸芯片的面积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为45～55μm(即，厚度为50μm左右)的组织冷冻切片，组织冷冻切片的面积小于盖玻片的面积；且组织冷冻切片的面积≤(即，略小于或等于)硅基寡核苷酸芯片(3)上所有探针覆盖的面积(例如，1.8cmx2cm)。

二，实验操作步骤如下：

1.首先加入第一段引物，加入20nmol量的5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，退火温度为75度/70度，设定温度梯度下降从95-70度，每秒降低0.1度，使得准确配对。然后再加入第二段引物，约2ug的总量，0.1μMPolyd(T)Primer5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN，退火温度从70降到15度，每秒降低0.1度，使得准确配对，再加入2ulT4连接酶，用于连接第一段和第二段引物，维持温度15度，快速反应20min，完成后吸走多余液体。

2.组织切片制备

将组织切片放置于加有位置标记的盖玻片表面，组织切片根据组织细胞不同，厚度10～50um(原则以小于或约等于细胞厚度为准)，大小不超过1.5×1.5cm。将样品朝上的盖玻片放置于显微镜下观察组织细胞的位置，并拍照用于后续定位。

完成拍照后，在芯片表面加入10ul裂解液，使裂解液铺满探针芯片探针表面。将盖玻片覆盖在芯片上，组织样品向下直接与芯片探针接触。盖玻片大小与芯片探针部分的大小对应，用于对应定位组织的部位。

对芯片进行如下孵育，75℃---3min---65℃-0.1℃/s-40℃---取出；

注释：75℃---3min打开TotalRNA的二级结构，准备和引物结合；0.1℃/s退火使引物与模版结合更加准确；40℃根据结合区域长度设定，长度改变需调整，当oligoT数目在13-18个之间变化时，最终温度范围在37-40℃变化，OligoT增多时提高温度(例如至45℃)。

然后取走盖玻片以及覆盖在芯片表面的组织样品，并吸走所有液体，使用RNasefree水轻柔洗涤一次。

三.第一链反转录

结合引物RNA(来自上一步留在芯片上的RNA)

37℃---15min分钟孵化；

四.消化RNA(在上一步的19ul所得物中)

加入1ul酶：

RNaseA(10mg/ml)1μl

总体积20μl

95℃---10min分钟孵化；

吸取所有液体，转移到PCR管。芯片使用RNasefree水洗涤2次，并烘干可以重复使用。在PCR管里进行的反应：

加入0.5ul酶

RNaseH(60U/μl)0.5μl

总体积20.5μl

37℃---5min分钟；

备注：先RNaseA消化游离的单链RNA，同时95℃高温使杂交RNA解链，并且热打断RNA；然后RNaseH将退火结合回反转录第一链的小片段RNA降解。

五.第二链引物结合

98℃---1min分钟---80℃-0.2℃/s-25℃---30min分钟孵化；

六.第二链延伸

25℃---15min分钟；

备注：PCR仪预先设置成25℃，或者将PCR仪背景温度设为<25℃，温度太高会使第五步结合的引物脱落。

七.磁珠纯化(先配制80％无水乙醇，总体积＝0.4*(n+1)ml，n＝样品数，用于该部分的5、7步骤)：

具体如下：

1.在步骤六的40ul基础上，加水补齐至80μl，然后再加入80μlXPbeads(BeckmanCoulter,CAT.NO.A63880)(1x)(来自BeckMan)；

2.充分混匀后(吸打至少10次)，静置5min分钟；

3.稍离心，至于磁珠板上；

4.静置5min分钟或看到液体澄清，缓慢吸取上清(约155μl)，丢弃；

5.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

6.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

7.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

8.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

9.换10μl枪吸去剩余酒精，干燥；

(注意：步骤4-9，管子都要放在磁力架上)

10.在磁珠出现裂纹后，向磁珠中加入26μlddH2O，充分吸打混匀后(吸打至少10次)；

(备注：磁珠干燥太久会影响DNA得率)

11.静置2min分钟，稍离心，置于磁力架上2min分钟，吸取全部上清至新的管中；

12.新管再置于磁力架上5min分钟，缓慢吸取23μl上清用于后续实验。

13.剩余上清吸2μl，Qubit测值，记录，用于评估文库浓度和得率。

八.PCR扩增(通过PCR导入测序接头、富集有效片段)

上述步骤七获得的23ul磁珠纯化DNA23μl

IndexPrimer(15μM)1μl

序列如下：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATnnnnnnnGTGACTGGAGTTCAGACGTGT，为Illumina公司专有的P7接头序列，其中n的部分为barcode序列；

UniversalPrimer(15μM)1μl

序列如下：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC，为Illumina公司专有的P5接头序列；

2×PhusionHi-FiPCRMix(NEBm0530)25μl

总体积：50μl

使用以下PCR扩增程序：

1、98℃30s

2、98℃10s

3、65℃30s12-23Cycle

4、72℃30s

扩增程序2-4步进行12-23个循环，起始组织总RNA低于500ng，循环数选择20以上，总RNA量超过1ug，循环数小于15个。

5、72℃5min分钟

6、4℃保存

九.磁珠纯化(先配制80％无水乙醇，总体积＝0.4*(n+1)ml，n＝样品数)，此处也可以采用割胶回收。

1.加水补齐至80μl，加入80μlXPbeads(BeckmanCoulter,CAT.NO.A63880)(1x)；

2.充分混匀后(吸打至少10次)，静置5min分钟；

3.稍离心，至于磁珠板上；

4.静置5min分钟或看到液体澄清，缓慢吸取155μl上清，丢弃；

5.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

6.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

7.加入200μl现配的80％无水乙醇，静置30s；

8.缓慢吸打2次后，吸取198μl上清，丢弃；

9.换10μl枪吸去剩余酒精，干燥；

(步骤4-9，管子都要放在磁力架上)；

10.在磁珠出现裂纹后，将第8管磁珠用13μlddH₂O混合在一起，充分吸打混匀后(吸打至少10次)；

(磁珠干燥太久会影响DNA得率)；

11.静置2min分钟，稍离心，置于磁力架上2min分钟，吸取全部上清至新的管中；

12.新管再置于磁力架上5min分钟，缓慢吸取10μl上清用于后续实验。

13.剩余上清吸2μl，Qubit测值，记录。

十.对完成的文库进行荧光定量并上机测序

测序仪适用于Illumina的所有测序仪，由于双端的接头barcode位于oligoT的一侧，所以必须采用双端测序，一侧用于获得高质量的序列用于计算基因的表达量，一侧用于获取barcode信息。如果读长超过50bp，barcode一侧的序列还可以用于确定3’转录终止的位置。十一.测序数据处理

由于测序数据是所有barcode信息的混合样品，首先需要对原始数据进行处理和切分。

根据之前设计的barcode序列和位置信息，将12000个barcode序列分成12000个单独的序列文件。

对另一侧的读序文件，需要切除前15个碱基的序列，因为使用的是随机引物结合，测序数据在这些碱基上可能存在较大的序列错误。

准备参考比对序列，获取分析物种的每个基因cdna序列以及下游1kb的序列构建一个文件。

将清理完接头和低质量序列并分好barcode的单侧序列与上述构建的参考序列比对，比对软件可以采用Tophat、Hisat、bowtie2等常见的高通量序列比对软件，或使用blast等比对序列均可，序列仅保留最佳匹配。

因为测序序列与RNA方向是相同的，过滤所有比对方向反向的序列，并计算每个基因上比对上的reads数目，最后除以每个barcode总的测序数目乘以1百万就是每个基因的表达量。

以上分析步骤十～步骤十一属于测序数据常规技术。

本发明的技术方法一方面能够快速简便的获得极细小组织细胞的全基因表达，又能保留每个组织细胞在原生物体中的相互位置信息，一次性可同时构建一个组织剖面的所有细胞的表达文库。与通过显微切割或流式细胞荧光分离获得单细胞后扩增建库测序相比，其优势是全方位和多层次的，在实现高通量的同时，无需首先进行单细胞扩增步骤，大大减少了污染和偏向性。最为关键的是本办法保留了细胞在组织中的原始位置信息，对于组织器官发育、生理变化、肿瘤异质性研究和微生物与寄主互作研究具有革命性的意义。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。包括不限于改变芯片探针的点样和原位合成方式，测序接头以及不同的测序仪以及增加或改变芯片探针密度等。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，其特征是：包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探针；

所述盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于硅基寡核苷酸芯片的面积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um的组织冷冻切片，所述组织冷冻切片的面积小于盖玻片的面积；且组织冷冻切片的面积≤硅基寡核苷酸芯片上所有探针覆盖的面积。

2.根据权利要求1所述的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，其特征是：所述硅基寡核苷酸芯片的锚定探针为5'-GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACC。

3.根据权利要求2所述的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置，其特征是：包括如下2段引物：

第一段引物：5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

第二段引物：5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN。

4.利用如权利要求1～3中任意一种装置进行的空间转录组测序技术方法，其特征是包括以下步骤：

1)、首先加入第一段引物，第一段引物为5'-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，退火温度为75度/70度；

然后再加入第二段引物，第二段引物为5'PHO-GNNNNNNNCCT(13-18)VN，退火温度从70降到15度；

再加入T4连接酶，用于连接第一段和第二段引物，维持温度15度，反应20min，反应完成后吸走多余液体；

2)、将组织切片放置于盖玻片表面，组织切片的厚度为10～50um，大小不超过1.5×1.5cm；将样品朝上的盖玻片放置于显微镜下观察组织细胞的位置，并拍照用于后续定位；

完成拍照后，在芯片表面加入裂解液，从而使裂解液铺满探针芯片探针表面；将盖玻片覆盖在芯片上，组织样品向下直接与芯片探针接触；

对芯片进行如下孵育，75℃---3min---65℃-0.1℃/s-(37～45)℃---取出；

3)、在上述步骤2)完成后，在芯片上完成第一链反转录，然后消化RNA；

4)、在上述3)步骤结束后的消化体系里，进行第二链引物的结合；

5)、将上述步骤4)孵化后的反应液里，接着进行第二链条延伸反应；

6)、将上述步骤5)反应完后，对产物进行磁珠纯化；

7)、进行PCR扩增；

8)、对PCR产物再进行磁珠纯化；

9)、将上述步骤8)完成的文库进行荧光定量并上机测序；

10)、将上述步骤9)得到的数据进行分析。